1.本发明是有关于使用一种后生元提取物来预防和/或治疗关节炎(arthritis)与关节退化。
背景技术：
：：2.关节(joint)(例如手、足、腕、肘、膝以及踝关节)是指作用于连接两块骨并使它们彼此能相对活动的一接合处(junction)，会受到年龄、饮食、免疫以及代谢能力等因素的影响而退化。在关节退化的过程中，关节中软骨细胞(chondrocyte)的转变生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,tgf-β)分泌量会下降，当分泌量低至无法正常调控软骨生成(chondrogenesis)时则会导致软骨受损而引起关节炎(arthritis)。关节炎通常会造成关节发炎、肿胀(swelling)、变形(deformity)、疼痛(pain)、萎缩(atrophy)以及僵硬(stiffness)。目前针对关节炎的治疗方法大多以物理复健以及药物治疗来控制软骨的受损情况与发炎情形为主，严重者甚至须通过手术来置换人工关节。因此，本
技术领域：
：的研究人员致力于开发能够有效地治疗关节炎的药物。3.益生菌(probiotics)是一群可改善肠道菌相(intestinalmicroflora)以及肠道免疫(intestinalimmunity)的微生物。益生菌已被广泛地应用于食品与保健品中，目前常用的益生菌包括：乳杆菌属(lactobacillus)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)、乳球菌属(lactococcus)、肠球菌属(enterococcus)、酵母菌属(saccharomyces)、链球菌属(streptococcus)等。4.尽管益生菌对人体或动物的健康具有上述益处，但是益生菌在口服后会容易遭受到胃酸的破坏，而导致其无法在肠道发挥预期的功效。另外，益生菌是一种活的微生物食品成分(livemicrobialfoodingredient)，因此由益生菌所制成的食品与保健品也存在有不易保存的问题。5.近年来的研究发现，灭活的益生菌(non-viableprobiotics)以及益生菌的溶胞产物(lysate)、提取产物或分离部分[被称为后生元(postbiotics)]具有相近于益生菌的功效，并且相较于益生菌具有更高的胃酸耐受性且更易于保存。后生元的功效被认为是来自于益生菌的细胞壁成分，其主要含有肽聚糖(peptidoglycan)、磷壁酸(teichoicacid)、脂磷壁酸(lipoteichoicacid)、多糖类(polysaccharide)以及蛋白质(protein)等成分。目前已有许多方法可供用于从益生菌的细胞壁中提取出后生元，但是这些方法普遍存在有提取效率不佳的问题。因此，本领域中仍然存在有一需要去发展能有效地提取出后生元的方法以满足产业界所需。[0006]经研究，申请人意外地发现：依据本发明方法所制得的后生元提取物能够有效地促进人类软骨细胞增生以及分泌抗发炎激素，而被预期能够应用于预防和/或治疗关节炎与关节退化。技术实现要素：[0007]于是，本发明提供一种后生元提取物(postbioticsextract)供应用于制备一用来预防和/或治疗关节炎(arthritis)的组合物的用途，其中，该后生元提取物是通过一包含下列步骤的方法而被制得：[0008]提供一第一物质以及一第二物质，其中该第一物质具有一范围落在ph1至ph6内的第一等电点(firstisoelectricpoint)，该第二物质具有一范围落在ph4至ph8内且高于该第一等电点的第二等电点(secondisoelectricpoint)，该第二等电点与该第一等电点具有一落在0.5至3间的ph差值；[0009]令该第一物质以及一益生菌混合于具有一高于该第二等电点的ph值的水中，而得到一混合物；将该第二物质添加至该混合物中，继而调整该混合物的ph值，而使得该混合物的ph值落在该第一等电点与该第二等电点间，而使得沉淀物被形成；以及[0010]将该沉淀物拿来进行一细胞壁分离提取处理(cellwallisolationandextractiontreatment)，借此而得到该后生元提取物。[0011]较佳地，该第一物质是选自于由下列所构成的群组：脱脂乳粉、酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、鸡蛋蛋白、米蛋白、水解蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、大麦蛋白、支链氨基酸、明胶、胶原蛋白、氨基酸、壳聚糖、壳寡糖以及它们的组合。[0012]较佳地，该第二物质是选自于由下列所构成的群组：海藻酸钠、洋菜胶、鹿角菜胶、果胶、阿拉伯胶、三仙胶、刺槐豆胶、淀粉、海藻糖、糊精、糖浆、关华豆胶、魔芋精粉、植物纤维、合成纤维、半合成纤维以及它们的组合。[0013]较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组：芽孢杆菌属物种、链球菌属物种、乳球菌属物种、营养缺陷菌属物种、气球菌属物种、肉食杆菌属物种、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、肠膜明串珠菌属物种、酒球菌属物种、小球菌属物种、四联球菌属物种、徘徊球菌属物种、魏斯氏菌属物种、双叉杆菌属物种、酵母菌属物种、克鲁维酵母菌属物种、葡萄球菌属物种、片球菌属物种、丙酸杆菌属物种以及它们的组合。[0014]较佳地，该组合物进一步包含有一选自于由下列所构成的群组中的保健物质：透明质酸、透明质酸钠、维生素c、葡萄糖胺、软骨素、第一型胶原蛋白、第二型胶原蛋白、第三型胶原蛋白、鱼皮鱼鳞胶原蛋白、非变性第二型胶原蛋白、猪胶原蛋白、牛胶原蛋白、唾液酸、蛋壳膜以及它们的组合。[0015]本发明的有益效果在于：本发明的方法能够有效地从益生菌细胞壁中提取出后生元，且所制得的后生元提取物包含有较多含蛋白质的细胞组分，并且在促进软骨细胞增生以及分泌抗发炎激素上具有优异的效用。因此，依据本发明的方法所得到的后生元提取物能够应用于预防和/或治疗关节炎与关节退化。附图说明[0016]下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：[0017]图1是一电泳胶片图，显示本发明的后生元提取物与现有的后生元提取物的蛋白质电泳分析结果。具体实施方式[0018]为了这本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有一对应的意义。[0019]除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。一本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。[0020]在本发明中，申请人通过实验而发现：本发明的方法能够有效地从益生菌细胞壁中提取出后生元(postbiotics)，且所制得的后生元提取物包含有较多含蛋白质的细胞组分。此外，该后生元提取物具有促进人类软骨细胞增生以及分泌转变生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,tgf-β)的效用，因而被预期能够用来预防和/或治疗关节炎(arthritis)与关节退化(jointdegeneration)。[0021]于是，本发明提供一种后生元提取物供应用于制备一用来预防和/或治疗关节炎的组合物的用途，其中，该后生元提取物是通过一包含下列步骤的方法而被制得：[0022]提供一第一物质以及一第二物质，其中该第一物质具有一范围落在ph1至ph6内的第一等电点，该第二物质具有一范围落在ph4至ph8内且高于该第一等电点的第二等电点，该第二等电点与该第一等电点具有一落在0.5至3间的ph差值；[0023]令该第一物质以及一益生菌混合于具有一高于该第二等电点的ph值的水中，而得到一混合物；[0024]将该第二物质添加至该混合物中，继而调整该混合物的ph值，而使得该混合物的ph值落在该第一等电点与该第二等电点间，而使得沉淀物被形成；以及[0025]将该沉淀物拿来进行一细胞壁分离提取处理，借此而得到该后生元提取物。[0026]如本文中所使用的，术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”关节炎意指一个体在还没有被诊断具有关节炎时，消除(eliminate)或减少(reduce)关节炎的发生率(incidence)，以及减缓(slow)、延迟(delay)、控制(control)或减少(decrease)关节炎的可能性(likelihood)或机率(probability)。[0027]如本文中所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”关节炎意指关节炎的严重性(severity)或关节炎的症状(symptom)被减少(reduced)，或是关节炎被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。