混合细胞基因疗法的制作方法

biology,107:1969-1975,1988；lind等人,a orthop scand.64(5):553-556,1993；matsumoto等人,in vivo,8:215-220,1994)。在小鼠胚胎中，染色显示tgf-β与源于间质的组织诸如结缔组织、软骨和骨密切相关联。除胚胎学发现之外，tgf-β还存在于骨形成和软骨形成部位处。它还可增强兔胫骨中的骨折愈合。近来，已报道tgf-β的治疗价值(critchlow等人,bone,521-527,1995；以及lind等人,a orthop scand,64(5):553-556,1993)，但它的短期作用和高成本已限制了广泛临床应用。
8.关节内注射tgf-β以治疗关节炎不合乎需要，原因是注射的tgf-β具有短暂作用持续时间，因为tgf-β在体内降解成非活性形式。因此，必须要有用于长期释放tgf-β的新方法来使透明软骨再生。
9.已有以软骨细胞的自体移植来使关节软骨再生的报道(brittberg等人,new engl j med 331:889-895,1994)，但这个程序需要伴有软组织的广泛切除的两次手术。如果关节内注射足以治疗退行性关节炎，那么这对于患者将具有极大经济和身体益处。
10.作为将特定蛋白质转移至特定部位的方法的基因疗法可为这个问题的答案(wolff和lederberg,gene therapeutics jon a.wolff编,3-25,1994；以及jenks,j natl cancer inst,89(16):1182-1184,1997)。
11.美国专利5,858,355和5,766,585公开了制备irap(白介素-1受体拮抗剂蛋白)基因的病毒或质粒构建体；用所述构建体转染滑膜细胞(5,858,355)和骨髓细胞(5,766,585)；以及将经转染细胞注射至兔关节中，但没有使用属于tgf-β超家族的基因来使结缔组织再生的公开内容。
12.美国专利5,846,931和5,700,774公开了注射包括属于tgfβ“超家族”的骨形态发生蛋白(bmp)以及截短甲状旁腺激素相关肽的组合物以实现对软骨组织形成的维持和对软骨组织的诱导。然而，没有使用bmp基因的基因治疗方法的公开内容。
13.美国专利5,842,477公开了将支架、骨膜/软骨膜组织和包括软骨细胞的基质细胞的组合植入至软骨缺损区域。因为这个专利公开要求这三个要素都存在于植入系统中，所以该参考文献未公开或提出本发明的不要求植入支架或骨膜/软骨膜组织的简单基因疗法方法。
14.美国专利6,315,992公开了当将用tgf-β1转染的成纤维细胞注射至缺损膝关节中时，在缺损的哺乳动物关节中产生了透明软骨。然而，所述专利未公开使用如本发明中的混合细胞组合物的优势。
15.lee等人human gene therapy,12:1085-1813,2001公开了当将用tgf-β1转染的成纤维细胞注射至缺损膝关节中时，在缺损的哺乳动物关节中产生了透明软骨。然而，lee等人未公开对如本发明中的混合细胞组合物的使用。
16.尽管存在这些先前技术公开内容，但对于更有效和强力的治疗方法仍有极其现实和重大需要，以不仅使哺乳动物宿主中的结缔组织再生，而且还实现更好和更有效的体细胞基因疗法方法。


技术实现要素：

17.本发明已满足上文描述的需要。
18.当前要求保护的本发明涉及一种用于在靶标部位处产生治疗性蛋白质的混合细
胞组合物，所述混合细胞组合物包含：a)用寻求表达的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体；b)尚未用所述基因转染或转导的第二哺乳动物细胞群体，其中在所述靶标部位处所述第二哺乳动物细胞群体的内源性存在形式降低，并且其中由所述第一哺乳动物细胞群体在所述靶标部位处对所述治疗性蛋白质的产生刺激所述第二细胞群体以诱导治疗作用；和c)它们的药学上可接受的载体。
19.在要求保护的本发明中，混合细胞组合物可呈可注射组合物形式。
20.要求保护的本发明还涉及一种混合细胞组合物，所述混合细胞组合物包括产生透明软骨的有效量的：a)用编码转化生长因子β(tgf-β)或骨形态发生蛋白(bmp)的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体；b)尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体；和c)它们的药学上可接受的载体。
21.在一更具体实施方案中，要求保护的本发明涉及一种混合细胞组合物，所述混合细胞组合物包含产生透明软骨的有效量的：a)用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体；b)尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二软骨细胞群体；和c)它们的药学上可接受的载体。
22.在以上组合物中，组合物可包含产生透明软骨的有效量的：a)用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体；b)尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二软骨细胞群体；和c)它们的药学上可接受的载体。
23.在以上组合物中，基因可为但不限于tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7或bmp-9。特别地，基因可为tgf-β1或bmp-2。
