P2X7受体表达调节剂的制作方法

p2x7受体表达调节剂
技术领域
1.本发明涉及p2x7受体表达调节剂等。


背景技术：

2.细胞外atp通常在体液中几乎不存在，但是在炎症位点、肿瘤微环境及免疫突触等中浓度上升。已知p2x7受体(本说明书中，有时也表示为“p2x7”)作为针对该细胞外atp的配体依赖性阳离子通道，为通过atp的结合而使钠、钙及钾离子通过的细胞膜定位型同源三聚体膜蛋白。另外还已知：p2x7在atp结合时不仅使这些金属离子通过，而且使分子量小于约900da的有机化合物来源的阳离子通过；会诱导膜磷脂在细胞膜内层与外层之间被双向输送的细胞膜紊乱以及细胞膜蛋白的释放(脱落)。进而还已知：p2x7通过被强烈刺激而诱导细胞死亡；在巨噬细胞、肥大细胞等中诱导炎症性反应(非专利文献1)。另一方面，还报道了p2x7促进细胞的增殖、对记忆t细胞的分化和维持是必要的(非专利文献2～3)。
3.现有技术文献
4.非专利文献
5.非专利文献1：nat commun 3 1034(2012)
6.非专利文献2：nature 559,264-268(2018)
7.非专利文献3：faseb j 23(6),1685-1693(2017)


技术实现要素：

8.发明所要解决的问题
9.本发明的课题在于提供p2x7受体表达调节剂。
10.用于解决问题的方法
11.本发明人鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现，通过使用选自由eros(essential for reactive oxygen species，活性氧必需蛋白)表达调节剂及eros功能调节剂组成的组中的至少一种，能够调节p2x7受体的表达。基于该发现进一步进行了研究，结果完成了本发明。即，本发明包含下述方式。
12.项1.一种p2x7受体表达调节剂，其含有选自由eros(活性氧必需蛋白)表达调节剂和eros功能调节剂组成的组中的至少一种。
13.项2.根据项1所述的调节剂，其中，含有选自由eros表达抑制剂和eros功能抑制剂组成的组中的至少一种、并且用于抑制p2x7受体表达。
14.项3.根据项2所述的调节剂，其中，含有上述eros表达抑制剂。
15.项4.根据项3所述的调节剂，其中，上述eros表达抑制剂包含多核苷酸。
16.项5.根据项3或4所述的调节剂，其中，上述eros表达抑制剂包含选自由eros特异性sirna、eros特异性mirna、eros特异性反义核酸和它们的表达盒、以及eros基因编辑剂组成的组中的至少一种。
17.项6.根据项2～5中任一项所述的调节剂，其用于预防或改善选自由炎症及疼痛组
成的组中的至少一种。
18.项7.根据项1所述的调节剂，其中，含有选自由eros表达促进剂及eros功能促进剂组成的组中的至少一种，并且用于促进p2x7受体表达。
19.项8.根据项7所述的调节剂，其中，含有上述eros表达促进剂。
20.项9.根据项8所述的调节剂，其中，上述eros表达促进剂包含eros表达盒。
21.项10.根据项7～9中任一项所述的调节剂，其用于促进记忆t细胞的分化和/或维持。
22.项11.根据项1～10中任一项所述的调节剂，其为药物、试剂或食品组合物。
23.项12.一种t细胞，其被导入有项7～10中任一项所述的调节剂。
24.项13.根据项12所述的t细胞，其能够以使eros表达和/或eros功能一过性增强的方式进行调节。
25.项14.根据项12或13所述的t细胞，其中，还被导入有项2～5中任一项所述的调节剂。
26.项15.根据项14所述的t细胞，其能够以在使eros表达和/或eros功能一过性增强后、抑制eros表达和/或eros功能的方式进行调节。
27.另外，本发明还包含下述方式。
28.项16.一种p2x7受体表达调节方法，其包括：向动物给药选自由eros表达调节剂及eros功能调节剂组成的组中的至少一种。
29.项17.一种组合物，其用于调节动物体内的p2x7受体表达，并且含有选自由eros表达调节剂及eros功能调节剂组成的组中的至少一种。
30.项18.选自由eros表达调节剂及eros功能调节剂组成的组中的至少一种在制造p2x7受体表达调节剂中的应用。
31.项19.一种在体外调节p2x7受体表达的方法，其包括：使选自由eros表达调节剂及eros功能调节剂组成的组中的至少一种与细胞接触。
32.项20.一种il-1β的抑制方法，其通过抑制eros表达和/或eros功能来进行。
33.发明效果
34.根据本发明，能够提供p2x7受体表达调节剂。
附图说明
35.图1示出对wr19l细胞中的p2x7介导及tmem16f非依赖性ptdser暴露进行调查的结果。(a)示出ca
2
对于wr19l细胞中的bz-atp诱导ptdser暴露并非必需。(b)示出wr19l细胞中的tmem16f依赖性或p2x7依赖性的ptdser暴露。
36.图2示出关于支持p2x7介导的ptdser暴露的基因的全基因组crispr筛选的结果。(a)表示wr19l细胞中的p2x7k同种型的优势性表达。下图中，与引物的位置一起概略地示出mp2x7基因的结构。(b)示出mp2x7k介导的ptdser暴露。示出sytox blue阴性群体的染色曲线。(c)示出支持mp2x7介导ptdser暴露的基因的鉴定结果。上面板示出crispr筛选步骤。中央面板示出最初的筛选的facs曲线，其中示出为了下一步骤而分取出的群体。下面板示出pi阴性群体的膜联蛋白v染色曲线。
37.图3示出eros对于p2x7介导的信号传递的重要作用。(a)示出meros对mp2x7k介导
的ptdser暴露的影响。(b及c)示出meros对ptdcho及yo-pro-1的mp2x7k介导内源化的效果。(d)示出meros对mp2x7k介导ca
2
流入的效果。(e)示出heros对thp-1细胞中的atp诱导性il-1β分泌的效果。(f)示出eros在来自小鼠骨髓的巨噬细胞(bmdm)的atp诱发il-1β分泌中的必要性。
38.图4示出用于p2x7的细胞表面表达的eros的必要性。(a)示出在wr19l细胞中meros对外源导入的mp2x7k的表达的效果。(b)示出heros对thp-1细胞中的内源性p2x7表达的效果。(c)示出meros对wr19l细胞中的mp2x7k的细胞表面表达的效果。(d及e)示出mp2x7k及meros的细胞内分布。(f)示出mp2x7及meros的bn-page分析结果。(g)示出meros与mp2x7k的免疫共沉淀结果。
具体实施方式
39.1.定义
40.本说明书中，“含有”及“包含”的表述包括“含有”、“包含”、“实质上由
……
构成”及“仅由
……
构成”之类的概念。
41.氨基酸序列的“一致性”是指：2个以上的能够对比的氨基酸序列相互间的氨基酸序列的一致程度。因此，某2个氨基酸序列的一致性越高则它们的序列的一致性或类似性越高。氨基酸序列的一致性水平例如可以使用作为序列分析用工具的fasta利用默认参数来确定。或者，可以使用karlin及altschul的算法blast(karlins,altschul sf.“methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”proc natl acad sci usa.87:2264-2268(1990)、karlins,altschul sf.“applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.”proc natl acad sci usa.90:5873-7(1993))来确定。已开发出基于这种blast算法的被称为blastx的程序。这些分析方法的具体方法是公知的，可参照national center of biotechnology information(ncbi)的网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。另外，碱基序列的“一致性”也基于上述来定义。
42.本说明书中，“保守性置换”是指：氨基酸残基被置换为具有类似的侧链的氨基酸残基。例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸之类的具有碱性侧链的氨基酸残基彼此间的置换属于保守性置换。此外，天冬氨酸、谷氨酸之类的具有酸性侧链的氨基酸残基；甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸之类的具有非带电性极性侧链的氨基酸残基；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸之类的具有非极性侧链的氨基酸残基；苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸之类的具有β-支链侧链的氨基酸残基；酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸之类的具有芳香族侧链的氨基酸残基彼此间的置换也同样属于保守性置换。
43.本说明书中，“核酸”及“多核苷酸”没有特别限制，包括天然、人工中的任一种。具体而言，除了dna、rna等以外，还可以如下述所例示那样实施了公知的化学修饰。为了防止被核酸酶等水解酶分解，可以将各核苷酸的磷酸残基(磷酸酯)置换为例如硫代磷酸酯(ps)、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等化学修饰磷酸残基。另外，可以将各核糖核苷酸的糖(核糖)的2位的羟基置换为-or(r表示例如ch3(2
’‑
o-me)、ch2ch2och3(2
’‑
o-moe)、ch2ch2nhc(nh)nh2、ch2conhch3、ch2ch2cn等)。进而，可以对碱基部分(嘧啶、嘌呤)实施化学修饰，可
列举例如；向嘧啶碱基的5位导入甲基、阳离子性官能团；或者将2位的羰基置换为硫羰基等。进而，可列举出磷酸部分、羟基部分被例如生物素、氨基、低级烷基胺基、乙酰基等修饰的物质等，但是不限于此。另外，还可使用通过使核苷酸的糖部的2’氧与4’碳交联而将糖部的构象固定为n型的bna(lna)等。
44.2.p2x7受体表达调节剂
45.本发明的一个方式涉及一种p2x7受体表达调节剂(本说明书中，有时也表示为“本发明的调节剂”。)，其含有选自由eros(活性氧必需蛋白)表达调节剂及eros功能调节剂组成的组中的至少一种。以下对其进行说明。