[0028]依据本发明，关节炎的实例包括，但不限于：退化性关节炎(degenerativearthritis)[也称为骨关节炎(osteoarthritis)]、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、代谢性关节炎(metabolicarthritis)[也称为痛风(gout)]，以及败血性关节炎(septicarthritis)[也称为感染性关节炎(infectiousarthritis)]。[0029]依据本发明，该益生菌是选自于由下列所构成的群组：芽孢杆菌属物种(bacillusspp.)、链球菌属物种(streptococcusspp.)、乳球菌属物种(lactococcusspp.)、营养缺陷菌属物种(abiotrophiaspp.)、气球菌属物种(aerococcusspp.)、肉食杆菌属物种(carnobacteriumspp.)、肠球菌属物种(enterococcusspp.)、乳杆菌属物种(lactobacillusspp.)、肠膜明串珠菌属物种(leuconostocspp.)、酒球菌属物种(oenococcusspp.)、小球菌属物种(pediococcusspp.)、四联球菌属物种(tetragenococcusspp.)、徘徊球菌属物种(vagococcusspp.)、魏斯氏菌属物种(weissellaspp.)、双歧杆菌属物种(bifidobacteriumspp.)、酵母菌属物种(saccharomycesspp.)、克鲁维酵母菌属物种(kluyveromycesspp.)、葡萄球菌属物种(staphylococcusspp.)、片球菌属物种(pediococcusspp.)、丙酸杆菌属物种(propionibacteriumspp.)以及它们的组合。[0030]较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组中的乳杆菌属物种：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)以及它们的组合。[0031]较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组中的双歧杆菌属物种：两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)以及它们的组合。[0032]较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组中的芽孢杆菌属物种：凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)以及它们的组合。[0033]依据本发明，该益生菌可以是活菌或死菌、经浓缩的(concentrated)或未经浓缩的(non-concentrated)、液态(liquid)、糊状(paste)、半固态(semi-solid)，或固态(solid)[例如，丸(pellet)、细颗粒(granule)或粉末(powder)]，并且可以是经热灭活的(heat-inactivated)、经冷冻的(frozen)、经干燥的(dried)，或经冷冻-干燥的(freeze-dried)[例如，可呈冷冻干燥形式或喷雾/流化床干燥(spray/fluidbeddried)形式]。在本发明的一个较佳具体例中，该益生菌是经热灭活并呈经喷雾干燥的粉末形式。[0034]依据本发明，该益生菌的热灭活可以通过在60-140℃下加热历时1秒钟至30分钟来进行。在本发明的一个较佳具体例中，该益生菌的热灭活是在73±2℃下加热历时15秒来进行。[0035]依据本发明，该第一物质是选自于由下列所构成的群组：脱脂乳粉(nonfatdrymilk)、酪蛋白(casein)、乳清蛋白(wheyprotein)、大豆蛋白(soybeanprotein)、豌豆蛋白(peaprotein)、鸡蛋蛋白(eggprotein)、米蛋白(riceprotein)、水解蛋白(hydrolyzedprotein)、玉米蛋白(cornprotein)、小麦蛋白(wheatprotein)、大麦蛋白(barleyprotein)、支链氨基酸(branchedchainaminoacid)、明胶(gelatin)、胶原蛋白(collagen)、氨基酸(aminoacid)、几丁聚糖(chitosan)、几丁质(chitin)以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该第一物质是乳清蛋白。[0036]依据本发明，该第二物质是选自于由下列所构成的群组：海藻酸钠(sodiumalginate)、洋菜胶(agar)、鹿角菜胶(carrageenan)、果胶(pectin)、阿拉伯胶(arabicgum)、三仙胶(xanthangum)、刺槐豆胶(locustbeangum)、淀粉(starch)[例如修饰淀粉(modifiedstarch)]、海藻糖(fucose)、糊精(dextrin)[例如抗性糊精(resistantmaltodextrin)]、糖浆(syrup)、关华豆胶(guargum)、魔芋精粉(konjacpowder)、植物纤维(vegetablefiber)、合成纤维(syntheticfiber)、半合成纤维(semi-syntheticfiber)以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该第二物质是糊精。[0037]在本发明的一个较佳具体例中，该第二等电点与该第一等电点具有一为0.8的ph差值。[0038]依据本发明，该沉淀物可通过一选自于由下列所构成的群组中的固液分离(solid-liquidseparation)处理来进行收取：离心、过滤、重力沉降(gravitysettling)以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该固液分离处理是过滤。[0039]如本文中所使用的，术语“细胞壁分离提取(cellwallisolationandextraction)”与“细胞壁萃取(cellwallextraction)”可被交换地使用，并且意指从细胞壁的组成部分中分离出(separated)原本存在于其上的一细胞壁组分(cellwallcomponent)或一微生物代谢物(microbialmetabolite)。[0040]依据本发明，细胞壁分离提取的操作过程与条件可以采用本领域技术人员所详知且惯用的技术来进行，例如，酸醇法(acidalcoholmethod)。在此方面，可以参考，例如，pei-juntianetal.(2015),int.j.mol.sci.,16(8):20033–20049。[0041]依据本发明，该组合物可进一步包含有任何已知有利于关节的保健物质(healthcarematerial)，这包括，但不限于：透明质酸(hyaluronicacid)、透明质酸钠(sodiumhyaluronate)、维生素c(vitaminc)、葡萄糖胺(glucosamine)、软骨素(chondroitin)、第一型胶原蛋白(typeicollagen)、第二型胶原蛋白(typeiicollagen)、第三型胶原蛋白(typeiiicollagen)、鱼皮鱼鳞胶原蛋白(fishskinandfishscalecollagen)、非变性第二型胶原蛋白(undenaturedtypeiicollagen)、猪胶原蛋白(porcinecollagen)、牛胶原蛋白(bovinecollagen)、唾液酸(sialicacid)以及蛋壳膜(eggshellmembrane)。[0042]依据本发明，该组合物可以是药学组合物(pharmaceuticalcomposition)或食物组合物(foodcomposition)，并且在形式上没有特别的限制，所以该组合物能够以一制剂的形式来被使用，诸如，无菌的粉末(asepticpowder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)、凝胶(jelly)等等，这些能够通过公众所熟知的方法而被适当地制备。[0043]依据本发明，当该组合物是药学组合物，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道给药(parenteraladministration)、口服给药(oraladministration)或局部给药(topicaladministration)的剂型(dosageform)。[0044]依据本发明，该药学组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、充填剂(filler)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。[0045]依据本发明，当该组合物是食物组合物，该食物组合物可使用一具有本领域普通技术人员所熟知的标准技术而被添加至一可食性材料(ediblematerial)中，例如，它可直接地被添加至可食性材料内，或者它可被用于制备一中间组合物(intermediatecomposition)[诸如，食品添加物(foodadditive)或预混料(premix)]，该中间组合物随后被添加至可食性材料内。