24.在以上组合物中，转染或转导的第一哺乳动物细胞群体可包括上皮细胞，优选是人上皮细胞；或人胚肾293细胞，也被称为hek 293、hek-293或293细胞。
25.此外，在组合物中，尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体与已用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体的比率是约1-20:1。特别地，比率可为约1-10:1，并且进一步地，可为约1-3:1。
26.在以上组合物中，用基因转染或转导的第一细胞群体可为经照射的。并且特别地，用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体是经照射的。
27.混合细胞群体的细胞可源于不同来源生物体。特别地，在某些实施方案中，用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体和未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体源于不同来源生物体。第一细胞群体和第二细胞群体可源于不同来源哺乳动物。并且特别地，用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体和未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体源于不同来源哺乳动物。
28.当前要求保护的本发明还涉及一种在哺乳动物中的靶标部位处产生治疗性蛋白质的方法，所述方法包括：a)产生包含操作性地连接于启动子的编码所述治疗性蛋白质的dna序列的重组载体；b)用所述重组载体在体外转染或转导细胞群体；以及c)将包含产生蛋白质的有效量的(i)用基因转染或转导的第一细胞群体；(ii)尚未用基因转染或转导的第二细胞群体；和(iii)它们的药学上可接受的载体的混合细胞组合物注射至所述靶标部位中，其中在所述靶标部位处第二哺乳动物细胞群体的内源性存在形式降低，并且其中由第一哺乳动物细胞群体在所述靶标部位处对所述治疗性蛋白质的产生刺激第二群体细胞以
诱导治疗作用。
29.特别地，根据以上方法，提供了一种用于在哺乳动物中产生透明软骨的方法，所述方法包括：a)产生包含操作性地连接于启动子的编码转化生长因子β(tgf-β)或骨形态发生蛋白(bmp)的dna序列的重组载体；b)用所述重组载体在体外转染或转导哺乳动物细胞群体；以及c)将包含产生透明软骨的有效量的(i)用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体；(ii)尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体；和(iii)它们的药学上可接受的载体的可注射混合细胞组合物注射至哺乳动物的关节间隙中以致发生编码tgf-β或bmp的dna序列在所述关节间隙内的表达，从而导致在所述关节间隙中产生透明软骨。
30.根据以上方法，基因可为但不限于tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6或bmp-7。特别地，基因可为tgf-β1或bmp-2。
31.根据以上方法，转染或转导的第一哺乳动物细胞群体可包括上皮细胞，其优选地是人上皮细胞；或人胚肾293细胞，也被称为hek 293、hek-293或293细胞。
32.此外，方法可涵盖以根据以下的比率混合细胞：尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体相对于已用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体可为约3-20:1。比率可为约3-10:1。更进一步地，比率可为约10:1。
33.要求保护的本发明还规定在以上方法中，用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体是经照射的。
34.关于上述方法中的细胞的来源，用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体和未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体相对于宿主接受体是同种同基因的，同种异体的，或异种异体的。
35.上述方法可使用重组载体诸如病毒载体。重组载体可为但不限于质粒载体。此外，可通过脂质体包封、磷酸钙共沉淀、电穿孔、deae-右旋糖酐介导或病毒介导来实现转染或转导。
36.在要求保护的本发明的实践中，可在移植之前储存细胞。并且可在移植之前将细胞储存在低温保存剂中。
37.在另一实施方案中，本发明涉及一种治疗骨关节炎的方法，所述方法包括：a)产生包含操作性地连接于启动子的编码转化生长因子β(tgf-β)或骨形态发生蛋白(bmp)的dna序列的重组载体；b)用所述重组载体在体外转染或转导哺乳动物细胞群体；以及c)将包含产生透明软骨和治疗骨关节炎的有效量的(i)用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体；(ii)尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体；和(iii)它们的不是无生命三维结构的药学上可接受的载体的可注射混合细胞组合物注射至哺乳动物的关节间隙中，以致发生编码tgf-β或bmp的所述dna序列在所述关节间隙内的表达，从而导致在所述关节间隙中产生骨和软骨组织。