46.2-1.调节对象(eros)
47.作为表达或功能调节对象的eros蛋白及eros mrna为eros(有时也被称为cybc1：cytochrome b-245chaperone 1，细胞色素b-245伴侣蛋白1)等)基因的表达产物，为在p2x7受体的表达调节对象的生物或细胞内表达的eros蛋白或eros mrna。因此，作为抑制对象的eros蛋白及eros mrna也根据该对象的生物物种而改变。作为该生物物种，没有特别限制，可列举动物，例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、猫、兔、猪、马、牛、绵羊、山羊、鹿等各种哺乳类。
48.来自各种生物物种的eros蛋白的氨基酸序列及eros mrna的碱基序列是公知的。具体而言，例如作为人eros蛋白，可列举由序列号12所示的氨基酸序列构成的蛋白质(ncbi参考序列(reference sequence)：np_001093877.1)，作为小鼠eros蛋白，可列举由序列号13所示的氨基酸序列构成的蛋白质(ncbi参考序列：np_659081.1)等，作为人eros mrna，可列举由序列号14所示的碱基序列构成的mrna(ncbi参考序列：nm_001100407.2)，作为小鼠eros mrna，可列举由序列号15所示的碱基序列构成的mrna(ncbi参考序列：nm_144832.2)等。另外，作为eros蛋白及eros mrna，还可包括上述的剪接变异体。
49.作为调节对象的eros蛋白只要具有其本来的活性、即分子伴侣活性则也可以具有置换、缺失、添加、插入等氨基酸突变。作为突变，从更不易损害活性的观点出发，优选列举置换，更优选列举保守性置换。
50.关于作为调节对象的eros mrna，只要由该mrna翻译出的蛋白质具有其本来的活性、即分子伴侣活性则也可以具有置换、缺失、添加、插入等碱基突变。作为突变，优选由该mrna翻译出的蛋白质中不发生氨基酸置换的突变、发生了氨基酸的保守性置换的突变。
51.就作为调节对象的eros蛋白的优选的具体例而言，可列举选自由下述(a)中记载的蛋白质及下述(b)中记载的蛋白质组成的组中的至少一种：
52.(a)由序列号12～13中任一者所示的氨基酸序列构成的蛋白质及
53.(b)由与序列号12～13中任一者所示的氨基酸序列具有85％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有分子伴侣活性的蛋白质。
54.上述(b)中，一致性更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、更进一步优选为98％以上。
55.作为上述(b)中记载的蛋白质的一例，可列举例如：
56.(b’)由相对于序列号12～13中任一者所示的氨基酸序列置换、缺失、添加或插入了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列构成、且具有分子伴侣活性的蛋白质。
57.上述(b’)中，两个以上例如为2～20个，优选为2～10个，更优选为2～5个，更进一步优选为2或3个。
58.就作为调节对象的eros mrna的优选的具体例而言，可列举选自由下述(c)中记载的mrna及下述(d)中记载的mrna组成的组中的至少一种：
59.(c)由序列号14～15中任一者所示的碱基序列构成的mrna及
60.(d)由与序列号14～15中任一者所示的碱基序列具有85％以上的一致性的碱基序列构成、且编码具有分子伴侣活性的蛋白质的mrna。
61.上述(d)中，一致性更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、更进一步优选为98％以上。
62.作为上述(d)中记载的mrna的一例，可列举例如：
63.(d’)由相对于序列号14～15中任一者所示的碱基序列置换、缺失、添加或插入了一个或两个以上碱基的碱基序列构成、且编码具有分子伴侣活性的蛋白质的mrna。
64.上述(d’)中，两个以上例如为2～200个，优选为2～100个，更优选为2～50个，更进一步优选为2～10个。
65.2-2.eros表达调节剂
66.eros表达调节剂只要是能够调节在p2x7受体的表达调节对象的生物或细胞内表达的eros蛋白或eros mrna的表达的物质就没有特别限制，包括例如eros表达抑制剂、eros表达促进剂等。eros表达调节剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
67.2-2-1.eros表达抑制剂
68.作为eros表达抑制剂，只要是能够抑制eros蛋白、eros mrna等的表达量的物质就没有特别限制，可列举例如eros特异性小干扰rna(sirna)、eros特异性微小rna(mirna)、eros特异性反义核酸、它们的表达载体；eros特异性核酶；利用crispr/cas系统的eros基因编辑剂等。
69.需要说明的是，表达抑制是指将eros蛋白、eros mrna等的表达量抑制为例如1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下，也包括使它们的表达量为0。
70.2-2-1-1.sirna、mirna、反义核酸、核酶
71.eros特异性sirna只要是特异性抑制编码eros的基因的表达的双链rna分子就没有特别限制。在一个实施方式中，sirna例如优选为18碱基以上、19碱基以上、20碱基以上或21碱基以上的长度。另外，sirna例如优选为25碱基以下、24碱基以下、23碱基以下或22碱基以下的长度。这里记载的sirna的长度的上限值及下限值可假定任意地组合。例如，可假定如下组合：下限为18碱基且上限为25碱基、24碱基、23碱基或22碱基的长度；下限为19碱基且上限为25碱基、24碱基、23碱基或22碱基的长度；下限为20碱基且上限为25碱基、24碱基、23碱基或22碱基的长度；下限为21碱基且上限为25碱基、24碱基、23碱基或22碱基的长度。
72.sirna可以是shrna(small hairpin rna，短发夹rna)。shrna可以按照其一部分形成茎环结构的方式来设计。例如，在将某区域的序列设为序列a、将序列a的互补链设为序列b时，可以以按照序列a、间隔物、序列b的顺序使这些序列存在于单链rna链且整体达到45～60碱基的长度的方式来设计shrna。序列a是编码成为靶的eros的碱基序列的一部分区域的序列，靶区域没有特别限定，可以将任意的区域设为候补。并且，序列a的长度为19～25碱基，优选为19～21碱基。
73.eros特异性sirna可以在5’或3’末端具有附加的碱基。该附加的碱基的长度通常
为2～4碱基左右。该附加的碱基可以为dna也可以为rna，使用dna时，有时能够提高核酸的稳定性。作为这样的附加的碱基的序列，可列举例如ug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’等序列，但是不限于这些。
74.sirna可以在3’末端具有突出部序列(悬垂序列)，具体而言，可列举添加了dtdt(dt表示脱氧胸苷)。另外，也可以为无末端添加的平滑末端(平端)。sirna的有义链和反义链可以为不同的碱基数，可列举例如反义链在3’末端及5’末端具有突出部序列(悬垂序列)的“asymmetrical interfering rna(airna，不对称干扰rna)”。典型的airna中，反义链由21碱基构成，有义链由15碱基构成，在反义链的两端各自采取3碱基的悬垂序列结构。
75.eros特异性sirna的靶序列的位置当然也没有特别限制，在一个实施方式中，期望从距离5
’‑
utr及起始密码子约50碱基以内以及3
’‑
utr以外的区域中选择靶序列。对于所选择的靶序列的候补群，优选使用blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)等同源检索软件调查靶以外的mrna中16-17碱基的连续的序列有无同源性、从而确认所选择的靶序列的特异性。对于确认了特异性的靶序列，可以将由在aa(或na)以后的19-21碱基上具有tt或uu的3’末端悬垂序列的有义链以及具有与该19-21碱基互补的序列和tt或uu的3’末端悬垂序列的反义链构成的双链rna设计为sirna。另外，作为sirna的前体的shrna可以通过适宜选择能够形成环结构的任意的接头序列(例如5-25碱基左右)、并且将上述有义链和反义链经由该接头序列连接而设计。
76.sirna和/或shrna的序列可使用各种web网站上免费提供的检索软件来进行检索。作为这样的网站，可列举例如以下网站。
77.ambion所提供的sirna target finder(http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/sirna_finder.html)psilencer(注册商标)表达载体用插入设计工具(http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html)rnaicodex所提供的geneseer(http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi)。
78.sirna可如下制备：用dna/rna自动合成机分别合成mrna上的靶序列的有义链及反义链，在适当的退火缓冲液中在约90℃～约95℃使其变性约1分钟左右之后，在约30℃～约70℃下退火约1小时～约8小时，由此而制备。另外，还可以合成成为sirna的前体的shrna，将其用rna切割蛋白dicer切断而制备。作为这样的eros特异性sirna，可以购买并使用例如由merck公司销售的sasi_hs01_00242324、sasi_hs02_00307980、sasi_mm01_00134930等。
79.eros特异性mirna只要抑制编码eros的基因的翻译则是任意的。例如，mirna也可以如sirna那样不切断靶mrna、而是与靶的3’非翻译区(utr)匹配而抑制其翻译。mirna可以为pri-mirna(primarymirna)、pre-mirna(precursor mirna)及成熟mirna中的任一者。mirna的长度没有特别限制，pri-mirna的长度通常为数百～数千碱基，pre-mirna的长度通常为50～80碱基，成熟mirna的长度通常为18～30碱基。在一个实施方式中，eros特异性mirna优选为pre-mirna或成熟mirna，更优选为成熟mirna。这样的eros特异性mirna可以通过公知的方法合成，也可以从提供合成rna的公司购买。