[0046]依据本发明，该食品产品的种类包括，但不限于：发酵食品(fermentedfood)、加工食品(processedfood)、健康食品(healthfoods)以及膳食补充品(dietarysupplements)。[0047]依据本发明，该食品产品可进一步包含有一被广泛地使用于食品制造技术的食品添加物，这包括，但不限于：淀粉(starch)、糊精(dextrin)、乳糖(lactose)、玉米粉(maizeflour)、米面粉(riceflour)、磷酸三钙(tricalciumphosphate)、二氧化硅(silicondioxide)、硬脂酸镁(magnesiumstearate)、碳酸钙(calciumcarbonate)、葡萄糖、蔗糖(sucrose)、果糖(fructose)、糖醇(sugaralcohol)、寡糖(oligosaccharide)、代糖(sugarsubstitute)、果汁粉(fruitjuicepowder)、酵母粉(yeastpowder)、脱脂乳粉(nonfatdrymilk)、酪蛋白(casein)、乳清蛋白(wheyprotein)、氨基酸(aminoacid)、柠檬酸(citricacid)、柠檬酸盐(citrate)、乳酸(lacticacid)、乳酸盐(lactate)以及核苷酸(nucleotide)。[0048]本发明也提供一种预防和/或治疗关节炎的方法，其包括对一有此需要的个体给药以如上所述的后生元提取物。[0049]依据本发明，该后生元提取物的给药剂量与给药次数会视下列因素而变化：要被治疗的疾病的严重性，给药途径，以及要被治疗的个体的年龄、身体状况与反应。一般而言，该后生元提取物可呈单一剂量或是分成数个剂量的形式而被口服地、非经肠地道或局部地给药。[0050]本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。[0051]《实施例》[0052]一般实验材料：[0053]1.在下面的实施例中所使用的益生菌菌株是得自于中兴大学食品暨应用生物科技学系(departmentoffoodscienceandbiotechnologyatnationalchunghsinguniversity)的微生物研究室，并且已被整合于下面的表1中。[0054]表1.各个益生菌菌株time,htst)(73±2℃，15秒)来对各个培养物进行热灭活。[0065]接着，经热灭活的各个培养物在25℃下以10,000rpm进行离心历时15分钟，继而倒除上清液，所得到的沉淀物(pellets)被拿来进行喷雾干燥，借此而得到各个菌株的干燥菌粉。[0066]各个干燥菌粉是分别依照下面所示的步骤来进行一前处理：首先，将适量的等电点(isoelectricpoint)为ph4.4的乳清蛋白(wheyprotein)(厂牌为nzmp，货号为wpc80)溶解于水中，以配制成浓度为10％(w/v,g/l)的乳清蛋白溶液，继而以食品级碳酸钠来将该溶液的ph值调整至7.5。在持续搅拌下，将适量的干燥菌粉散浮于该溶液中至最终浓度为5％(w/v,g/l)，接着，缓慢地加入适量的等电点为ph5.2的糊精(dextrin)(厂牌为zhuchengdongxiao，货号为maltodextrinde8-10)至浓度为6％(w/v,g/l)，同时缓慢地加入乳酸来将该溶液的ph值调整至约为4.8，当ph为4.8时，乳清蛋白以及糊精会达到电荷中和(chargeneutralization)而析出。之后，持续搅拌直到沉淀物不再增加为止。之后，使用一孔径为25μm的滤纸来进行过滤以分离并收取沉淀物，继而将所得到的沉淀物拿来进行喷雾干燥，借此而得到经前处理的菌粉。[0067]各个菌株的经前处理的菌粉分别被拿来进行细胞壁分离提取(cellwallisolationandextraction)，其大体上是参考pei-juntianetal.(2015),int.j.mol.sci.,16(8):20033–20049当中所述的方法来进行，并略作修改。简单地说，秤取50mg的经前处理的菌粉，继而加入1ml的10％乳酸(lacticacid)并于80℃的水浴槽中加热历时60分钟。之后，于10,000g下进行离心历时15分钟，然后移除上清液并加入1ml的混合溶剂[含有4：10(v/v)的0.5m柠檬酸盐溶液(citratesolution)以及乙醇，ph值为4.6]，继而静置隔夜。之后，于10,000g下进行离心历时20分钟，然后移除上清液并使用95％乙醇来清洗所形成的沉淀物数次，接着置于80℃的干浴槽中加热历时约40分钟以将乙醇完全移除，借此而得到本发明的后生元提取物。[0068]另外，各个菌株的未经前处理的菌粉也被拿来进行相同的细胞壁分离提取处理以获得后生元提取物(下称现有的后生元提取物)。[0069]实施例2.本发明的后生元提取物的成份分析[0070]依据上面实施例1所得到的现有的后生元提取物以及本发明的后生元提取物被拿来进行下面的提取率的测定(determinationofextractionrate)、蛋白质含量的测定(determinationofproteincontent)以及蛋白质电泳分析(proteinelectrophoresisanalysis)。[0071]实验方法：[0072]a.提取率的测定：[0073]提取率是通过将上面实施例1中所得到的后生元提取物的重量代入下列公式(i)中而被计算出：[0074]公式(i)：a＝b/50×100％[0075]其中，a＝提取率(％)[0076]b＝后生元提取物的重量(mg)[0077]b.蛋白质含量的测定：[0078]蛋白质含量的测定是通过将上面实施例1中所得到的后生元提取物溶解于磷酸缓冲溶液(含有8g/l的nacl、0.2g/l的kcl、1.44g/l的na2hpo4以及0.24g/l的kh2po4，ph值为6.2)中并且依据制造商的操作指南使用piercetmbca蛋白质分析试剂盒(piercetmbcaproteinassaykit)(厂牌为thermoscientific，货号为23225)来进行。[0079]c.蛋白质电泳分析：[0080]对上面实施例1中所得到的后生元提取物各取1g并分别溶解于20ml的水中，接着使用bio-rad电泳系统并采用本领域技术人员所详知且惯用的技术来进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)分析。[0081]结果：[0082]a.提取率的测定：[0083]下面表2显示依据本发明的含前处理的方法的提取率以及不含前处理的现有方法所具者。[0084]表2.依据本发明的方法与现有方法的提取率[0085][0086]从表2可见，相较于现有方法，依据本发明的方法，将经前处理的菌粉拿来进行细胞壁分离提取可以获得较高的后生元提取物的提取率。[0087]b.蛋白质含量的测定：[0088]下面表3显示依据本发明的方法与现有方法所得到的后生元提取物的蛋白质含量。[0089]表3.依据本发明的方法与现有方法所得到的后生元提取物的蛋白质含量[0090][0091]从表3可见，本发明的后生元提取物中的蛋白质含量是明显高于现有的后生元提取物中的蛋白质含量。[0092]c.蛋白质电泳分析：[0093]图1是一电泳胶片图，它显示本发明的后生元提取物与现有的后生元提取物的蛋白质电泳分析结果。从图1可见，本发明的后生元提取物的蛋白质带(proteinband)是明显多于现有的后生元提取物的蛋白质带。申请人据此而认为，依据本发明的方法所得到的后生元提取物含有较多的细胞壁成分，例如肽聚糖(peptidoglycan)、脂壁酸(lipoteichoicacid)、磷壁酸(teichoicacid)、糖蛋白(glycoprotein)以及蛋白聚糖(proteoglycan)等。[0094]综合以上的实验结果可发现，本发明的方法能够有效地从益生菌的细胞壁中提取出后生元提取物，并且由此所得到的后生元提取物含有较多的细胞壁蛋白质(cellwallprotein)。[0095]实施例3.本发明的后生元提取物在治疗关节炎(arthritis)上的效用评估[0096]在本实施例中，依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物与现有的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别被拿来处理sw1353细胞，并通过测量经处理后的sw1353细胞的tgf-β分泌量以及细胞增生数量来评估本发明的后生元提取物在治疗关节炎上的效用。另外，申请人进一步评估本发明的后生元提取物与已知能应用于关节保健的市售保健物质的组合使用对于此效用的影响。[0097]实验材料：[0098]1.在本实施例中所使用的保健物质是购自于创百股份有限公司(chambioco.,ltd.)。有关所述保健物质的种类及其商品名已被整合于下面的表4中。[0099]表4.各个保健物质的种类及其商品名[0100][0101]实验方法：[0102]a.