38.根据以上方法，基因可为但不限于tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6或bmp-7。特别地，基因可为tgf-β1或bmp-2。
39.根据以上方法，转导或转染的第一哺乳动物细胞群体可包括上皮细胞，其优选地是人上皮细胞；或人胚肾293细胞，也被称为hek 293、hek-293或293细胞。
40.本发明还涉及一种可注射混合细胞组合物，所述可注射混合细胞组合物包含产生透明软骨的有效的和治疗骨关节炎的量的：a)用编码转化生长因子β(tgf-β)或骨形态发生蛋白(bmp)的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体；b)尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的第二成纤维细胞或软骨细胞群体；和c)它们的药学上可接受的载体。
41.根据以上方法，基因可为但不限于tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6或bmp-7。特别地，基因可为tgf-β1或bmp-2。
42.根据以上方法，转导或转染的第一哺乳动物细胞群体可包括上皮细胞，其优选地是人上皮细胞；或人胚肾293细胞，也被称为hek 293、hek-293或293细胞。
43.在要求保护的本发明的另一实施方案中，当前要求保护的本发明提供了一种用于在约-70℃至约-196℃的温度下储存细胞的储存容器，所述储存容器包含用以在目标部位处产生蛋白质的混合细胞组合物，所述混合细胞组合物包含：a)用寻求表达的基因转染或转导的第一哺乳动物细胞群体；b)尚未用所述基因转染或转导的第二哺乳动物细胞群体，其中在靶标部位处所述第二哺乳动物细胞群体的内源性存在形式降低，并且其中由所述第一哺乳动物细胞群体在靶标部位处对治疗性蛋白质的产生刺激第二群体细胞以诱导治疗作用；和c)它们的药学上可接受的载体。
44.特别地，本技术提供了一种用于在约-70℃至约-196℃的温度下储存细胞的储存容器，所述储存容器包含可注射混合细胞组合物，所述可注射混合细胞组合物包含产生透明软骨的有效量的：a)用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的哺乳动物细胞群体；b)尚未用编码tgf-β或bmp的基因转染或转导的成纤维细胞或软骨细胞群体；和c)它们的药学上可接受的载体。
45.本发明的这些和其他目标将根据以下发明描述、随附于此的参考附图和随附于此的权利要求而得到更充分了解。
附图说明
46.本发明将根据本文在以下给出的具体实施方式以及仅通过说明的方式给出，因此不限制本发明的附图而变得被更充分了解，并且在所述附图中；
47.图1显示tgf-β1mrna的表达。总rna从在不存在或存在锌下生长的nih 3t3细胞或用tgf-β1表达载体pmtβ1稳定转染的nih3t3细胞分离。总rna(15mg)用tgf-β1cdna或作为对照的β肌动蛋白cdna探测。
48.图2a和2b显示nih3t3-bmp2细胞中bmp2的表达。图2a和2b显示对照nih3t3-金属硫蛋白(a)和nih3t3-bmp2细胞(b)。图版(b)中的蓝色显示bmp2蛋白的表达。
49.图3a至图3d显示在具有部分缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和nih3t3-tgf-β1细胞)注射再生软骨。图3a和3c显示在用hchon(人软骨细胞)和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物(a)或单独hchon(c)注射后6周的股骨髁的图片。图3b和3d显示来自用hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物(b)或单独hchon(d)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色(mason’s trichrome staining)。原始放大倍数：(b和d)x12.5]。
50.图4a至图4e显示在具有全层缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和nih3t3-tgf-β1细胞)注射再生软骨。图4a和4d显示在用hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物(a)或单独hchon(d)注射后12周的股骨髁的图片。图4b和4e显示来自用hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的
混合物(b和c)或单独hchon(e)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色，并且图4c显示所述切片的番红-o(safranin-o)染色。原始放大倍数：(b、c和e)x12.5。