80.eros特异性反义核酸是包含与编码eros的基因的mrna的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分的核酸，是具有通过与该mrna特异性且形成稳定双链地进行结合而抑制eros蛋白合成的功能的核酸。反义核酸可以为dna、rna、dna/rna嵌合体中的任一者。反义核酸为dna的情况下，由靶rna与反义dna形成的rna:dna杂交体可被内源性核糖核
酸酶h(rnase h)识别并引起靶rna的选择性分解。因此，在旨在被rnase h分解的反义dna的情况下，靶序列不仅可以为mrna中的序列，也可以为eros基因的初始翻译产物中的内含子区域的序列。内含子序列可以通过用blast、fasta等同源检索程序来对比基因组序列与eros基因的cdna碱基序列来确定。
81.就eros特异性反义核酸的靶区域而言，只要是通过该反义核酸进行杂交、作为结果可抑制向eros蛋白的翻译的靶区域，则其长度没有限制。eros特异性反义核酸可以为编码eros的mrna的全序列，也可以为部分序列。如果考虑到合成的容易性和抗原性、细胞内转移性的问题等，优选由约10～约40碱基、特别是约15～约30碱基构成的寡核苷酸，但是不限于此。更具体而言，可选择eros基因的5’端发夹环、5’端非翻译区、翻译起始密码子、蛋白质编码区域、orf翻译终止密码子、3’端非翻译区、3’端回文区域或3’端发夹环等作为反义核酸的优选靶区域，但是不限于这些。
82.eros特异性反义核酸不仅可以与eros基因的mrna、初始转录产物杂交而抑制向蛋白质的翻译，而且可以与作为双链dna的这些基因结合而形成三链体(triplex)、抑制转录为rna(反基因(antigene))。
83.eros特异性sirna、eros特异性mirna及eros特异性反义核酸等可以如下制备：基于eros基因的cdna序列或基因组dna序列确定mrna或初始转录产物的靶序列，使用市售的dna/rna自动合成机合成与其互补的序列，从而制备。另外，包含各种修饰的反义核酸也都可以通过公知的方法进行化学合成。
84.关于eros特异性sirna、eros特异性mirna、或eros特异性反义核酸的表达盒，只要是以能够表达的状态整合有eros特异性sirna、eros特异性mirna、或eros特异性反义核酸的多核苷酸就没有特别限制。典型情况下，该表达盒为包含启动子序列及eros特异性sirna、eros特异性mirna或eros特异性反义核酸的编码序列(根据需要进一步包含转录终止信号序列)的多核苷酸、可根据需要包含其它序列。启动子没有特别限制，可列举例如cmv启动子、ef1启动子、sv40启动子、mscv启动子、htert启动子、β肌动蛋白启动子、cag启动子等rna聚合酶ii(polii)系启动子；小鼠及人的u6-snrna启动子、人h1-rnase p rna启动子、人缬氨酸-trna启动子等rna聚合酶iii(poliii)系启动子等，这些中，从能够准确地进行短rna的转录的观点出发，优选poliii系启动子。另外，也可以使用能够通过药剂来诱导的各种启动子。作为其它序列，没有特别限制，可以采用各种可包含于表达载体的公知序列。作为这样的序列的一例，可列举例如复制起点、药剂抗性基因等。另外，药剂抗性基因的种类及载体的种类可例示以上所述的例子。
85.作为eros表达抑制剂的另一例，可列举eros特异性核酶等。“核酶”狭义上是指具有切断核酸的酶活性的rna，本技术中，只要具有序列特异性的核酸切割活性则也包括dna。作为核酶核酸，通用性最高的有在类病毒、拟病毒等感染性rna中发现的自我剪接rna，已知有锤头型、发夹型等。锤头型以约40碱基左右发挥酶活性，通过将与形成锤头结构的部分相邻的两端的数个碱基(总计约10碱基左右)分别设为与mrna的期望切割位点互补的序列，从而能够仅特异性切断靶mrna。该类型的核酶核酸仅以rna为底物，因此具有不会攻击基因组dna的优点。eros基因的mrna本身形成双链结构的情况下，可以使用连接有能够与rna解旋酶特异性结合的来自病毒核酸的rna基序的杂交体核酶，由此使靶序列形成单链[proc.natl.acad.sci.usa,98(10):5572-5577(2001)]。进而，在将核酶以包含编码该核酶
的dna的表达载体的形态使用的情况下，为了促进转录产物向细胞质的转移，可以设为还连接有改变了trna的序列的杂交体核酶[nucleic acids res.,29(13):2780-2788(2001)]。
[0086]
2-2-1-2.基因编辑剂
[0087]
eros基因编辑剂只要能够利用靶序列特异性核酸酶系统(例如crispr/cas系统)来抑制eros基因的表达就没有特别限制。eros基因的表达抑制例如可通过破坏eros基因、通过改变eros基因的启动子而抑制该启动子的活性来实现。
[0088]
例如在采用crispr/cas系统作为eros基因编辑剂时，典型情况下可以使用包含以eros基因或其启动子为靶的引导rna表达盒及cas蛋白表达盒的载体(eros基因编辑用载体)，但是不限于此。除了该典型例以外，例如，还可以使用包含以eros基因或其启动子为靶的引导rna和/或其表达盒的载体与cas蛋白表达盒和/或包含该表达盒的载体的组合来作为eros基因编辑剂。
[0089]
引导rna表达盒只要是以在代谢改善对象的生物内表达引导rna的目的使用的多核苷酸就没有特别限制。作为该表达盒的典型例，可列举包含启动子及在该启动子的控制下配置的引导rna整体或一部分的编码序列的多核苷酸。需要说明的是，“在启动子的控制下配置”换言之是指：引导rna编码序列以该序列的转录受到启动子控制的方式来配置。作为具体的配置方式，可列举例如在紧挨启动子的3’侧的下游配置有引导rna编码序列的方式(例如在启动子3’末端的碱基至引导rna编码序列的5’末端的碱基之间的碱基对数(bp)为例如100bp以下、优选为50bp以下的方式)。
[0090]
作为引导rna表达盒的启动子，没有特别限制，可以使用pol ii系启动子，从更准确地进行较短的rna的转录的观点出发，优选pol iii系启动子。作为pol iii系启动子，没有特别限制，可列举例如小鼠及人的u6-snrna启动子、人h1-rnase p rna启动子、人缬氨酸-trna启动子等。另外，也可以使用能够通过药剂来诱导的各种启动子。
[0091]
引导rna编码序列只要是编码引导rna的碱基序列就没有特别限制。
[0092]
引导rna只要是在crispr/cas系统中使用的引导rna就没有特别限制，例如可以使用各种通过与基因组dna的靶位点(例如eros基因、其启动子等)结合且与cas蛋白结合、从而能够将cas蛋白诱导至基因组dna的靶位点的引导rna。
[0093]
本说明书中，靶位点是指：由pam(proto-spacer adjacent motif，前间隔序列邻近基序)序列及与其5’侧相邻的17～30碱基长(优选为18～25碱基长、更优选为19～22碱基长、特别优选为20碱基长)左右的序列构成的dna链(靶链)与其互补dna链(非靶链)所构成的、基因组dna上的位点。
[0094]
pam序列根据所利用的cas蛋白的种类而不同。例如，与来自酿脓链球菌(s.pyogenes)的cas9蛋白(ii型)对应的pam序列为5
’‑
ngg，与来自嗜热古菌(s.solfataricus)的cas9蛋白(i-a1型)对应的pam序列为5
’‑
ccn，与来自嗜热古菌(s.solfataricus)的cas9蛋白(i-a2型)对应的pam序列为5
’‑
tcn，与来自h.walsbyl的cas9蛋白(i-b型)对应的pam序列为5
’‑
ttc，与来自大肠杆菌(e.coli)的cas9蛋白(i-e型)对应的pam序列为5
’‑
awg，与来自大肠杆菌的cas9蛋白(i-f型)对应的pam序列为5
’‑
cc，与来自绿脓杆菌(p.aeruginosa)的cas9蛋白(i-f型)对应的pam序列为5
’‑
cc，与来自嗜热链球菌(s.thermophilus)的cas9蛋白(ii-a型)对应的pam序列为5
’‑
nnagaa，与来自无乳链球菌(s.agalactiae)的cas9蛋白(ii-a型)对应的pam序列为5
’‑
ngg，与来自金黄色葡萄球菌
(s.aureus)的cas9蛋白对应的pam序列为5
’‑
ngrrt或5
’‑
ngrrn，与来自脑膜炎奈瑟菌(n.meningitidis)的cas9蛋白对应的pam序列为5
’‑
nnnngatt，与来自齿垢密螺旋体(t.denticola)的cas9蛋白对应的pam序列为5
’‑
naaaac。
[0095]
引导rna具有参与基因组dna与靶位点结合的序列(有时也被称为crrna(crispr rna)序列)，该crrna序列能够通过与除了非靶链的pam序列互补序列以外的序列互补地(优选互补且特异性地)结合、从而使引导rna结合于基因组dna的靶位点。
[0096]
需要说明的是，“互补地”结合不仅包括基于完全互补关系(a与t及g与c)进行结合的情况，还包括基于能够在严格条件下进行杂交的程度的互补关系进行结合的情况。严格条件如berger and kimmel(1987,guide to molecular cloning techniques methods in enzymology,vol.152,academic press,san diego ca)所示可以基于复合体或结合探针的核酸的熔解温度(tm)来确定。例如，作为杂交后的洗涤条件，通常可列举“1
×
ssc、0.1％sds、37℃”左右的条件。优选即使在所述条件下洗涤也维持杂交状态。虽然没有特别限制，但作为更严苛的杂交条件，可列举“0.5
×
ssc、0.1％sds、42℃”左右的洗涤条件，作为进一步严苛的杂交条件，可列举“0.1
×
ssc、0.1％sds、65℃”左右的洗涤条件。
[0097]