后生元提取物对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的影响：[0103]首先，将依据上面“一般实验材料”的第2项来进行继代培养的sw1353细胞分成25组，其中包括1个对照组、12个比较实验组(也就是比较实验组l-1至l-6以及比较实验组b-1至b-6)以及12个实验组(也就是实验组l-1至l-6以及实验组b-1至b-6)。将各组的sw1353细胞以一为1×104细胞/孔的数量分别培养于含有200μl的dmem培养基的96-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％co2)中进行培养历时24小时。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，并依据下面表5所示者，将依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物与现有的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别添加至各组中。[0104]表5.各组培养物所具有的后生元提取物的最终浓度[0105][0106]各组培养物在37℃的条件下培养历时24小时后，依照上面“一般实验方法”的第1项「tgf-β的含量测定」当中所述的方法来测定tgf-β的含量。[0107]b.后生元提取物与其他保健物质的组合使用对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的影响：[0108]首先，将依据上面“一般实验材料”的第2项来进行继代培养的sw1353细胞分成28组，其中包括14个比较实验组(也就是1x比较实验组1至7以及2x比较实验组1至7)以及14个实验组(也就是实验组1-l至7-l以及实验组1-b至7-b)。将各组的sw1353细胞以一为1×104细胞/孔的数量分别培养于含有200μl的dmem培养基的96-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％co2)中进行培养历时24小时。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，并依据下面表6所示者，将上面“实验材料”的第1项中的7种保健物质以及依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别添加至各组中。[0109]表6.各组培养物所具有的后生元提取物或保健物质的最终浓度[0110][0111]各组培养物在37℃的条件下培养历时24小时后，依照上面“一般实验方法”的第1项「tgf-β的含量测定」当中所述的方法来测定tgf-β的含量。[0112]c.后生元提取物对于sw1353细胞的细胞增生(proliferation)的影响：[0113]首先，将依据上面“一般实验材料”的第2项来进行继代培养的sw1353细胞分成3组，其中包括1个对照组以及2个实验组(也就是实验组l以及实验组b)。将各组的sw1353细胞以一为1×104细胞/孔的数量分别培养于含有200μl的dmem培养基的96-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％co2)中进行培养历时24小时。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，并依据下面表7所示者，将依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别添加至各组中。[0114]表7.各组培养物所具有的后生元提取物的最终浓度[0115][0116]各组培养物在37℃的条件下培养历时24小时后，计数各孔中的sw1353细胞的细胞数。[0117]d.后生元提取物与其他保健物质的组合使用对于sw1353细胞的细胞增生的影响：[0118]首先，将依据上面“一般实验材料”的第2项来进行继代培养的sw1353细胞分成28组，其中包括14个比较实验组(也就是1x比较实验组1至7以及2x比较实验组1至7)以及14个实验组(也就是实验组1-l至7-l以及实验组1-b至7-b)。将各组的sw1353细胞以一为1×104细胞/孔的数量分别培养于含有200μl的dmem培养基的96-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％co2)中进行培养历时24小时。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，并依据上面表6所示者，将上面“实验材料”的第1项中的7种保健物质以及依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别添加至各组中。[0119]各组培养物在37℃的条件下培养历时24小时后，计数各孔中的sw1353细胞的细胞数，然后计算出相对于对应的1x比较实验组所具者的倍数。[0120]结果：[0121]a.后生元提取物对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的影响：[0122]下面表8显示各组培养物所测得的tgf-β含量。[0123]表8.各组培养物的tgf-β含量[0124][0125]从表8可见，本发明的植物乳杆菌的后生元提取物对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的促进效用是明显优于现有的植物乳杆菌的后生元提取物对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的促进效用。此外，本发明的长双歧杆菌的后生元提取物也展现类似的优异效用。这个实验结果显示：依据本发明的方法所得到的后生元提取物能有效地促进sw1353细胞分泌tgf-β。[0126]b.后生元提取物与其他保健物质的组合使用对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的影响：[0127]下面表9显示各组培养物的tgf-β含量。[0128]表9.各组培养物的tgf-β含量[0129][0130]从表9可见，各个实验组的tgf-β含量皆是明显高于对应的1x比较实验组与2x比较实验组的tgf-β含量。特别地，各个实验组相较于对应的1x比较实验组的提高幅度是显著高于2x比较实验组相较于对应的1x比较实验组的提高幅度，这表示：使用本发明的后生元提取物来替代等量的保健物质能够大幅提升保健物质在促进sw1353细胞分泌tgf-β上的效用。[0131]c.后生元提取物对于sw1353细胞的细胞增生的影响：[0132]下面表10显示各组培养物中的细胞数。[0133]表10.各组培养物中的细胞数[0134]组别细胞数(个)对照组1.1×104实验组l2.0×104实验组b2.2×104[0135]从表10可见，实验组l与b的细胞数皆是明显高于对照组所具者。这个实验结果显示：本发明的后生元提取物可以促进sw1353细胞的细胞增生。[0136]d.后生元提取物与其他保健物质的组合使用对于sw1353细胞的细胞增生的影响：[0137]下面表11显示各组培养物中的细胞增生情形(相对于对应的1x比较实验组所具者的倍数)。[0138]表11.各组培养物中的细胞增生情形[0139]组别倍数*组别倍数*1x比较实验组11.01x比较实验组51.02x比较实验组11.12x比较实验组51.1实验组1-l1.2实验组5-l1.2实验组1-b1.2实验组5-b1.21x比较实验组21.01x比较实验组61.02x比较实验组21.02x比较实验组61.1实验组2-l1.4实验组6-l1.2实验组2-b1.4实验组6-b1.21x比较实验组31.01x比较实验组71.02x比较实验组31.12x比较实验组71.1实验组3-l1.2实验组7-l1.2实验组3-b1.2实验组7-b1.21x比较实验组41.0ꢀꢀ2x比较实验组41.1ꢀꢀ实验组4-l1.2ꢀꢀ实验组4-b1.2ꢀꢀ[0140]*：各组的细胞数相对于对应的1x比较实验组所具者的倍数。[0141]从表11可见，各个实验组的细胞增生情形是明显优于对应的1x比较实验组与2x比较实验组的细胞增生情形。特别地，各个实验组相较于对应的1x比较实验组的增生幅度是显著高于2x比较实验组相较于对应的1x比较实验组的增生幅度，这表示：使用本发明的后生元提取物来替代等量的保健物质能够大幅提升保健物质在促进sw1353细胞的细胞增生上的效用。[0142]综合以上各项实验结果可知，本发明的方法能够有效地从益生菌细胞壁中提取出后生元，且所制得的后生元提取物包含有较多含蛋白质的细胞组分，并且在促进软骨细胞增生以及分泌抗发炎激素上具有优异的效用。因此，申请人认为：依据本发明的方法所得到的后生元提取物能够应用于预防和/或治疗关节炎与关节退化。[0143]于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。[0144]虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求所示者的限制。当前第1页12当前第1页12