51.图5a至图5d显示在具有部分缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和nih3t3-bmp-2细胞)注射再生软骨。图5a和5c显示在用hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物(a)或单独hchon(c)注射后6周的股骨髁的图片。图5b和5d显示来自用hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物(b)或单独hchon(d)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色。原始放大倍数：(b和d)x12.5。
52.图6a至图6e显示在具有全层缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和nih3t3-bmp-2细胞)注射再生软骨。图6a和6d显示在用hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物(a)或单独hchon(d)注射后12周的股骨髁的图片。图6b和6e显示来自用hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物(b和c)或单独hchon(e)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色，并且图6c显示所述切片的番红-o染色。原始放大倍数：(b、c和e)x12.5。
53.图7a至图7d显示在具有全层缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和人软骨细胞-tgf-β1细胞)注射再生软骨。图7a和7c显示在用hchon和293-tgf-β1细胞的混合物(a)或单独hchon(c)注射后6周的股骨髁的图片。图7b和7d显示来自用hchon和293-tgf-β1细胞的混合物(b)或单独hchon(d)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色。[原始放大倍数：(b和d)x12.5]。
[0054]
图8a至图8d显示在具有部分缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和人293-tgf-β1细胞)注射再生软骨。图8a和8c显示在用hchon和293-tgf-β1细胞(3:1比率)的混合物(a)或hchon和293-tgf-β1细胞(5:1比率)的混合物(c)注射后6周的股骨髁的图片。图8b和8d显示来自用3:1比率(b)或5:1(d)的hchon和293-tgf-β1细胞的混合物注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色。[原始放大倍数：(b和d)x12.5]。
具体实施方式
[0055]
如本文所用，术语“患者”包括动物界的成员，包括但不限于人类。
[0056]
如本文所用，关于经转染或经转导细胞的术语“哺乳动物细胞群体”包括所有类型的哺乳动物细胞，特别是人细胞，包括但不限于结缔组织细胞诸如成纤维细胞或软骨细胞，或干细胞，并且特别是人胚肾细胞，并且进一步特别是人胚肾293细胞，或上皮细胞。
[0057]
如本文所用，术语“哺乳动物宿主”包括动物界的成员，包括但不限于人类。
[0058]
如本文所用，术语“结缔组织”是连接和支持其他组织或器官的任何组织，并且包括但不限于哺乳动物宿主的韧带、软骨、肌腱、骨和滑膜。
[0059]
如本文所用，术语“结缔组织细胞”和“结缔组织的细胞”包括见于结缔组织中的细胞，诸如分泌胶原细胞外基质的成纤维细胞、软骨细胞(cartilage cell/chondrocyte)和骨细胞(成骨细胞/骨细胞)，以及脂肪细胞(fat cell/adipocyte)和平滑肌细胞。优选地，结缔组织细胞是成纤维细胞、软骨细胞和骨细胞。将认识到本发明可以结缔组织细胞的混合培养物以及单一类型的细胞实践。还应认识到可在将组织细胞注射至关节间隙中之前用化合物或辐射对它们进行预处理，以使细胞在宿主生物体内稳定表达目标基因。优选地，当注射至宿主生物体中时，结缔组织细胞不导致负性免疫应答。应了解同种异体细胞可就此而言加以使用，以及可使用自体细胞，以达成细胞介导的基因疗法或体细胞疗法。
[0060]
如本文所用，“结缔组织细胞系”包括来源于共同亲本细胞的多个结缔组织细胞。
[0061]
如本文所用，细胞的“降低”是指相较于将通常见于部位处的量，细胞群体的减少。这可意指相较于在部位处的正常细胞群体，细胞群体有某一百分比的降低，诸如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或可意指在部位处细胞的损害或消减。
[0062]
如本文所用，“辅助细胞”是指与用目标基因转染或转导的细胞混合的那些细胞。辅助细胞自身不用目标基因转染或转导。特别地，用目标基因转染或转导的细胞产生使辅助细胞活化的蛋白质。将这个混合物施用至内源性产生辅助细胞，但所述辅助细胞在施用时是降低的目标部位会在所述目标部位处导致有利地有效的体细胞基因治疗。
[0063]
在一个实施方案中，“辅助细胞”可指用编码转化生长因子β超家族的成员的基因转染或转导以形成细胞混合物的结缔组织细胞。此类辅助细胞可包括任何结缔组织细胞。通常，这些细胞不用编码转化生长因子β超家族的成员的基因转染或转导。特别地，这些细胞不用任何基因转染或转导，并且这些细胞通常驻留在软骨区域中。通常，细胞是成纤维细胞或软骨细胞。
[0064]
如本文所用，供体细胞和接受宿主的“组织相容性”是指它们共有足够数目的组织相容性剂，以使移植被接受，并且在宿主哺乳动物中保持功能。特别地，一对供体和接受体的人白细胞抗原(hla)诸如a、b和c型hla(i类)和dr型hla(ii类)应匹配。