具体而言，crrna序列中与靶序列结合的序列与靶链具有例如90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上、进一步优选为99％以上、特别优选为100％的一致性。需要说明的是，据称对于引导rna与靶位点的结合而言crrna序列中与靶序列结合的序列的3’侧的12个碱基很重要。因此，当crrna序列中与靶序列结合的序列与靶链不完全相同时，优选与靶链不同的碱基存在于crrna序列中与靶序列结合的序列的3’侧的12个碱基以外。
[0098]
引导rna具有参与与cas蛋白的结合的序列(有时也被称为tracrrna(trans-activating crrna)序列)，该tracrrna序列能够通过与cas蛋白结合而将cas蛋白诱导至基因组dna的靶位点。
[0099]
tracrrna序列没有特别限制。tracrrna序列典型情况下为由能够形成多个(通常为3个)茎环的50～100碱基长左右的序列构成的rna，其序列根据所利用的cas蛋白的种类而不同。作为tracrrna序列，可根据所利用的cas蛋白的种类采用各种公知序列。
[0100]
引导rna通常包括上述的crrna序列和tracr rna序列。引导rna的形态可以是包含crrna序列和tracr rna序列的单链rna(sgrna)，也可以是包含crrna序列的rna与包含tracrrna序列的rna互补结合而成的rna复合体。
[0101]
cas蛋白表达盒只要是以在代谢改善对象的生物内表达cas蛋白的目的使用的多核苷酸就没有特别限制。作为该表达盒的典型例，可列举包含启动子及在该启动子的控制下配置的cas蛋白编码序列的多核苷酸。需要说明的是，“在启动子的控制下配置”与引导rna表达盒中的定义相同。
[0102]
作为cas蛋白表达盒的启动子，没有特别限制，可以使用例如各种pol ii系启动子，作为pol ii系启动子，没有特别限制，可列举例如cmv启动子、ef1启动子、sv40启动子、mscv启动子、htert启动子、β肌动蛋白启动子、cag启动子等。另外，也可以使用能够通过药剂来诱导的各种启动子。
[0103]
cas蛋白编码序列只要是编码cas蛋白的氨基酸序列的碱基序列就没有特别限制。
[0104]
cas蛋白只要是在crispr/cas系统中使用的cas蛋白就没有特别限制，例如，可以使用各种能够以与引导rna形成了复合体的状态结合于基因组dna的靶位点、从而切割该靶
位点的cas蛋白。作为cas蛋白，已知来自各种生物的cas蛋白，可列举例如来自酿脓链球菌(s.pyogenes)的cas9蛋白(ii型)、来自嗜热古菌(s.solfataricus)的cas9蛋白(i-a1型)、来自嗜热古菌(s.solfataricus)的cas9蛋白(i-a2型)、来自h.walsbyl的cas9蛋白(i-b型)、来自大肠杆菌的cas9蛋白(i-e型)、来自大肠杆菌的cas9蛋白(i-f型)、来自绿脓杆菌(p.aeruginosa)的cas9蛋白(i-f型)、来自嗜热链球菌(s.thermophilus)的cas9蛋白(ii-a型)、来自无乳链球菌(s.agalactiae)的cas9蛋白(ii-a型)、来自金黄色葡萄球菌(s.aureus)的cas9蛋白、来自脑膜炎奈瑟菌(n.meningitidis)的cas9蛋白、来自齿垢密螺旋体(t.denticola)的cas9蛋白、来自新凶手弗朗西斯菌(f.novicida)的cpf1蛋白(v型)等。这些中，可优选列举cas9蛋白，更优选列举属于链球菌属的细菌所内源具有的cas9蛋白。各种cas蛋白的氨基酸序列及其编码序列的信息可以由ncbi等各种数据库容易地得到。
[0105]
cas蛋白可以为野生型的双链切割型cas蛋白，也可以为切口酶型cas蛋白。另外，cas蛋白可以在不损害其活性的限度内具有氨基酸序列的突变(例如置换、缺失、插入、添加等)，也可以添加有公知的蛋白质标签、信号序列、酶蛋白等蛋白质。作为蛋白质标签，可列举例如生物素、his标签、flag标签、halo标签、mbp标签、ha标签、myc标签、v5标签、pa标签等。作为信号序列，可列举例如细胞质转移信号等。
[0106]
eros基因编辑用载体也可以具有其它序列。作为其它序列，没有特别限制，可以采用各种可包含于表达载体的公知序列。作为这样的序列的一例，可列举例如复制起点、药剂抗性基因等。
[0107]
作为药剂抗性基因，可列举例如氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、新霉素抗性基因、红霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。
[0108]
载体的种类没有特别限制，可列举例如：动物细胞表达质粒等质粒载体；逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、仙台病毒等病毒载体；农杆菌载体等。
[0109]
eros基因编辑剂可以按照公知的基因工程方法容易地制作。例如，可以利用pcr、限制酶切割、dna连接技术、体外转录/翻译技术、重组蛋白制作技术等来制作。
[0110]
2-2-2.eros表达促进剂
[0111]
eros表达促进剂只要能够增加细胞中的eros量就没有特别限制。
[0112]
作为eros表达促进剂，可列举例如eros的表达盒。eros的表达盒只要以能够表达的状态整合有eros就没有特别限制。典型情况下，eros的表达盒包含含有启动子序列及eros编码序列(根据需要还包含转录终结信号序列)的多核苷酸。表达盒可以为载体的形态。
[0113]
表达载体没有特别限制，可列举例如：动物细胞表达质粒等质粒载体；逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、仙台病毒等病毒载体等。
[0114]
启动子没有特别限制，可列举例如cmv启动子、ef1启动子、sv40启动子、mscv启动子、htert启动子、β肌动蛋白启动子、cag启动子等。另外，也可以使用能够通过药剂诱导的各种启动子。
[0115]
表达载体中除了上述以外还可以包含可包含于表达载体的其它元件。作为其它元件，可列举例如复制基点、药剂抗性基因等。药剂抗性基因没有特别限制，可列举例如氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、新霉素抗性基因、红霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、卡那
霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。
[0116]
eros的表达载体可以按照公知的基因工程方法容易地得到。例如可以利用pcr、限制酶切割、dna连接技术等来制作。
[0117]
作为eros表达促进剂的其它例子，可列举eros转录活化因子及其表达载体、能够活化eros转录的低分子化合物等。表达载体的形态与上述eros的表达载体相同。
[0118]
2-3.eros功能调节剂
[0119]
eros功能调节剂只要能够调节在p2x7受体的表达调节对象的生物或细胞内表达的eros蛋白或eros mrna的功能就没有特别限制，包括例如eros功能抑制剂、eros功能促进剂等。eros功能调节剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
[0120]
作为eros功能调节剂，只要能够使分子伴侣活性、特别是对p2x7受体的分子伴侣活性下降就没有特别限制。
[0121]
作为eros功能调节剂，可列举例如eros中和抗体等。eros中和抗体是指：具有通过与eros结合来抑制eros所具有的分子伴侣活性的性质的抗体。
[0122]
抗体包括：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、或者fab片段或由fab表达文库生成的片段等具有抗原结合性的上述抗体的一部分。对eros的氨基酸序列中的至少连续的通常8个氨基酸、优选15个氨基酸、更优选20个氨基酸所构成的多肽具有抗原结合性的抗体也包括在本发明的抗体中。
[0123]
从能够更可靠地发挥中和活性的观点出发，抗体优选为对eros的与p2x7受体的结合位点的氨基酸序列具有抗原结合性的抗体。结合位点可基于公知信息来确定和/或基于公知信息进行推测(例如通过对接模型构建等)。
[0124]
这些抗体的制造方法已经众所周知，本发明的抗体也可以按照这些常规方法来制造(current protocols in molecular biology,chapter11.12～11.13(2000))。具体而言，在本发明的抗体为多克隆抗体的情况下，可以使用按照常规方法在大肠杆菌等中表达并纯化的eros或者按照常规方法合成具有该eros的部分氨基酸序列的寡肽，免疫于家兔等非人动物，从该免疫动物的血清中依据常规方法而得到。另一方面，在单克隆抗体的情况下，可以将按照常规方法在大肠杆菌等中表达并纯化的eros或具有eros的部分氨基酸序列的寡肽免疫于小鼠等非人动物，使得到的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，从由此制备的杂交瘤细胞中得到(current protocols in molecular biology edit.ausubel et al.(1987)publish.john wiley and sons.section 11.4～11.11)。另外，还可以获得多种抗体，例如已知有abcam公司销售的anti-eros抗体ab150936、atlas antibodies公司的anti-c17orf62抗体hpa045696等。
[0125]
制作抗体时作为免疫抗原使用的eros可以基于公知的基因序列信息并利用dna克隆、各质粒的构建、向宿主中的转染、转化体的培养及从培养物中回收蛋白质的操作得到。这些操作可以基于本领域技术人员已知晓的方法或文献记载的方法(molecular cloning,t.maniatis et al.,csh laboratory(1983),dna cloning,dm.glover,irl press(1985))等来进行。
[0126]
具体而言，制作能在期望的宿主细胞中表达编码eros的基因的重组dna(表达载体)，将其导入到宿主细胞中进行转化，培养该转化体，从得到的培养物中回收目标蛋白质，由此能够得到作为用于制造本发明抗体的免疫抗原的蛋白质。另外，eros的部分肽也可以
按照公知的基因序列信息通过一般的化学合成法(肽合成)来制造。
[0127]