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：：2.关节(joint)(例如手、足、腕、肘、膝以及踝关节)是指作用于连接两块骨并使它们彼此能相对活动的一接合处(junction)，会受到年龄、饮食、免疫以及代谢能力等因素的影响而退化。在关节退化的过程中，关节中软骨细胞(chondrocyte)的转变生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,tgf-β)分泌量会下降，当分泌量低至无法正常调控软骨生成(chondrogenesis)时则会导致软骨受损而引起关节炎(arthritis)。关节炎通常会造成关节发炎、肿胀(swelling)、变形(deformity)、疼痛(pain)、萎缩(atrophy)以及僵硬(stiffness)。目前针对关节炎的治疗方法大多以物理复健以及药物治疗来控制软骨的受损情况与发炎情形为主，严重者甚至须通过手术来置换人工关节。因此，本
技术领域：
：的研究人员致力于开发能够有效地治疗关节炎的药物。3.益生菌(probiotics)是一群可改善肠道菌相(intestinalmicroflora)以及肠道免疫(intestinalimmunity)的微生物。益生菌已被广泛地应用于食品与保健品中，目前常用的益生菌包括：乳杆菌属(lactobacillus)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)、乳球菌属(lactococcus)、肠球菌属(enterococcus)、酵母菌属(saccharomyces)、链球菌属(streptococcus)等。4.尽管益生菌对人体或动物的健康具有上述益处，但是益生菌在口服后会容易遭受到胃酸的破坏，而导致其无法在肠道发挥预期的功效。另外，益生菌是一种活的微生物食品成分(livemicrobialfoodingredient)，因此由益生菌所制成的食品与保健品也存在有不易保存的问题。5.近年来的研究发现，灭活的益生菌(non-viableprobiotics)以及益生菌的溶胞产物(lysate)、提取产物或分离部分[被称为后生元(postbiotics)]具有相近于益生菌的功效，并且相较于益生菌具有更高的胃酸耐受性且更易于保存。后生元的功效被认为是来自于益生菌的细胞壁成分，其主要含有肽聚糖(peptidoglycan)、磷壁酸(teichoicacid)、脂磷壁酸(lipoteichoicacid)、多糖类(polysaccharide)以及蛋白质(protein)等成分。目前已有许多方法可供用于从益生菌的细胞壁中提取出后生元，但是这些方法普遍存在有提取效率不佳的问题。因此，本领域中仍然存在有一需要去发展能有效地提取出后生元的方法以满足产业界所需。[0006]经研究，申请人意外地发现：依据本发明方法所制得的后生元提取物能够有效地促进人类软骨细胞增生以及分泌抗发炎激素，而被预期能够应用于预防和/或治疗关节炎与关节退化。技术实现要素：[0007]于是，本发明提供一种后生元提取物(postbioticsextract)供应用于制备一用来预防和/或治疗关节炎(arthritis)的组合物的用途，其中，该后生元提取物是通过一包含下列步骤的方法而被制得：[0008]提供一第一物质以及一第二物质，其中该第一物质具有一范围落在ph1至ph6内的第一等电点(firstisoelectricpoint)，该第二物质具有一范围落在ph4至ph8内且高于该第一等电点的第二等电点(secondisoelectricpoint)，该第二等电点与该第一等电点具有一落在0.5至3间的ph差值；[0009]令该第一物质以及一益生菌混合于具有一高于该第二等电点的ph值的水中，而得到一混合物；将该第二物质添加至该混合物中，继而调整该混合物的ph值，而使得该混合物的ph值落在该第一等电点与该第二等电点间，而使得沉淀物被形成；以及[0010]将该沉淀物拿来进行一细胞壁分离提取处理(cellwallisolationandextractiontreatment)，借此而得到该后生元提取物。[0011]较佳地，该第一物质是选自于由下列所构成的群组：脱脂乳粉、酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、鸡蛋蛋白、米蛋白、水解蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、大麦蛋白、支链氨基酸、明胶、胶原蛋白、氨基酸、壳聚糖、壳寡糖以及它们的组合。[0012]较佳地，该第二物质是选自于由下列所构成的群组：海藻酸钠、洋菜胶、鹿角菜胶、果胶、阿拉伯胶、三仙胶、刺槐豆胶、淀粉、海藻糖、糊精、糖浆、关华豆胶、魔芋精粉、植物纤维、合成纤维、半合成纤维以及它们的组合。[0013]较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组：芽孢杆菌属物种、链球菌属物种、乳球菌属物种、营养缺陷菌属物种、气球菌属物种、肉食杆菌属物种、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、肠膜明串珠菌属物种、酒球菌属物种、小球菌属物种、四联球菌属物种、徘徊球菌属物种、魏斯氏菌属物种、双叉杆菌属物种、酵母菌属物种、克鲁维酵母菌属物种、葡萄球菌属物种、片球菌属物种、丙酸杆菌属物种以及它们的组合。[0014]较佳地，该组合物进一步包含有一选自于由下列所构成的群组中的保健物质：透明质酸、透明质酸钠、维生素c、葡萄糖胺、软骨素、第一型胶原蛋白、第二型胶原蛋白、第三型胶原蛋白、鱼皮鱼鳞胶原蛋白、非变性第二型胶原蛋白、猪胶原蛋白、牛胶原蛋白、唾液酸、蛋壳膜以及它们的组合。[0015]本发明的有益效果在于：本发明的方法能够有效地从益生菌细胞壁中提取出后生元，且所制得的后生元提取物包含有较多含蛋白质的细胞组分，并且在促进软骨细胞增生以及分泌抗发炎激素上具有优异的效用。因此，依据本发明的方法所得到的后生元提取物能够应用于预防和/或治疗关节炎与关节退化。附图说明[0016]下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：[0017]图1是一电泳胶片图，显示本发明的后生元提取物与现有的后生元提取物的蛋白质电泳分析结果。具体实施方式[0018]为了这本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有一对应的意义。[0019]除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。一本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。[0020]在本发明中，申请人通过实验而发现：本发明的方法能够有效地从益生菌细胞壁中提取出后生元(postbiotics)，且所制得的后生元提取物包含有较多含蛋白质的细胞组分。此外，该后生元提取物具有促进人类软骨细胞增生以及分泌转变生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,tgf-β)的效用，因而被预期能够用来预防和/或治疗关节炎(arthritis)与关节退化(jointdegeneration)。[0021]于是，本发明提供一种后生元提取物供应用于制备一用来预防和/或治疗关节炎的组合物的用途，其中，该后生元提取物是通过一包含下列步骤的方法而被制得：[0022]提供一第一物质以及一第二物质，其中该第一物质具有一范围落在ph1至ph6内的第一等电点，该第二物质具有一范围落在ph4至ph8内且高于该第一等电点的第二等电点，该第二等电点与该第一等电点具有一落在0.5至3间的ph差值；[0023]令该第一物质以及一益生菌混合于具有一高于该第二等电点的ph值的水中，而得到一混合物；[0024]将该第二物质添加至该混合物中，继而调整该混合物的ph值，而使得该混合物的ph值落在该第一等电点与该第二等电点间，而使得沉淀物被形成；以及[0025]将该沉淀物拿来进行一细胞壁分离提取处理，借此而得到该后生元提取物。[0026]如本文中所使用的，术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”关节炎意指一个体在还没有被诊断具有关节炎时，消除(eliminate)或减少(reduce)关节炎的发生率(incidence)，以及减缓(slow)、延迟(delay)、控制(control)或减少(decrease)关节炎的可能性(likelihood)或机率(probability)。[0027]如本文中所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”关节炎意指关节炎的严重性(severity)或关节炎的症状(symptom)被减少(reduced)，或是关节炎被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。