[0065]
如本文所用，“透明软骨”是指覆盖关节表面的结缔组织。仅举例来说，透明软骨包括但不限于关节软骨、肋软骨和鼻软骨。
[0066]
特别地，已知的是透明软骨是自我更新性的，对改变起响应，并且提供具有较小摩擦的稳定运动。即使见于同一关节内或见于各关节中的透明软骨在厚度、细胞密度、基质组成和机械性质方面不同，但保持相同的一般性结构和功能。透明软骨的一些功能包括惊人的压迫刚性、弹性以及卓越的重量负荷分散能力、使对软骨下骨的峰值应力最小化的能力和极大的持久性。
[0067]
大体上以及在组织学上，透明软骨表现为抵抗变形的光滑坚固表面。软骨的细胞外基质包含软骨细胞，但缺乏血管、淋巴管或神经。维持软骨细胞与基质之间的相互作用的精巧的高度有序结构用于维持透明软骨的结构和功能，同时维持低水平的代谢活性。参考文献o’driscoll,j.bone joint surg.,80a:1795-1812,1998详细描述了透明软骨的结构和功能，所述参考文献通过引用以它的整体并入本文。
[0068]
如本文所用，“可注射”组合物是指排除以下各种三维支架、框架、网格或毛毡结构的组合物，所述结构可由任何材料制得，或可为允许细胞附着于它，并且允许细胞以超过一层生长的形状，并且所述结构通常被植入而非注射。在一个实施方案中，通常通过注射器来进行本发明的注射方法。然而，可使用注射目标组合物的任何模式。举例来说，还可使用导管、喷雾器或温度依赖性聚合物凝胶。
[0069]
如本文所用，“混合细胞”或“细胞的混合物”或“细胞混合物”是指包括用被表达来使辅助细胞受益的目标基因转染或转导的第一细胞群体的多种细胞的组合，并且所述辅助细胞是第二细胞群体。
[0070]
在本发明的一个实施方案中，混合细胞可指包括已用编码转化生长因子β超家族的成员的基因或dna转染或转导的细胞和尚未用编码转化生长因子β超家族的成员的基因转染或转导的辅助细胞的多种哺乳动物细胞的组合。通常，尚未用编码转化生长因子β超家
族的成员的基因转染或转导的细胞与已用tgf超家族基因转染或转导的细胞的比率可在约3-20:1的范围内。范围可包括约3-10:1。特别地，就细胞的数目而言，范围可为约10:1。然而，应了解这些细胞的比率不应必须固定于任何特定范围，只要这些细胞的组合在部分和完全缺损关节中有效产生透明软骨即可。
[0071]
如本文所用，“药学上可接受的载体”是指本领域中已知会促进本发明的组合物的运输效率，并且延长组合物的有效性的任何载体。
[0072]
如本文所用，“体细胞”或“细胞”一般是指身体的除卵或精子以外的细胞。
[0073]
如本文所用，“储存的”细胞是指已在它们被施用至关节间隙之前单独或一起储存的混合细胞的组合物。可将细胞储存在制冷装置中。或者，可将细胞于液氮罐中或于等效储存装置中在约-70℃至约-196℃下冷冻，以使细胞得到保存以用于稍后施用至关节间隙中。可使用已知方案使细胞解冻。可通过许多方式来实施冷冻和解冻的持续期，只要细胞的活力和效能是最优化的即可。
[0074]
如本文所用，术语“转染”和“转导”作为将dna转移至宿主细胞，并且使所述dna随后整合至接受细胞的染色体dna中的特定方法被提及。当实践本发明时，可使用将外来dna转移至宿主细胞的任何方法，包括非病毒或病毒基因转移方法，只要外来基因被引入至宿主细胞中，并且所述外来基因在所述宿主细胞中稳定表达即可。因此，如本文所用，术语“转染或转导”包括将基因递送至细胞的任何方法，诸如磷酸钙沉淀、deae右旋糖酐、电穿孔、脂质体、病毒介导等。
[0075]
如本文所用，“转化生长因子-β(tgf-β)超家族”涵盖在胚胎发育期间影响广泛范围的分化过程的一组结构相关蛋白质。所述家族包括米勒管抑制物质(m
ü
llerian inhibiting substance，mis)，其为正常雄性性别发育所需(behringer,等人,nature,345:167,1990)；果蝇生物皮肤生长因子(dpp)基因产物，其为背腹轴形成和成虫盘的形态发生所需(padgett,等人,nature,325:81-84,1987)；非洲蟾蜍vg-1基因产物，其定位于卵的植物极(weeks,等人,cell,51:861-867,1987)；活化素(activin)(mason,等人,biochem,biophys.res.commun.,135:957-964,1986)，其可诱导非洲蟾蜍胚胎中中胚层和前部结构的形成(thomsen,等人,cell,63:485,1990)；以及骨形态发生蛋白(bmp，诸如bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6和bmp-7、成骨蛋白(osteogenin)、op-1)，其可诱导重新软骨和骨形成(sampath,等人,j.biol.chem.,265:13198,1990)。tgf-β基因产物可影响多种分化过程，包括脂肪形成、肌形成、软骨形成、造血和上皮细胞分化。对于综述，参见massague,cell 49:437,1987，其通过引用以它的整体并入本文。
[0076]