另外，本发明的抗体可以使用具有eros的部分氨基酸序列的寡肽来制备。用于制造所述抗体的寡(多)肽不需要具有功能性生物活性，但是期望具有与eros相同的免疫原特性。可优选例示具有该免疫原特性且由eros的氨基酸序列中至少连续的8个氨基酸、优选15个氨基酸、更优选20个氨基酸构成的寡(多)肽。
[0128]
针对所述寡(多)肽的抗体的制造也可以通过根据宿主而使用各种佐剂以提高免疫学反应来进行。并非进行限定，这样的佐剂包括弗氏佐剂、氢氧化铝之类的矿物凝胶、以及溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白及二硝基苯酚之类的表面活性物质、bcg(卡介菌)、短小棒状杆菌等人佐剂。
[0129]
作为eros功能调节剂，除了上述eros中和抗体以外还可使用eros拮抗剂、eros激动剂、eros显性负突变体等。另外，在采用中和抗体等蛋白质作为eros功能调节剂时，也可以采用其表达盒来代替。关于表达盒，与上述“2-2.eros表达调节剂”中的定义相同。
[0130]
2-4.用途、其它成分
[0131]
如后述实施例所说明的那样，作为定位于囊泡膜的膜蛋白的eros是p2x7同源三聚体的稳定表达所不可或缺的伴侣分子，与囊泡中合成的p2x7发生物理性相互作用，从而发挥功能。eros-p2x7相互作用受损的细胞中，p2x7难以适当折叠，p2x7表达量显著减少。另一方面，表达较多eros的细胞中，p2x7的适当折叠得到促进，p2x7的总量及细胞膜上的表达量增加。
[0132]
因此，选自由eros表达调节剂及eros功能调节剂组成的组中的至少一种(有效成分)具有p2x7受体表达调节作用，因此能够作为p2x7受体表达调节剂(例如药物、试剂以及食品组合物、口腔用组合物、健康增进剂、营养辅助剂(补充剂等)等)的有效成分来利用。有效成分可以直接或与惯用成分一起制成各种组合物，可以应用(例如给药、摄取、接种等)于动物、人及各种细胞。
[0133]
本发明的调节剂可以用于与p2x7受体调节有关的各种现象的调节。例如，本发明的调节剂能够通过抑制eros表达和/或功能来抑制p2x7受体表达，由此能够抑制il-1β的产生。例如，本发明的调节剂能够通过抑制eros表达和/或功能来抑制p2x7受体表达，由此能够预防或改善炎症(没有特别限制，在一个方式中为一氧化氮非依赖性炎症)、疼痛等，更具体而言例如关节风湿病、变形性关节炎、间质性膀胱炎、间质性纤维化、银屑病、败血症性休克、败血症、过敏性皮炎、哮喘、过敏性哮喘、轻度～重度哮喘、类固醇抵抗型哮喘、特发性肺纤维化、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、气道过敏症、急性及慢性疼痛、神经性疼痛、炎症痛、偏头痛、自发性疼痛、阿片类药物诱发的疼痛、糖尿病性神经病变、疱疹后神经痛、腰痛、化学疗法诱发的神经性疼痛、纤维肌痛、神经性疼痛、情绪障碍、重度抑郁、重度抑郁障碍、难治性抑郁、双向情感障碍、焦虑抑郁、焦虑症、痴呆、睡眠障碍、多发性硬化、癫痫发作、帕金森病、精神分裂症、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、自闭症、脊髓损伤、脑缺血/外伤性脑损伤、应激相关障碍、糖尿病、真性糖尿病、血栓症、炎症性肠病、过敏性肠病、肠易激综合征、克罗恩病、心血管疾病(作为心血管疾病的例子，有高血压、心肌梗塞、缺血性心脏病、缺血等)、尿路梗阻、下尿路综合征、下尿路功能异常(例如失禁等)、心脏移植后疾病、骨质疏松/大理石骨病、与外分泌腺的分泌功能有关的疾病、青光眼、肾炎、肾小球肾炎、恰加斯病、衣原体感染症、神经母细胞瘤、结核、多发性嚢性肾病、癌症、痤疮等。另外，作
为其它例子，本发明的调节剂通过促进eros表达和/或功能而能够促进p2x7受体表达，由此能够促进记忆t细胞的分化和/或维持。
[0134]
本发明的调节剂的对象细胞的细胞种类只要是能够产生p2x7受体(外源性或内源性)的细胞种类就没有特别限定，可列举例如免疫细胞(t细胞等)、血管内皮细胞、内皮前体细胞、干细胞(例如来自骨髓的细胞、来自脂肪组织的干细胞、间充质干细胞、多能干细胞(ips细胞、es细胞等)等)、肌细胞(骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞)、肌肉祖细胞(例如心肌祖细胞、成肌细胞等)、神经细胞等。
[0135]
本发明的调节剂的对象生物没有特别限定，可列举例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、猫、兔、猪、马、牛、绵羊、山羊、鹿等各种哺乳类动物等。
[0136]
本发明的调节剂的形态没有特别限定，可以根据本发明的调节剂的用途采取各用途中通常使用的形态。
[0137]
作为形态，在用途为药物、健康增进剂、营养辅助剂(补充剂等)等的情况下，可列举例如片剂(包括口腔内崩解片、咀嚼片、发泡片、含片剂、软糖剂等)、丸剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、干糖浆剂、液剂(包括饮料剂、悬浮剂、糖浆剂)、凝胶剂等适合于经口摄取的制剂形态(经口制剂形态)；点鼻剂、吸入剂、肛门栓剂、插入剂、灌肠剂、凝胶剂、注射剂、贴剂、洗剂、霜剂等适合于非经口摄取的制剂形态(非经口制剂形态)。
[0138]
作为形态，在用途为食品组合物的情况下，可列举液状、凝胶状或固体状的食品，例如果汁、清凉饮料、茶、汤、豆乳、色拉油、调味汁、酸奶、果冻、布丁、拌饭素(furikake)、婴幼儿奶粉、蛋糕粉(cake mix)、粉末状或液状的乳制品、面包、曲奇等。
[0139]
作为形态，在用途为口腔用组合物的情况下，可列举例如液体(溶液、乳液、悬浮液等)、半固体(凝胶、霜、糊等)、固体(片剂、粒子状剂、胶囊剂、薄膜剂、混炼物、熔融固体、蜡状固体、弹性固体等)等任意的形态，更具体而言，可列举洁牙剂(牙膏、液体牙膏、液状牙膏、牙粉等)、漱口剂、涂布剂、贴剂、口中清凉剂、食品(例如口香糖、片状糖果、糖果、橡皮糖、薄膜、含片等)等。
[0140]
本发明的调节剂可以根据需要进一步包含其它成分。作为其它成分，例如，只要是可配合于药物、食品组合物、口腔用组合物、健康增进剂、营养辅助剂(补充剂等)等的成分就没有特别限定，可列举例如基剂、载体、溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、增稠剂、保湿剂、着色料、香料、螯合剂等。
[0141]
本发明的调节剂的有效成分的含量被有效成分的种类、用途、使用方式、适用对象、适用对象的状态等左右，没有限定，例如，可以设为0.0001～100重量％，优选设为0.001～50重量％。
[0142]
本发明的调节剂的应用(例如给药、摄取、接种等)量只要为表现出药效的有效量就没有特别限定，通常以有效成分的重量计一般为每天0.1～1000mg/kg体重。上述给药量优选以1天1次或分成2～3次来进行给药，可根据年龄、病情、症状而适宜增减。
[0143]
3.细胞
[0144]
本发明的一个方式涉及导入有本发明的调节剂的细胞(本说明书中，有时也表示为“本发明的细胞”。)。
[0145]
如上所述，本发明的调节剂在其一个方式中可以通过促进eros表达和/或功能而促进记忆t细胞的分化和/或维持。因此，含有选自由eros表达促进剂及eros功能促进剂组
成的组中的至少一种的本发明的细胞为t细胞(本发明的t细胞)的情况下，可以适合作为car-t疗法中使用的t细胞来利用。
[0146]
从避免治疗后car-t细胞长期残留在患者体内的观点出发，本发明的t细胞优选为能够以使eros表达和/或eros功能一过性增强的方式进行调节的细胞。作为这样的调节方法，例如，通过使用利用药剂响应性启动子进行表达调节的表达盒作为eros表达和/或eros功能的促进剂，从而可通过该药剂的添加使eros表达和/或eros功能一过性增强。
[0147]
另外，从同样的观点出发，本发明的t细胞优选进一步被导入有含有选自由eros表达抑制剂及eros功能抑制剂组成的组中的至少一种的本发明的调节剂。由此，例如能够以下述方式来调节：在通过利用药剂响应性启动子而使eros表达和/或eros功能一过性增强后，抑制eros表达和/或eros功能。
[0148]
实施例
[0149]
以下，基于实施例详细地说明本发明，但是本发明不受这些实施例的限定。
[0150]
材料和方法
[0151]
以下的各试验例中进行的各实验的材料及方法只要没有特别限制则通过以下所示的方法来进行。
[0152]
材料和方法1.细胞株、质粒、抗体及试剂
[0153]
使小鼠wr19l细胞(atcc tib-52)在补充了10％fcs的rpmi1640中增殖。将人thp-1细胞(atcc tib-202)在添加有10％fcs及55μm的β-巯基乙醇的rpmi1640中培养。使hek293t细胞(atcc crl-1573)在含有10％fcs的dmem中增殖。
[0154]
pnef-bos载体来自于从psv2-neo(nature 302,1983:340-342.)导入了sv40早期启动子驱动新霉素抗性基因的pef-bos(nucleic acids res.18,1990:5322.)。lenticas9-blast载体(nat.meth.11,2014:783-784.)、小鼠crispr敲除库(gecko v2)(nat.meth.11,2014:783-784.)以及px330及px459v2质粒(nat.protoc.8,2013:2281-2308.)由addgene获得。pcmv-vsv-g-rsv-rev及pcmv-vsv-g(j.virol.72,1998:8150-8157.)由riken bioresource center提供。pmxspuro逆转录病毒载体(exp.hematol.31,2003:1007-1014.)及pgag-pol-ires-bsr包装质粒(gene ther.7,2000:1063-1066.)由东京大学医学部获得。padvantage及plvsin-ef-1α慢病毒载体分别购自thermo fisher scientific及takara bio。
[0155]
alexa 488结合大鼠抗小鼠p2x7 mab(克隆hano 43)从bio-rad获得。hrp小鼠抗flag m2 mab、抗flag m2结合磁珠及3
×