[0028]依据本发明，关节炎的实例包括，但不限于：退化性关节炎(degenerativearthritis)[也称为骨关节炎(osteoarthritis)]、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、代谢性关节炎(metabolicarthritis)[也称为痛风(gout)]，以及败血性关节炎(septicarthritis)[也称为感染性关节炎(infectiousarthritis)]。[0029]依据本发明，该益生菌是选自于由下列所构成的群组：芽孢杆菌属物种(bacillusspp.)、链球菌属物种(streptococcusspp.)、乳球菌属物种(lactococcusspp.)、营养缺陷菌属物种(abiotrophiaspp.)、气球菌属物种(aerococcusspp.)、肉食杆菌属物种(carnobacteriumspp.)、肠球菌属物种(enterococcusspp.)、乳杆菌属物种(lactobacillusspp.)、肠膜明串珠菌属物种(leuconostocspp.)、酒球菌属物种(oenococcusspp.)、小球菌属物种(pediococcusspp.)、四联球菌属物种(tetragenococcusspp.)、徘徊球菌属物种(vagococcusspp.)、魏斯氏菌属物种(weissellaspp.)、双歧杆菌属物种(bifidobacteriumspp.)、酵母菌属物种(saccharomycesspp.)、克鲁维酵母菌属物种(kluyveromycesspp.)、葡萄球菌属物种(staphylococcusspp.)、片球菌属物种(pediococcusspp.)、丙酸杆菌属物种(propionibacteriumspp.)以及它们的组合。[0030]较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组中的乳杆菌属物种：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)以及它们的组合。[0031]较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组中的双歧杆菌属物种：两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)、乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)以及它们的组合。[0032]较佳地，该益生菌是选自于由下列所构成的群组中的芽孢杆菌属物种：凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)以及它们的组合。[0033]依据本发明，该益生菌可以是活菌或死菌、经浓缩的(concentrated)或未经浓缩的(non-concentrated)、液态(liquid)、糊状(paste)、半固态(semi-solid)，或固态(solid)[例如，丸(pellet)、细颗粒(granule)或粉末(powder)]，并且可以是经热灭活的(heat-inactivated)、经冷冻的(frozen)、经干燥的(dried)，或经冷冻-干燥的(freeze-dried)[例如，可呈冷冻干燥形式或喷雾/流化床干燥(spray/fluidbeddried)形式]。在本发明的一个较佳具体例中，该益生菌是经热灭活并呈经喷雾干燥的粉末形式。[0034]依据本发明，该益生菌的热灭活可以通过在60-140℃下加热历时1秒钟至30分钟来进行。在本发明的一个较佳具体例中，该益生菌的热灭活是在73±2℃下加热历时15秒来进行。[0035]依据本发明，该第一物质是选自于由下列所构成的群组：脱脂乳粉(nonfatdrymilk)、酪蛋白(casein)、乳清蛋白(wheyprotein)、大豆蛋白(soybeanprotein)、豌豆蛋白(peaprotein)、鸡蛋蛋白(eggprotein)、米蛋白(riceprotein)、水解蛋白(hydrolyzedprotein)、玉米蛋白(cornprotein)、小麦蛋白(wheatprotein)、大麦蛋白(barleyprotein)、支链氨基酸(branchedchainaminoacid)、明胶(gelatin)、胶原蛋白(collagen)、氨基酸(aminoacid)、几丁聚糖(chitosan)、几丁质(chitin)以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该第一物质是乳清蛋白。[0036]依据本发明，该第二物质是选自于由下列所构成的群组：海藻酸钠(sodiumalginate)、洋菜胶(agar)、鹿角菜胶(carrageenan)、果胶(pectin)、阿拉伯胶(arabicgum)、三仙胶(xanthangum)、刺槐豆胶(locustbeangum)、淀粉(starch)[例如修饰淀粉(modifiedstarch)]、海藻糖(fucose)、糊精(dextrin)[例如抗性糊精(resistantmaltodextrin)]、糖浆(syrup)、关华豆胶(guargum)、魔芋精粉(konjacpowder)、植物纤维(vegetablefiber)、合成纤维(syntheticfiber)、半合成纤维(semi-syntheticfiber)以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该第二物质是糊精。[0037]在本发明的一个较佳具体例中，该第二等电点与该第一等电点具有一为0.8的ph差值。[0038]依据本发明，该沉淀物可通过一选自于由下列所构成的群组中的固液分离(solid-liquidseparation)处理来进行收取：离心、过滤、重力沉降(gravitysettling)以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该固液分离处理是过滤。[0039]如本文中所使用的，术语“细胞壁分离提取(cellwallisolationandextraction)”与“细胞壁萃取(cellwallextraction)”可被交换地使用，并且意指从细胞壁的组成部分中分离出(separated)原本存在于其上的一细胞壁组分(cellwallcomponent)或一微生物代谢物(microbialmetabolite)。[0040]依据本发明，细胞壁分离提取的操作过程与条件可以采用本领域技术人员所详知且惯用的技术来进行，例如，酸醇法(acidalcoholmethod)。在此方面，可以参考，例如，pei-juntianetal.(2015),int.j.mol.sci.,16(8):20033–20049。[0041]依据本发明，该组合物可进一步包含有任何已知有利于关节的保健物质(healthcarematerial)，这包括，但不限于：透明质酸(hyaluronicacid)、透明质酸钠(sodiumhyaluronate)、维生素c(vitaminc)、葡萄糖胺(glucosamine)、软骨素(chondroitin)、第一型胶原蛋白(typeicollagen)、第二型胶原蛋白(typeiicollagen)、第三型胶原蛋白(typeiiicollagen)、鱼皮鱼鳞胶原蛋白(fishskinandfishscalecollagen)、非变性第二型胶原蛋白(undenaturedtypeiicollagen)、猪胶原蛋白(porcinecollagen)、牛胶原蛋白(bovinecollagen)、唾液酸(sialicacid)以及蛋壳膜(eggshellmembrane)。[0042]依据本发明，该组合物可以是药学组合物(pharmaceuticalcomposition)或食物组合物(foodcomposition)，并且在形式上没有特别的限制，所以该组合物能够以一制剂的形式来被使用，诸如，无菌的粉末(asepticpowder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)、凝胶(jelly)等等，这些能够通过公众所熟知的方法而被适当地制备。[0043]依据本发明，当该组合物是药学组合物，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道给药(parenteraladministration)、口服给药(oraladministration)或局部给药(topicaladministration)的剂型(dosageform)。[0044]依据本发明，该药学组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、充填剂(filler)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。[0045]依据本发明，当该组合物是食物组合物，该食物组合物可使用一具有本领域普通技术人员所熟知的标准技术而被添加至一可食性材料(ediblematerial)中，例如，它可直接地被添加至可食性材料内，或者它可被用于制备一中间组合物(intermediatecomposition)[诸如，食品添加物(foodadditive)或预混料(premix)]，该中间组合物随后被添加至可食性材料内。