tgf-β家族的蛋白质初始以大型前体蛋白形式合成，所述大型前体蛋白随后在距离c末端大致110-140个氨基酸的一簇碱性残基处经受蛋白水解裂解。蛋白质的c末端区域全都是结构相关的，并且不同家族成员可基于它们的同源性的程度来分类成不同子组。尽管特定子组内的同源性在70％至90％氨基酸序列同一性的范围内，但子组之间的同源性是显著较低的，通常在仅20％至50％的范围内。在每种情况下，活性种类都似乎是c末端片段的二硫键连接二聚体。对于已研究的家族成员中的大多数，已发现同二聚种类具有生物活性，但对于其他家族成员如抑制素(ung,等人,nature,321:779,1986)和tgf-β(cheifetz,等人,cell,48:409,1987)，还已检测到异二聚体，并且这些异二聚体似乎具有不同于相应同二聚体的生物性质。
[0077]
tgf-β基因的超家族的成员包括tgf-β3、tgf-β2、tgf-β4(鸡)、tgf-β1、tgf-β5(非洲蟾蜍)、bmp-2、bmp-4、果蝇dpp、bmp-5、bmp-6、vgr1、op-1/bmp-7、果蝇60a、gdf-1、非洲蟾蜍vgf、bmp-3、抑制素-βa、抑制素-βb、抑制素-α和mis。这些基因在massague,ann.rev.biochem.67:753-791,1998中加以讨论，所述文献通过引用以它的整体并入本文。
[0078]
优选地，tgf-β基因的超家族的成员是tgf-β和bmp。更优选地，成员是tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6或bmp-7。最优选地，成员是人或猪tgf-β1或bmp-2。
[0079]
如本文所用，“可选择标记”包括由稳定维持所引入dna的细胞表达，并且导致所述细胞表现改变的表型诸如形态转变、或酶活性的基因产物。通过任选地向相同细胞中引入编码可选择标记诸如具有赋予对抗生素或其他药物的抗性的酶活性的可选择标记的第二基因来实现对表达转染或转导的基因的细胞的分离。可选择标记的实例包括但不限于胸苷激酶、二氢叶酸还原酶、赋予对氨基糖苷抗生素诸如卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)和遗传霉素(geneticin)的抗性的氨基糖苷磷酸转移酶、潮霉素b磷酸转移酶(hygromycin bphosphotransferase)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、cad(具有重新尿苷生物合成的前三种酶活性-氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶和二氢乳清酸酶的单一蛋白质)、腺苷脱氨酶和天冬酰胺合成酶(sambrook等人molecular cloning,第16章.1989)，所述文献通过引用以它的整体并入本文。应了解使用可选择标记不是实践要求保护的本发明的必要条件。实际上，在一个实施方案中，要求保护的本发明的遗传构建体中没有并入可选择标记。
[0080]
如本文所用，“启动子”可为在真核细胞中具有活性，并且控制转录的任何dna序列。启动子可在真核细胞和原核细胞中的任一者或两者中具有活性。优选地，启动子在哺乳动物细胞中具有活性。启动子可为组成性表达的或可诱导的。优选地，启动子是可诱导的。优选地，启动子可由外部刺激诱导。更优选地，启动子可由激素或金属诱导。最优选地，启动子是金属硫蛋白基因启动子或可由糖皮质激素诱导的启动子。同样，可将也控制转录的“增强子元件”插入至dna载体构建体中，并且与本发明的构建体一起使用以增强目标基因的表达。
[0081]
如本文所用，术语“dc-chol”意指含有阳离子胆固醇衍生物的阳离子脂质体。“dc-chol”分子包括叔氨基、中等长度的间隔体臂(两个原子)和氨基甲酰基接头键(gao等人,biochem.biophys.res,commun.,179:280-285,1991)。
[0082]
如本文所用，“sf-chol”定义为一种类型的阳离子脂质体。
[0083]
如本文所用，关于脂质体使用的术语“生物活性”表示将功能性dna和/或蛋白质引入至靶标细胞中的能力。
[0084]
如本文所用，关于核酸、蛋白质、蛋白质片段或它们的衍生物的术语“生物活性”定义为核酸或氨基酸序列模拟由核酸或蛋白质的野生型形式引发的已知生物功能的能力。
[0085]
如本文所用，当在脂质体递送的情形下使用时，术语“维持”表示引入的dna保持存在于细胞中的能力。当在其他情形下使用时，它意指靶向的dna保持存在于靶标细胞或组织中以便赋予治疗作用的能力。
[0086]
本发明涵盖将细胞混合物施用至哺乳动物中有需要的部位，其中第一细胞群体用待在哺乳动物中的目标部位处表达的目标基因转染或转导。当尝试体细胞基因疗法时，本
发明提供了包括未用目标基因转染或转导的第二细胞群体，并且在损伤或患病或以其他方式衰弱的目标部位处所述细胞是内源性降低的，因此需要连同所述第二细胞群体一起通过在目标部位处表达目标基因来活化，以因此使内源性产生或外源性施用的第二群体类型细胞活化和生长。
[0087]
特别地，本发明公开了用于将目标dna序列递送至哺乳动物宿主的哺乳动物细胞的离体和体内技术。离体技术涉及培养靶标哺乳动物细胞，在体外将目标dna序列、dna载体或其他递送载体转染或转导至哺乳动物细胞中，随后将经修饰哺乳动物细胞移植至哺乳动物宿主的靶标关节，以便实现目标基因产物的体内表达。
[0088]
应了解尽管有可能的是可在本发明的基因疗法方案中将诸如支架或框架的物质以及各种外来组织一起植入，但也有可能的是此支架或组织不被包括在本发明的注射系统中。在一优选实施方案中，在细胞介导的基因疗法或体细胞疗法中，本发明涉及一种将经转染或经转导哺乳动物细胞群体注射至关节间隙以使得在关节间隙中表达外源性tgf超家族蛋白的简单方法。
[0089]