flag肽由merck获得。hrp-兔抗gfp ab由medical&biological laboratories获得。hrp小鼠抗ha mab(克隆16b12)由biolegend获得。兔抗p2x7 ab由alomone labs获得。hrp山羊抗兔igab由agilent technologies获得。2’(3’)-o-(4-苯甲酰苯甲酰)腺苷5
’‑
三磷酸(bzatp)及atp分别购自wako pure chemical及nacalai tesque。o,o
’‑
双(2-氨基苯基)乙二醇-n,n,n’,n
’‑
四乙酸、四乙酰氧基甲酯(bapta-am)及1-[2-氨基-5-(2,7-二氟)-6-乙酰氧基甲氧基-3-氧代-9-占吨基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-n,n,n’,n
’‑
四乙酸、四(乙酰氧基甲基)酯(fluo 4-am)由dojindo获得。cy5标记膜联蛋白v由
バイオビジョン
公司获得。离子霉素及碘化丙啶(pi)由默克获得。sytox blue、yo-pro-1及hoechst33342由thermo fisher scientific获得。1-油酰基-2-{6-[(7-硝基-2-1,3-苯并二唑-4-基)氨基]己酰基}-甘油-3-磷酸胆碱(nbd-pc)由
pro-1的摄入(j.biol.chem.272,1997:5482-5486.)。即，将1.3
×
106个细胞在与包含4μm的yo-pro-1、500nm的sytox蓝及1mm的atp的650μl的膜联蛋白缓冲液混合而成的650μl的膜联蛋白缓冲液中在4℃下预孵育10分钟。然后在4℃下孵育，用facscanto
tm
ii进行分析。
[0162]
为了监视细胞内ca
2
，将7
×
105个细胞与hepes/nacl缓冲液[10mm hepes-naoh(ph7.5)及140mm nacl]中的1.4ml的4μm fluo4-am一起在25℃下孵育15分钟，洗涤。在350μl的hepes/nacl缓冲液中在25℃下孵育15分钟，然后在4℃下冷却10分钟。接着，将细胞悬浮液的150μl与含有5mm cacl2、500nm sytox blue及1mm atp的等体积的hepes/nacl缓冲液混合，在4℃下孵育5分钟，利用流式细胞术(使用facscanto
tm
ii)进行分析。
[0163]
材料和方法4.共聚焦显微镜
[0164]
将稳定表达mp2x7k-egfp、meros-egfp及meros-mcherry的细胞用补充了2％fcs(hbss/fcs)的hank’s平衡盐类溶液洗涤，悬浮于含有5μg/ml hoechst 33342或5μm draq5的hbss/fcs中。将细胞播种于玻璃底皿(matsunami)，利用ix81共聚焦荧光显微镜(olympus)进行观察。
[0165]
材料和方法5.小鼠p2x7a及p2x7k的rt-pcr
[0166]
一些小鼠组织表达p2x7的2个剪接变异体、p2x7a及p2x7k，它们使用不同的外显子1(j.biol.chem.284,2009:25813-25822.)。为了确定wr19l细胞中表达哪种突变体，使用rneasy迷你试剂盒(mini kit)(qiagen)由wr19l细胞及c57bl/6j小鼠的腹腔常驻巨噬细胞制备总rna，使用superscript iii逆转录酶(thermo fisher scientific)或大容量rna-tocdna试剂盒(thermo fisher scientific)进行逆转录。将互补dna供于使用primestar gxl dna聚合酶(takara bio)及以下引物的pcr：特异性正向引物、对于mp2x7a为外显子1上的5
’‑
tttttaattaagccaccatgccggcttgctgcagctg-3’(序列号6)，对于mp2x7k为外显子1上的5
’‑
tttttaattaagccaccatgctgcccgtgagccac-3’(序列号7)。共通反向引物、外显子13上的5
’‑
aaagaattcgtagggatacttgaagccac-3’(序列号8)。
[0167]
材料和方法6.全基因组的crispr筛选
[0168]
全基因组的crispr筛选按照以前的报道(science 343,2014:84-87.、nat.protoc.12,2017:828-863.)进行。即，用pnef-bos-mp2x7k稳定地转化利用crispr-cas9系统建立的tmem16f-/-p2x7-/-(dko)wr19l细胞，从而生成dko-wr19l-mp2x7k细胞。通过对hek293t细胞转染lenticas9-blast、pcag-hivgp及pcmv-vsv-g-rsv-rev而制作携带cas9-flag的慢病毒载体，用于感染dko-wr19l-mp2x7k细胞。在10μg/ml杀稻瘟菌素s存在下筛选转化体，利用使用抗flag的蛋白质印迹鉴定表达cas9-flag的克隆。针对sgrna文库的慢病毒如下制作：使17μg的gecko v2文库(a b)dna、8μg的pcag-hivgp及5μg的pcmv-vsv-g-rsv-rev转染于hek293t细胞(1
×
107)，通过6000
×
g、16小时的离心分离在4℃下进行浓缩，由此而制作。使用该病毒以0.3的m.o.i.感染dko-wr19l-mp2x7k/cas9细胞。即，对于4
×
105个细胞/孔的48孔板中的2
×
107个细胞，在10μg/ml聚凝胺存在下在30℃下以700
×
g旋转感染1小时。接着，将细胞在包含1μg/ml的嘌呤霉素及800μg/ml的g418的培养基中稀释3次，传代1次，培养4天。接着，将细胞在无抗生素的条件下培养2天，期间将细胞以4倍稀释传代1次。
[0169]
将得到的dko-wr19l-mp2x7k/cas9/gecko细胞(3
×
107)用pbs洗涤，重悬浮于2ml的膜联蛋白缓冲液中，在4℃下冷却10分钟。接着，将含有180μm的bzatp的1ml冷却膜联蛋白
缓冲液添加到细胞中，将混合物在4℃下孵育5分钟。用冷却的膜联蛋白缓冲液稀释15倍后，将细胞在4℃下以300
×
g离心分离3分钟而进行收集，悬浮于含有1000倍稀释的cy5标记膜联蛋白v及2.5μg/ml pi的3ml膜联蛋白缓冲液中，用facsaria
tm
ii进行细胞筛选。收集具有最低的膜联蛋白v信号(约0.8％)的细胞群体，在800μg/ml的g418存在下培养3天，在g418不存在下培养2天。将该步骤(利用bzatp的刺激、ptdser-low表达细胞的筛选及增殖)进行3次。
[0170]
使用qiaamp dna迷你试剂盒(qiagen)，由第3次筛选细胞制备基因组dna，利用使用primestar gxl dna聚合酶及以下所示的引物的pcr对携带sgrna序列的整合后的慢病毒dna的一部分进行扩增。引物序列如下：5
’‑
aatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcg-3’(序列号9)及
’‑
ctttagtttgtatgtctgttgctattatgtctactattctttcc-3’(序列号10)。然后，将pcr产物供于primestar hs dna聚合酶(takara bio)、使用正向引物(ngs-lib-fwd-1～10)(nat.protoc.12、2017:828-863.)与共通反向引物(5
’‑
caagcagaagacggcatacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttctactattctttcccctgcactgt-3’(序列号11))的混合物的结合用于下一代测序(ngs)的接头序列的pcr。将得到的pcr产物用旋转柱(promega)纯化，用quant-it picogreen dsdna检测试剂盒(thermo fisher scientific)定量，使用miseq试剂盒v3(illumina)，用miseq(illumina)通过ngs进行分析。将得到的读数与sgrna序列匹配后，使用由amelieff co.定制的软件计算各唯一sgrna的存在量。
[0171]
材料和方法7.全细胞溶解物及膜级分的制备
[0172]
使细胞在包含1％np-40、150mm nacl及蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(complete、无edta、roche)的50mm tris-hcl缓冲液(ph 7.5)中在4℃下旋转1小时，由此制备全细胞溶解物。通过在4℃、20000
×
g下离心分离20分钟，由此除去不溶性物质。
[0173]
为了由wr19l细胞制备膜级分，将2.5
×
107个细胞用pbs洗涤，接着在2.7ml的溶液a[10mm tris-hcl(ph 7.5)及1mm(对脒基苯基)甲烷磺酰氟盐酸盐(p-apmsf)]中使用dounce匀浆机在冰上进行匀浆。将2.7ml的溶液b[10mm tris-hcl(ph7.5)、500mm蔗糖、100mm kcl、10mm mgcl2及1mm p-apmsf]添加到匀浆物中后，在4℃下通过800
×
g下10分钟及8000
×
g下10分钟的连续离心分离除去核及线粒体。接着，通过100000
×
g下60分钟的离心分离使膜级分沉淀，悬浮于含有1％正十二烷基-β-d-吡喃麦芽糖苷(ddm)、50mm kcl、1mm mgcl2、10％甘油、1mm p-apmsf及蛋白酶抑制剂混合物(complett、无edta)的20mm tris-hcl缓冲液(ph 7.5)600μl中。使悬浮液通过29g针而均质化，在4℃下旋转2小时而可溶化。通过20000
×
g、20分钟的离心分离除去不溶物，将其上清作为粗膜级分。
[0174]
为了由thp-1细胞制备膜级分，将1.3
×
107个细胞用120ng/ml的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(pma)处理3天，进一步在无pma的条件下培养3天。用pbs洗涤后，用细胞刮刀收集细胞，悬浮于2.5ml的溶液a中。将细胞用超声波液体处理装置(q55、qsonica)溶解。添加2.5ml的溶液b后，如上述那样制备膜级分，在含有1％np-40、150mm nacl及蛋白酶抑制剂混合物(complete、无edta)的50mm tris-hcl缓冲液(ph 7.5)200μl中可溶化。