[0046]依据本发明，该食品产品的种类包括，但不限于：发酵食品(fermentedfood)、加工食品(processedfood)、健康食品(healthfoods)以及膳食补充品(dietarysupplements)。[0047]依据本发明，该食品产品可进一步包含有一被广泛地使用于食品制造技术的食品添加物，这包括，但不限于：淀粉(starch)、糊精(dextrin)、乳糖(lactose)、玉米粉(maizeflour)、米面粉(riceflour)、磷酸三钙(tricalciumphosphate)、二氧化硅(silicondioxide)、硬脂酸镁(magnesiumstearate)、碳酸钙(calciumcarbonate)、葡萄糖、蔗糖(sucrose)、果糖(fructose)、糖醇(sugaralcohol)、寡糖(oligosaccharide)、代糖(sugarsubstitute)、果汁粉(fruitjuicepowder)、酵母粉(yeastpowder)、脱脂乳粉(nonfatdrymilk)、酪蛋白(casein)、乳清蛋白(wheyprotein)、氨基酸(aminoacid)、柠檬酸(citricacid)、柠檬酸盐(citrate)、乳酸(lacticacid)、乳酸盐(lactate)以及核苷酸(nucleotide)。[0048]本发明也提供一种预防和/或治疗关节炎的方法，其包括对一有此需要的个体给药以如上所述的后生元提取物。[0049]依据本发明，该后生元提取物的给药剂量与给药次数会视下列因素而变化：要被治疗的疾病的严重性，给药途径，以及要被治疗的个体的年龄、身体状况与反应。一般而言，该后生元提取物可呈单一剂量或是分成数个剂量的形式而被口服地、非经肠地道或局部地给药。[0050]本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。[0051]《实施例》[0052]一般实验材料：[0053]1.在下面的实施例中所使用的益生菌菌株是得自于中兴大学食品暨应用生物科技学系(departmentoffoodscienceandbiotechnologyatnationalchunghsinguniversity)的微生物研究室，并且已被整合于下面的表1中。[0054]表1.各个益生菌菌株time,htst)(73±2℃，15秒)来对各个培养物进行热灭活。[0065]接着，经热灭活的各个培养物在25℃下以10,000rpm进行离心历时15分钟，继而倒除上清液，所得到的沉淀物(pellets)被拿来进行喷雾干燥，借此而得到各个菌株的干燥菌粉。[0066]各个干燥菌粉是分别依照下面所示的步骤来进行一前处理：首先，将适量的等电点(isoelectricpoint)为ph4.4的乳清蛋白(wheyprotein)(厂牌为nzmp，货号为wpc80)溶解于水中，以配制成浓度为10％(w/v,g/l)的乳清蛋白溶液，继而以食品级碳酸钠来将该溶液的ph值调整至7.5。在持续搅拌下，将适量的干燥菌粉散浮于该溶液中至最终浓度为5％(w/v,g/l)，接着，缓慢地加入适量的等电点为ph5.2的糊精(dextrin)(厂牌为zhuchengdongxiao，货号为maltodextrinde8-10)至浓度为6％(w/v,g/l)，同时缓慢地加入乳酸来将该溶液的ph值调整至约为4.8，当ph为4.8时，乳清蛋白以及糊精会达到电荷中和(chargeneutralization)而析出。之后，持续搅拌直到沉淀物不再增加为止。之后，使用一孔径为25μm的滤纸来进行过滤以分离并收取沉淀物，继而将所得到的沉淀物拿来进行喷雾干燥，借此而得到经前处理的菌粉。[0067]各个菌株的经前处理的菌粉分别被拿来进行细胞壁分离提取(cellwallisolationandextraction)，其大体上是参考pei-juntianetal.(2015),int.j.mol.sci.,16(8):20033–20049当中所述的方法来进行，并略作修改。简单地说，秤取50mg的经前处理的菌粉，继而加入1ml的10％乳酸(lacticacid)并于80℃的水浴槽中加热历时60分钟。之后，于10,000g下进行离心历时15分钟，然后移除上清液并加入1ml的混合溶剂[含有4：10(v/v)的0.5m柠檬酸盐溶液(citratesolution)以及乙醇，ph值为4.6]，继而静置隔夜。之后，于10,000g下进行离心历时20分钟，然后移除上清液并使用95％乙醇来清洗所形成的沉淀物数次，接着置于80℃的干浴槽中加热历时约40分钟以将乙醇完全移除，借此而得到本发明的后生元提取物。[0068]另外，各个菌株的未经前处理的菌粉也被拿来进行相同的细胞壁分离提取处理以获得后生元提取物(下称现有的后生元提取物)。[0069]实施例2.本发明的后生元提取物的成份分析[0070]依据上面实施例1所得到的现有的后生元提取物以及本发明的后生元提取物被拿来进行下面的提取率的测定(determinationofextractionrate)、蛋白质含量的测定(determinationofproteincontent)以及蛋白质电泳分析(proteinelectrophoresisanalysis)。[0071]实验方法：[0072]a.提取率的测定：[0073]提取率是通过将上面实施例1中所得到的后生元提取物的重量代入下列公式(i)中而被计算出：[0074]公式(i)：a＝b/50×100％[0075]其中，a＝提取率(％)[0076]b＝后生元提取物的重量(mg)[0077]b.蛋白质含量的测定：[0078]蛋白质含量的测定是通过将上面实施例1中所得到的后生元提取物溶解于磷酸缓冲溶液(含有8g/l的nacl、0.2g/l的kcl、1.44g/l的na2hpo4以及0.24g/l的kh2po4，ph值为6.2)中并且依据制造商的操作指南使用piercetmbca蛋白质分析试剂盒(piercetmbcaproteinassaykit)(厂牌为thermoscientific，货号为23225)来进行。[0079]c.蛋白质电泳分析：[0080]对上面实施例1中所得到的后生元提取物各取1g并分别溶解于20ml的水中，接着使用bio-rad电泳系统并采用本领域技术人员所详知且惯用的技术来进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)分析。[0081]结果：[0082]a.提取率的测定：[0083]下面表2显示依据本发明的含前处理的方法的提取率以及不含前处理的现有方法所具者。[0084]表2.依据本发明的方法与现有方法的提取率[0085][0086]从表2可见，相较于现有方法，依据本发明的方法，将经前处理的菌粉拿来进行细胞壁分离提取可以获得较高的后生元提取物的提取率。[0087]b.蛋白质含量的测定：[0088]下面表3显示依据本发明的方法与现有方法所得到的后生元提取物的蛋白质含量。[0089]表3.依据本发明的方法与现有方法所得到的后生元提取物的蛋白质含量[0090][0091]从表3可见，本发明的后生元提取物中的蛋白质含量是明显高于现有的后生元提取物中的蛋白质含量。[0092]c.蛋白质电泳分析：[0093]图1是一电泳胶片图，它显示本发明的后生元提取物与现有的后生元提取物的蛋白质电泳分析结果。从图1可见，本发明的后生元提取物的蛋白质带(proteinband)是明显多于现有的后生元提取物的蛋白质带。申请人据此而认为，依据本发明的方法所得到的后生元提取物含有较多的细胞壁成分，例如肽聚糖(peptidoglycan)、脂壁酸(lipoteichoicacid)、磷壁酸(teichoicacid)、糖蛋白(glycoprotein)以及蛋白聚糖(proteoglycan)等。[0094]综合以上的实验结果可发现，本发明的方法能够有效地从益生菌的细胞壁中提取出后生元提取物，并且由此所得到的后生元提取物含有较多的细胞壁蛋白质(cellwallprotein)。[0095]实施例3.本发明的后生元提取物在治疗关节炎(arthritis)上的效用评估[0096]在本实施例中，依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物与现有的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别被拿来处理sw1353细胞，并通过测量经处理后的sw1353细胞的tgf-β分泌量以及细胞增生数量来评估本发明的后生元提取物在治疗关节炎上的效用。另外，申请人进一步评估本发明的后生元提取物与已知能应用于关节保健的市售保健物质的组合使用对于此效用的影响。[0097]实验材料：[0098]1.在本实施例中所使用的保健物质是购自于创百股份有限公司(chambioco.,ltd.)。有关所述保健物质的种类及其商品名已被整合于下面的表4中。[0099]表4.各个保健物质的种类及其商品名[0100][0101]实验方法：[0102]a.