在整篇本说明书中公开的一种治疗结缔组织病症的离体方法包括初始产生含有编码蛋白质或其生物活性片段的dna序列的重组病毒或质粒载体。这个重组载体接着用于感染或转染体外培养的哺乳动物细胞群体，从而产生含有载体的哺乳动物细胞群体。接着将这些哺乳动物细胞以混合物形式移植至哺乳动物宿主的靶标关节间隙，或单独地移植至关节间隙中以便在关节内部产生混合物，因此实现蛋白质或蛋白质片段在关节间隙内的后续表达。这个目标dna序列的表达可用于实质上减轻至少一种与结缔组织病症相关的有害关节病变。
[0090]
普通技术人员将了解，用于治疗人患者的细胞的来源可为患者自身的细胞诸如自体细胞，但在不考虑细胞的组织相容性的情况下还可使用同种异体细胞以及异种异体细胞。或者，在本发明的一个实施方案中，可使用具有匹配于哺乳动物宿主的组织相容性的同种异体细胞。为更详细地描述，测定供体和患者的组织相容性以使得将组织相容的细胞施用至哺乳动物宿主。
[0091]
更具体来说，这个方法包括采用能够编码转化生长因子β超家族的成员或其生物活性衍生物或片段的基因作为基因，并且采用可选择标记或其生物活性衍生物或片段。
[0092]
本发明的另一实施方案包括采用能够编码转化生长因子β超家族的至少一个成员或其生物活性衍生物或片段的基因作为基因，并且采用为本领域普通技术人员所知的无论所用递送方法如何，能够在递送后在靶标细胞或组织内稳定维持的任何dna质粒载体作为dna质粒载体。
[0093]
本发明的另一实施方案提供了一种用于将至少一个编码产物的基因引入至结缔组织的至少一种细胞中以用于治疗哺乳动物宿主的方法。这个方法包括采用用于将编码产物的基因引入至结缔组织细胞中的非病毒手段。更具体来说，这个方法包括脂质体包封、磷酸钙共沉淀、电穿孔、或deae-右旋糖酐介导，并且包括采用能够编码转化生长因子超家族的成员或其生物活性衍生物或片段的基因作为基因，并且采用可选择标记或其生物活性衍生物或片段。
[0094]
本发明的另一实施方案提供了一种用于将至少一个编码产物的基因引入至哺乳动物组织的至少一种细胞中以用于治疗哺乳动物宿主的额外方法。这个额外方法包括采用
利用病毒来将dna载体分子递送至靶标细胞或组织的生物手段。优选地，病毒是假病毒，即基因组已被改变以致所述假病毒仅能够递送和在靶标细胞内稳定维持，但不保留在靶标细胞或组织内复制的能力。通过重组dna技术进一步操作改变的病毒基因组，以致病毒基因组充当含有待在靶标细胞或组织内表达的异源性目标基因的dna载体分子。
[0095]
本发明的一优选实施方案是一种通过以下方式来将tgf-β或bmp递送至靶标关节间隙的方法：采用本说明书内公开的离体技术，通过使用逆转录病毒载体来将tgf-β或bmp基因递送至哺乳动物宿主的结缔组织。换句话说，将编码功能性tgf-β或bmp蛋白或蛋白片段的目标dna序列亚克隆至所选逆转录病毒转移载体中。通过关节内注射来将经转导哺乳动物细胞优选是自体移植细胞与哺乳动物细胞的非转染或转导样品组合移植至目标关节中。
[0096]
本发明的另一优选方法涉及通过使用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体或单纯疱疹病毒(hsv)载体来将tgf-β超家族基因直接体内递送至哺乳动物宿主的结缔组织。换句话说，将编码功能性tgf-β或bmp蛋白或蛋白片段的目标dna序列亚克隆至相应病毒载体中。接着使含有tgf-β或bmp的重组病毒生长至足够滴度，并且优选地通过关节内注射来引导至关节间隙中。
[0097]
将dna分子呈现至关节的靶标结缔组织的方法包括但不限于将dna分子包封至阳离子脂质体中，将目标dna序列亚克隆在逆转录病毒或质粒载体中，或将dna分子自身直接注射至关节中。无论呈现至膝关节的形式如何，dna分子优选地以作为重组病毒dna载体分子或重组dna质粒载体分子的dna载体分子形式呈现。通过紧邻异源性基因的编码区的上游插入在真核细胞中具有活性的启动子片段来确保目标异源性基因的表达。本领域普通技术人员可利用已知的载体构建策略和技术来确保在dna分子进入结缔组织中之后的适当表达水平。
[0098]
在一优选实施方案中，在体外培养哺乳动物细胞以后续用作基因疗法的递送系统。将显而易知的是申请人不限于使用公开的特定组织。将有可能将其他组织来源用于体外培养技术。使用本发明的基因的方法可在骨关节炎和伤口愈合的防治性治疗与治疗性治疗两者中加以采用。还将显而易知的是本发明不限于仅用于治疗膝关节的防治性或治疗性应用。将有可能防治性地或治疗性地利用本发明治疗任何易感关节中的骨关节炎，或由软骨的撕裂或退化引起的损伤所致的任何损害。
[0099]
在本发明的另一实施方案中，提供了一种用于以治疗有效量胃肠外施用至患者的化合物，所述化合物含有编码tgf-β超家族蛋白的基因和适合药物载体。
[0100]
本发明的另一实施方案提供了一种用于以防治有效量胃肠外施用至患者的化合物，所述化合物包括编码tgf-β超家族蛋白的基因和适合药物载体。
[0101]
在本发明的另一实施方案中，在施用至关节间隙之前储存细胞。可将经转染或经转导细胞单独储存，或可将未转染辅助细胞单独储存，或可储存混合物，但未必同时。此外，储存的持续期无需是持续相同时期。因此，可在注射之前混合单独储存的细胞。或者，可单独储存和注射细胞以在关节间隙内形成细胞混合物。本领域技术人员应了解可将这些细胞冷冻储存在低温保存剂中，所述低温保存剂诸如但不限于约10％dmso于液氮中的组合物或等效存储介质。
[0102]
本发明的另一实施方案包括一种将至少一个编码产物的基因引入至哺乳动物组