[0175]
材料和方法8.免疫沉淀、sds-page、bn-page及蛋白质印迹
[0176]
为了使mp2x7-meros复合体进行免疫沉淀，将来自表达mp2x7-flag及meros-egfp的wr19l细胞转化体的500μl粗膜溶解物(60μg蛋白质)与10μl(床体积)的抗flag m2磁珠一起孵育一晚。用含有0.05％ddm、50mm kcl、1mm mgcl2及10％甘油的1ml的20mm tris-hcl缓
冲液(ph 7.5)洗涤3次后，将珠上结合的蛋白质用含有150μg/ml的3
×
flag肽、1％ddm、50mm kcl、1mm mgcl2及10％甘油的100μl的20mm tris-hcl缓冲液(ph 7.5)洗脱。
[0177]
为了进行sds-page，将全细胞溶解物或粗膜溶解物在sds试样缓冲液[62.5mm tris-hcl(ph 6.8)、2％sds、10％甘油、2.5％β-巯基乙醇及0.005％溴酚蓝]中在室温下孵育1小时，通过利用7.5％聚丙烯酰胺凝胶(
ナカライテスク
)的电泳进行分离。使用precision plus蛋白质双色标准品(protein dual color standards)(
バイオラッド
)作为分子量标记。bn-page中，将样品与native page(注册商标)样品缓冲液(4x)及native page(注册商标)5％g-250样品添加剂(20x)混合，上样到native page(注册商标)novex 4-16％bistris凝胶(thermo fisher scientific)中。在4℃下、150v下电泳35分钟后，使电泳缓冲液中的cbb g-250的浓度从0.02％变成0.002％，将试样进一步在150v下25分钟、250v下30分钟、然后350v下20分钟的条件下连续地供于电泳。使用nativemark(注册商标)未染色蛋白质标准品(unstained protein standard)(thermo fisher scientific)作为分子量标记。
[0178]
为了进行蛋白质印迹，在sds-page后即刻、或在sds-page电泳缓冲液[25mm tris-hcl(ph 8.3)、192mm甘氨酸及0.1％sds]中在室温下将bn-page凝胶孵育15分钟后即刻，将凝胶中的分离出的蛋白质转移到pvdf膜(millipore)上。将膜用5％脱脂乳封闭，用hrp标记抗体进行探测，接着用immobilon western化学发光hrp底物(merck)进行检测。作为上样对照，用cbb r-250对pvdf膜上的蛋白质进行染色。
[0179]
材料和方法9.il-1βelisa
[0180]
将thp-1细胞用pma处理而促进它们向巨噬细胞的分化，然后由以前的报道(immunity 15,2001:825-835.、plos one 5,2010:e8668.)中记载的方法略微修正来实施atp诱导性的il-1β分泌。即，在24孔板中，将密度为2.5
×
105个细胞/孔的thp-1细胞在含有10％fcs及120ng/ml的pma的rpmi1640中培养3天。除去pma，将细胞进一步在rpmi1640-10％fcs中培养2天，进一步在含有100ng/ml的lps的相同培养基中培养一晚。接着，将细胞用rpmi1640-10％fcs中的1～3mm atp刺激5小时。将培养液在4℃、20000
×
g下离心分离15分钟，用elisa试剂盒(quantikine elisa human il-1β/il-1f2、r&d systems)对上清中的il-1β进行定量。
[0181]
结果
[0182]
试验例1.依赖于p2x7但不依赖于tmem16f的ptdser暴露
[0183]
本试验例的分析按照上述的“材料和方法3”来进行。本试验例的结果如图1所示。图1a的具体的分析概要及条件等如下：在25μm的bapta-am存在下或不存在下在25℃下预孵育15分钟后，将wr19l细胞为未处理状态、或者使用3μm的离子霉素或300μm的bzatp在20℃下刺激5分钟。接着，将细胞在2.5μg/ml的pi存在下用cy5标记膜联蛋白v染色，利用流式细胞术进行分析。示出pi阴性群体中的膜联蛋白v染色。另外，图1b的具体的分析概要及条件等如下：将野生型tmem16f-/-(16f-/-)、p2x7-/-及16f-/-p2x7-/-(dko)wr19l细胞如上述那样用离子霉素或bzatp刺激，用膜联蛋白v及pi染色。然后利用流式细胞术进行分析。
[0184]
以往报道(nat.commu.6,2015:6245-6210.)中，报道了p2x7-诱发ptdser-暴露由ca
2
依赖性爬行酶、tmem16f介导。因此，使用来自wr19l t细胞白血病的小鼠细胞株调查了该可能性。用3μm的离子霉素在20℃下刺激后的wr19l细胞在5分钟以内暴露了ptdser(图1a
及图1b)。如以前所报道的那样(j.biol.chem.288,2013:13305-13316.)，该ptdser暴露可以通过将细胞内ca
2
用25μmbapta-am进行螯合而被完全抑制(图1a)，并且在tmem16f-/-(16f-/-)wr19l细胞中未观察到该现象(图1b)。将wr19l细胞用作为p2x7激动剂的300μm bzatp(blood97,2001:587-600.)在20℃下处理5分钟时，强烈暴露ptdser(图1a)。如预想那样，bzatp在p2x7-/-wr19l细胞中未诱导ptdser暴露(图1b)。但是，与以往报道(nat.commu.6,2015:6245-6210.)中的提案形成对照的是，tmem16f缺损突变几乎不影响bzatp诱导ptdser暴露(图1b)。而且，即使将wr19l细胞与bapta-am一起进行预孵育，也不影响bzatp诱导ptdser暴露(图1a)，认为具有ca
2
依赖性紊乱活性的其它tmem16家族成员可能不参与该过程。本发明人由这些结果得到如下结论：wr19l细胞中的p2x7诱导ptdser暴露与tmem16f介导磷脂紊乱无关地进行。
[0185]
试验例2.支持p2x7介导的ptdser暴露的分子的筛选
[0186]
本试验例的分析与上述的“材料和方法3”、“材料和方法5”及“材料和方法6”来进行。本试验例的结果如图2所示。图2a的具体的分析概要及条件等如下：利用rt-pcr在来自小鼠腹腔常驻巨噬细胞(rpmac)及wr19l细胞的rna中检测p2x7a及p2x7k同种型的转录物。p2x7a及p2x7k同种型是通过使用不同的第一外显子(外显子1及外显子1’)而生成的。第一外显子上的正向引物对于各同种型有特异性，另一方面，外显子13上的反向引物是共通的。图2b的具体的分析概要及条件等如下：将16f-/-、dko及dko-mp2x7k细胞用alexa488-anti-p2x7 ab染色，通过流式细胞术进行分析。另外，将16f-/-、dko及dko-mp2x7k在20℃下用所示浓度的bzatp处理5分钟，用cy5标记膜联蛋白v染色，通过流式细胞术进行分析。实验进行3次，将pi阴性群体中的膜联蛋白v阳性细胞的平均比例与s.d.一起进行作图。图2c的具体的分析概要及条件等如下：在最初的步骤中，将dko-wr19l-mp2x7k细胞用cas9及crispr文库转化，将降低了对bzatp诱导ptdser暴露的活性的细胞群体进行3次分取(分选)。在第二阶段，对来自这些筛选出的细胞的dna进行深度测序，对读取的序列进行处理而确定各sgrna的存在量。将原始细胞及第3次分选后的细胞以未刺激的状态或在用bzatp刺激后通过流式细胞术进行分析。
[0187]
小鼠(m)p2x7 mrna(biochem.biophys.res.commun.332,2005:17-27.)存在若干种选择性剪接型，其中的两种(p2x7a及p2x7k)在胸腺及脾脏中表达(j.biol.chem.284,2009:25813-25822.、j.cell sci.125,2012:3776-3789.)。为了调查wr19l细胞中表达何种剪接变异体，用p2x7a及p2x7k同种型特异性的rt-pcr对它们的rna进行分析。如以前所报道那样，小鼠巨噬细胞仅表达p2x7a mrna，wr19l细胞主要表达p2x7k同种型(图2a)。为了确认mp2x7k对bzatp诱导ptdser暴露的贡献，使用crispr-cas9系统建立了tmem16f-/-p2x7-/-(dko)-wr19l细胞。如预想那样，dko-wr19l细胞对ca-离子霉素或bzatp无响应(图1b)。将dko-wr19l细胞用mp2x7k(dko-mp2x7k)转化时，在它们的细胞表面上高表达mp2x7k(图2b)，并且使细胞对bzatp诱导ptdser暴露强烈敏感。即，比野生型细胞低3倍的浓度的bzatp对于在tmem16f不存在下活化mp2x7k转化细胞、在20℃下使ptdser暴露5分钟而言是充分的，由此确认tmem16f对于p2x7介导ptdser暴露而言并非必需。
[0188]
为了鉴定p2x7介导ptdser暴露所必需的分子，将dko-mp2x7k细胞供于crispr筛选(science 343,2014:84-87.)(图2c)。在该筛选中，通过有限稀释及细胞筛选鉴定出在4℃下以5分钟对60μm的bzatp响应、强烈且普遍地暴露ptdser的mp2x7k转化体的克隆。将克隆
出的细胞用cas9转化，并且使携带gecko(基因组规模的crispr-cas9敲除)文库的慢病毒以0.3的m.o.i.(感染的多重度)进行感染，从而达到每个宿主细胞少于1个的sgrna保有慢病毒。接着，将细胞在4℃下用60μm bzatp刺激5分钟，通过细胞筛选分离出显著失去暴露ptdser的能力的0.8％群体(图2c)。进一步将对bzatp响应、失去暴露ptdser的能力的细胞的该筛选重复2次。流式细胞术分析表明，在第3次分选后，一些细胞群体对bzatp响应、几乎完全失去了暴露ptdser的能力(图2c)。筛选出的细胞群体的染色体dna的深度测序分析表明用于eros的sgrna(cybc1)得到最大程度的浓缩，这表明eros对于p2x7介导ptdser暴露而言是必要的。
[0189]
试验例3.eros对p2x7介导过程的必要性
[0190]