后生元提取物对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的影响：[0103]首先，将依据上面“一般实验材料”的第2项来进行继代培养的sw1353细胞分成25组，其中包括1个对照组、12个比较实验组(也就是比较实验组l-1至l-6以及比较实验组b-1至b-6)以及12个实验组(也就是实验组l-1至l-6以及实验组b-1至b-6)。将各组的sw1353细胞以一为1×104细胞/孔的数量分别培养于含有200μl的dmem培养基的96-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％co2)中进行培养历时24小时。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，并依据下面表5所示者，将依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物与现有的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别添加至各组中。[0104]表5.各组培养物所具有的后生元提取物的最终浓度[0105][0106]各组培养物在37℃的条件下培养历时24小时后，依照上面“一般实验方法”的第1项「tgf-β的含量测定」当中所述的方法来测定tgf-β的含量。[0107]b.后生元提取物与其他保健物质的组合使用对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的影响：[0108]首先，将依据上面“一般实验材料”的第2项来进行继代培养的sw1353细胞分成28组，其中包括14个比较实验组(也就是1x比较实验组1至7以及2x比较实验组1至7)以及14个实验组(也就是实验组1-l至7-l以及实验组1-b至7-b)。将各组的sw1353细胞以一为1×104细胞/孔的数量分别培养于含有200μl的dmem培养基的96-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％co2)中进行培养历时24小时。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，并依据下面表6所示者，将上面“实验材料”的第1项中的7种保健物质以及依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别添加至各组中。[0109]表6.各组培养物所具有的后生元提取物或保健物质的最终浓度[0110][0111]各组培养物在37℃的条件下培养历时24小时后，依照上面“一般实验方法”的第1项「tgf-β的含量测定」当中所述的方法来测定tgf-β的含量。[0112]c.后生元提取物对于sw1353细胞的细胞增生(proliferation)的影响：[0113]首先，将依据上面“一般实验材料”的第2项来进行继代培养的sw1353细胞分成3组，其中包括1个对照组以及2个实验组(也就是实验组l以及实验组b)。将各组的sw1353细胞以一为1×104细胞/孔的数量分别培养于含有200μl的dmem培养基的96-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％co2)中进行培养历时24小时。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，并依据下面表7所示者，将依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别添加至各组中。[0114]表7.各组培养物所具有的后生元提取物的最终浓度[0115][0116]各组培养物在37℃的条件下培养历时24小时后，计数各孔中的sw1353细胞的细胞数。[0117]d.后生元提取物与其他保健物质的组合使用对于sw1353细胞的细胞增生的影响：[0118]首先，将依据上面“一般实验材料”的第2项来进行继代培养的sw1353细胞分成28组，其中包括14个比较实验组(也就是1x比较实验组1至7以及2x比较实验组1至7)以及14个实验组(也就是实验组1-l至7-l以及实验组1-b至7-b)。将各组的sw1353细胞以一为1×104细胞/孔的数量分别培养于含有200μl的dmem培养基的96-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％co2)中进行培养历时24小时。接着，将各组的细胞培养物分别更换以新鲜的培养基，并依据上面表6所示者，将上面“实验材料”的第1项中的7种保健物质以及依据上面实施例1所得到的本发明的植物乳杆菌以及长双歧杆菌的后生元提取物分别添加至各组中。[0119]各组培养物在37℃的条件下培养历时24小时后，计数各孔中的sw1353细胞的细胞数，然后计算出相对于对应的1x比较实验组所具者的倍数。[0120]结果：[0121]a.后生元提取物对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的影响：[0122]下面表8显示各组培养物所测得的tgf-β含量。[0123]表8.各组培养物的tgf-β含量[0124][0125]从表8可见，本发明的植物乳杆菌的后生元提取物对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的促进效用是明显优于现有的植物乳杆菌的后生元提取物对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的促进效用。此外，本发明的长双歧杆菌的后生元提取物也展现类似的优异效用。这个实验结果显示：依据本发明的方法所得到的后生元提取物能有效地促进sw1353细胞分泌tgf-β。[0126]b.后生元提取物与其他保健物质的组合使用对于sw1353细胞的tgf-β分泌量的影响：[0127]下面表9显示各组培养物的tgf-β含量。[0128]表9.各组培养物的tgf-β含量[0129][0130]从表9可见，各个实验组的tgf-β含量皆是明显高于对应的1x比较实验组与2x比较实验组的tgf-β含量。特别地，各个实验组相较于对应的1x比较实验组的提高幅度是显著高于2x比较实验组相较于对应的1x比较实验组的提高幅度，这表示：使用本发明的后生元提取物来替代等量的保健物质能够大幅提升保健物质在促进sw1353细胞分泌tgf-β上的效用。[0131]c.后生元提取物对于sw1353细胞的细胞增生的影响：[0132]下面表10显示各组培养物中的细胞数。[0133]表10.各组培养物中的细胞数[0134]组别细胞数(个)对照组1.1×104实验组l2.0×104实验组b2.2×104[0135]从表10可见，实验组l与b的细胞数皆是明显高于对照组所具者。这个实验结果显示：本发明的后生元提取物可以促进sw1353细胞的细胞增生。[0136]d.后生元提取物与其他保健物质的组合使用对于sw1353细胞的细胞增生的影响：[0137]下面表11显示各组培养物中的细胞增生情形(相对于对应的1x比较实验组所具者的倍数)。[0138]表11.各组培养物中的细胞增生情形[0139]组别倍数*组别倍数*1x比较实验组11.01x比较实验组51.02x比较实验组11.12x比较实验组51.1实验组1-l1.2实验组5-l1.2实验组1-b1.2实验组5-b1.21x比较实验组21.01x比较实验组61.02x比较实验组21.02x比较实验组61.1实验组2-l1.4实验组6-l1.2实验组2-b1.4实验组6-b1.21x比较实验组31.01x比较实验组71.02x比较实验组31.12x比较实验组71.1实验组3-l1.2实验组7-l1.2实验组3-b1.2实验组7-b1.21x比较实验组41.0ꢀꢀ2x比较实验组41.1ꢀꢀ实验组4-l1.2ꢀꢀ实验组4-b1.2ꢀꢀ[0140]*：各组的细胞数相对于对应的1x比较实验组所具者的倍数。[0141]从表11可见，各个实验组的细胞增生情形是明显优于对应的1x比较实验组与2x比较实验组的细胞增生情形。特别地，各个实验组相较于对应的1x比较实验组的增生幅度是显著高于2x比较实验组相较于对应的1x比较实验组的增生幅度，这表示：使用本发明的后生元提取物来替代等量的保健物质能够大幅提升保健物质在促进sw1353细胞的细胞增生上的效用。[0142]综合以上各项实验结果可知，本发明的方法能够有效地从益生菌细胞壁中提取出后生元，且所制得的后生元提取物包含有较多含蛋白质的细胞组分，并且在促进软骨细胞增生以及分泌抗发炎激素上具有优异的效用。因此，申请人认为：依据本发明的方法所得到的后生元提取物能够应用于预防和/或治疗关节炎与关节退化。[0143]于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。[0144]虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求所示者的限制。当前第1页12当前第1页12
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