本试验例的分析按照上述的“材料和方法3”及“材料和方法9”来进行。本试验例的结果如图3所示。图3a的具体的分析概要及条件等如下：将dko-mp2x7k、tko-mp2x7k及tko-mp2x7k/meros细胞用60μm bzatp或500μm atp在4℃下刺激5分钟，用膜联蛋白v染色，通过流式细胞术进行分析。图3b及图3c的具体的分析概要及条件等如下：将dko-wr19l、dko-wr19l-mp2x7k、tko-wr19l-mp2x7k及tko-wr19l-mp2x7k/meros细胞在250nm的nbdpc(b)或2μm的yo-pro-1(c)存在下在4℃下以指定的时间用500μm的atp刺激。确定sytox blue阴性群体中的bsa非提取性nbd-pc或被摄入的yo-pro-1的平均荧光强度(mfi)。将这些实验进行3次，将平均mfi或其相对值(rfi、相对荧光强度)与s.d.一起进行作图。图3d的具体的分析概要及条件等如下：对dko、dko-mp2x7k、tko-mp2x7k及tko-mp2x7k/meros细胞负荷fluo4-am，在4℃下用500μm的atp刺激5分钟。示出sytox blue阴性群体的fluo4荧光谱。图3e的具体的分析概要及条件等如下：用pma处理后，将野生型thp-1、eros-/-、eros-/-heros、p2x7-/-及p2x7-/-hp2x7a细胞与100ng/ml lps在37℃下孵育一晚。接着，在所示浓度的atp存在下培养5小时，利用elisa测定培养基中的il-1β。进行3次实验，将平均值与s.d一起示出。图3f的具体的分析概要及条件等如下：将来自野生型及eros-/-的小鼠的bmdm在100ng/ml lps存在下或不存在下在37℃下孵育3小时，在所示浓度的atp存在下培养6小时。通过elisa测定培养基的il-1β。进行3次实验，将平均值以sd(误差棒)形式示出。
[0191]
为了确认eros参与了p2x7介导ptdser暴露，利用crispr-cas9系统敲除了dko-mp2x7k的eros。得到的细胞株(tko-mp2x7k)对bzatp或atp响应、暴露ptdser的能力显著受损，该障碍通过将细胞用meros转化而完全得到救济(tko-mp2x7k/meros)(图3a)。p2x7不仅介导ptdser暴露，还介导atp诱导性磷脂紊乱、色素摄入、ca
2
流入及il-1β产生。即，若用atp刺激dko-mp2x7k，则磷脂紊乱得到促进，这通过nbd-pc的摄入来分析(图3b)。该活性在tko-mp2x7k细胞中未观察到，通过将这些细胞用eros转化来救济。同样，atp促进了dkomp2x7k细胞中的yo-pro-1的摄入。该效果在tko-mp2x7k中减弱，如果与mp2x7一起用meros转化tko细胞，则yo-pro-1的摄入大幅增加。进一步地，dko细胞对于ca
2
内化没有对atp响应，但dko-mp2x7k细胞很好地对atp响应，利用fluo-4 ca
2
传感器检测的细胞内ca
2
在atp处理后5分钟以内增加(图3d)。该响应在tko-mp2x7k细胞中未观察到，但通过用tko-mp2x7k/meros细胞表达meros来救济。人p2x7与小鼠p2x7具有81.3％的氨基酸序列一致性。如以前所报道的那样(immunity 15,2001:825-835.)，用脂多糖(lps)刺激后的来自人thp-1的巨噬细胞对atp用量依赖性地响应且产生il-1β(图3e)。为了调查eros在该过程中的贡献，通过crispr/cas9系统个别地敲除thp-1细胞中的eros及p2x7基因。如图3e所示，不仅是p2x7缺损突变，
eros缺损突变也完全阻止il-1β的生产，并且该缺陷分别通过表达人(h)p2x7或heros来救济。然后，由野生型及eros-/-小鼠制作bmdm。与以往报道一致，lps处理过的(lps-primed)、野生型bmdm对atp响应而产生il-1β(图3f)。与此相对地，eros-/-bmdm对atp响应而产生il-1β的能力几乎完全消失(图3f)。该结果表明，通过抑制eros能够抑制il-1β的产生。通过il-1β的抑制显示出的效果已广为人知，例如biodrugs(2017)31:207-221等中有记载。
[0192]
由这些结果得到了如下结论：对于小鼠及人细胞中的各种p2x7介导的生物学过程而言，eros是必要的。
[0193]
试验例4.eros对p2x7表达的伴侣样活性
[0194]
本试验例的分析按照上述的“材料和方法3”、“材料和方法4”及“材料和方法8”来进行。本试验例的结果如图4所示。图4a的具体的分析概要及条件等如下：从dko(泳道1)、dko-mp2x7k-flag(泳道2)、tko-mp2x7k-flag(泳道3)及tko-mp2x7k-flag/meros细胞(泳道4)分离细胞可溶物(蛋白质1.5μg)。利用sds-page进行分析，利用使用抗flag ab的蛋白质印迹进行分析。另外，将膜用cbb r-250染色。箭头表示mp2x7的三聚体型及单体型。图4b的具体的分析概要及条件等如下：用pma对野生型(泳道1)、eros-/-(泳道2)、eros-/-heros-ha(泳道3)、p2x7-/-(泳道4)及p2x7-/-hp2x7a-flag细胞(泳道5)进行处理。将粗膜(7.5μg的蛋白质)用1％np-40可溶化，利用sds-page进行分离，利用使用抗p2x7 ab的蛋白质印迹进行分析。另外，将膜用抗na

/k
-atp酶、抗ha或抗flag ab进行探测。箭头表示hp2x7的三聚体型及单体型。图4c的具体的分析概要及条件等如下：将dko、dko-mp2x7k、tko-mp2x7k及tko-mp2x7k/meros细胞用alexa488-抗mp2x7 ab染色。示出sytox blue阴性群体的alexa488染色曲线。图4d及4e的具体的分析概要及条件等如下：将tko wr19l细胞用mp2x7k-egfp和meros、或mp2x7k和meros-egfp(d)、或mp2x7k-egfp和meros-mcherry(e)转化，在5μm draq5或5μg hoechst 33342存在下利用共聚焦显微镜进行观察。egfp、mcherry、draq5及hoechst信号分别用绿色、红色、品红色及蓝色来显示。图4f的具体的分析概要及条件等如下：将来自dko-mp2x7k-flag(泳道1)、tko-mp2x7k-flag(泳道2)及tko-mp2x7k-flag/meros-egfp细胞(泳道3)的粗膜级分(1.2μg蛋白质)用1％ddm可溶化，利用bn-page进行分离，利用使用抗flag(左面板)或抗gfp ab(右面板)的蛋白质印迹进行分析。图4g的具体的分析概要及条件等如下：将来自dko-mp2x7k-flag或tko-mp2x7k-flag/meros-egfp细胞的粗膜(60μg蛋白质)用1％ddm可溶化。用抗flag m2磁珠使flag标签化蛋白免疫沉淀，用3
×
flag肽进行洗脱。将粗膜溶解物(1.5μg蛋白质)(input)及1/16的洗脱物(ip)用bn-page进行分离，利用使用抗gfp(上面板)或抗flag ab(下面板)的蛋白质印迹进行分析。
[0195]
最近公开了eros通过作为伴侣起作用而对于nadph氧化酶亚单元gp91phox及p22phox的稳定表达是必要的(j.exp.med.214,2017:1111-1128.)。为了调查eros是否作为p2x7的伴侣起作用，将带flag标签的mp2x7k导入到dko、tko及tko-meros细胞中，利用使用抗flag抗体的蛋白质印迹评价mp2x7k表达。如图4a所示，在dko细胞中稳定地表达mp2x7k。但是，该表达在tko细胞中显著减少，并且该减少通过将细胞用meros转化来救济。对于thp-1细胞中的内源性hp2x7，也得到了同样的结果。使用抗p2x7 ab的蛋白质印迹中，在来自野生型的膜级分中检测到了75kda及200kda的条带，但在p2x7-/-thp-1细胞中未检测到。这些条带的强度通过将细胞用hp2x7-flag转化而增强(图4b)，表明这些条带与hp2x7的单体型及三聚体型对应。hp2x7的表达由于eros的无效突变而急剧减少，并且该减少通过表达
heros而完全得到救济。
[0196]
然后，使用wr19l细胞调查eros对p2x7的细胞表面表达的必要性。使用抗mp2x7 ab的流式细胞术分析表明，在dko-mp2x7k细胞中以高水平表达mp2x7。与此相对地，tkomp2x7k细胞表面上的mp2x7显著减少，但是这种情况在tko-mp2x7k/meros细胞中完全得到了救济。为了调查mp2x7及meros的定位，使mp2x7k及meros与egfp融合，并分别与meros-ha或mp2x7-flag一起在tko细胞中表达。利用共聚焦显微镜的观察表明，mp2x7k的相当大的部分定位于细胞膜(图4d)。另一方面，与以前的报道一致，tko-mp2x7k细胞中的meros-egfp专有地在细胞内(可能是囊泡)中观察到。在以同时表达mp2x7k-egfp及meros-mcherry的方式转化tko细胞的情况下，细胞内egfp信号与mcherry信号共定位(图4e)。与此相对地，细胞膜上的egfp信号不与mcherry共定位，这表明meros帮助mp2x7在囊泡中的折叠或成熟、并且成熟mp2x7移动到细胞膜上。为了测试该可能性，将dko、tko及tko-meros-egfp细胞用带flag标签的mp2x7k转化，利用blue native(bn)-page对它们的膜级分进行分析。如图4f所示，使用抗flag抗体的蛋白质印迹中，dko及tko22 meros中，在800kda及550kda附近出现2个条带，tko细胞中未出现。比550kda低的条带如以前报道那样以对应于mp2x7k的三聚体型的方式看到。针对meros-egfp的抗gfp ab检测到了2个条带，其中上侧的条带与用针对mp2x7k的抗flag ab观察到的上侧的条带相同。接着，将膜级分供于使用用于mp2x7k-flag的抗flag珠的免疫沉淀。如图4g所示，沉淀物携带有上部的大复合体，其不仅能够被针对mp2x7k的抗flag识别，还能够被针对meros的抗gfp识别。这些结果表明，800kda的较大条带为囊泡中的mp2x7k与meros之间的复合体。表观mr(相对分子质量)为550kda的成熟mp2x7k存在于细胞膜上，而另一方面，游离或与其它蛋白质形成了复合体的meros存在于囊泡中。由这些结果得到以下结论：meros暂时在囊泡中与mp2x7相互作用，辅助其折叠。认为之后mp2x7移动到细胞膜上，在此以同源三聚体复合体的形式存在。