织的至少一种细胞中以用于治疗如上文所述的哺乳动物宿主的方法，所述方法包括通过将含有编码所述产物的基因的病毒载体直接引入至哺乳动物宿主中来在体内实现对细胞的感染。优选地，这个方法包括通过关节内注射来实现向哺乳动物宿主中的直接引入。这个方法包括采用所述方法来实质上预防具有显现关节炎的高易感性的哺乳动物宿主中关节炎的显现。这个方法还包括对关节炎哺乳动物宿主采用所述方法以达成治疗用途。此外，这个方法还包括采用所述方法来修复和再生如上文定义的结缔组织。
[0103]
本领域技术人员应了解，采用脂质体的病毒载体不受限于如为逆转录病毒实现对哺乳动物细胞的感染和整合所需的细胞分裂。采用如上文所述的非病毒手段的这个方法包括采用能够编码属于tgf-β超家族的成员的基因作为基因，并且任选地连同可选择标记基因诸如抗生素抗性基因。并且还应了解可选择标记基因不是实践要求保护的本发明的必要条件。
[0104]
本发明的另一实施方案是通过本说明书内公开的任何方法来将编码tgf-β超家族的成员的dna序列递送至哺乳动物宿主的结缔组织，以便实现胶原的体内表达以使结缔组织诸如软骨再生。
[0105]
结缔组织是难以进行治疗靶向的器官。本领域中已知的静脉内和口服药物递送途径提供对这些结缔组织的不良到达，并且具有使哺乳动物宿主身体全身性暴露于治疗剂的缺点。更具体来说，已知的将蛋白质关节内注射至关节提供对关节的直接到达。然而，以包封蛋白质形式注射的药物中的大多数具有短暂关节内半衰期。通过向哺乳动物宿主的结缔组织中引入编码可用于治疗所述哺乳动物宿主的蛋白质的基因，本发明解决了这些问题。更具体来说，本发明提供了一种用于向哺乳动物宿主的结缔组织中引入编码具有抗关节炎性质的蛋白质的基因的方法。
[0106]
在本文提供的实施例中，与未转导软骨细胞辅助细胞混合的nih3t3-tgf-β1和nih3t3-bmp-2细胞刺激了关节中的胶原合成。在实施例中，用2x106个细胞/毫升浓度的在1:10的经转染细胞与辅助细胞比率下的293-tgf-β1、nih3t3-tgf-β1或nih3t3-bmp-2细胞和未转导软骨细胞辅助细胞的混合物注射关节。在注射之后6周至12周收集标本。细胞在关节内自由移动，并且移动至对这些细胞具有特异性亲和力的区域。滑膜、半月板和软骨缺损区域可为细胞粘附的可能部位。在注射之后六周和十二周时，在部分损害的软骨缺损区域与完全损害的软骨缺损区域两者中均观察到再生的组织。对损害区域的这个特异性亲和力是将混合细胞用于临床应用的另一优势。如果仅将细胞注射至关节中而不包括各种物理器具诸如支架或任何其他三维结构就可治愈退行性关节炎，那么可在不进行大手术的情况下方便地治疗患者。
[0107]
无论作用机制是什么，并且在不束缚于关于作用机制的任何特定理论下，通过使用本发明的混合细胞组合物达成透明软骨合成的研究结果指示长久持续期的高tgf-β或bmp浓度可刺激透明软骨再生。通过组织学方法来测定新形成的组织的性质。通过梅森氏三色染色和番红-o，指示了新形成的组织与周围透明软骨相同(图3至图7)。
[0108]
以下实施例通过说明本发明的方式而非通过限制的方式来提供。
[0109]
实施例
[0110]
实施例i-材料和方法
[0111]
质粒构建
[0112]
通过将含有tgf-β1编码序列和在3’末端的生长激素多腺苷酸位点的1.2-kb bgl ii片段亚克隆至pmtmlv的bam hi位点中来产生质粒pmtmlvβ1。通过将含有bmp2编码序列的1.2-kb sal i-not i片段亚克隆至pmtmlv的sal i-not i位点中来产生质粒pmtbmp2。pmtmlv载体通过缺失整个gag和env序列以及一些ψ包装序列而源于逆转录病毒载体mfg。
[0113]
细胞培养和转导-将克隆在逆转录病毒载体中的tgf-β和bmp-2cdna单独地转导至成纤维细胞(nih3t3-tgf-β1和nih3t3-bmp-2)和哺乳动物细胞(293-tgf-β1)中。将它们在具有10％浓度的胎牛血清的杜尔贝科氏伊戈尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium，gibco-brl,rockville,md)中培养。
[0114]
为选择具有转导的基因序列的细胞，将新霉素(300μg/ml)添加至培养基中。有时将具有tgf-β1和bmp-2表达的细胞储存在液氮中，并且就在注射之前加以培养。
[0115]
通过使用磷酸钙共沉淀方法进行tgf-β基因转染(图1)。约80％的存活集落表达转基因mrna。将这些所选产生tgf-β1的细胞在硫酸锌溶液中孵育。当在100mm硫酸锌溶液中培养细胞时，它们产生mrna。tgf-β分泌速率是约32ng/106个细胞/24小时。
[0116]
为测试和确认由用含有bmp2 cdna的逆转录病毒载体感染的nih3t3成纤维细胞对生物活性bmp2蛋白的产生，用对照nih3t3-金属硫蛋白(图2a)和nih3t3-bmp2细胞(图2b)进行碱性磷酸酶(alp)活性测定。图2b中的蓝色显示bmp2蛋白的表达。
[0117]
使1.5x106个nih3t3细胞在6孔组织培养板中生长过夜。将0.5x105个指示细胞(mc3t3e1)放置在组织培养插件中，并且使其生长过夜。从培养插件吸出培养基，并且将培养插件转移至6孔板中并孵育48-72小时。从培养插件吸出培养基。添加5ml 1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)以洗涤细胞。将4ml 3.7％甲醛/1x pbs溶液添加至每个插件中，并且在4℃下将细胞固定20分钟。将细胞用1x pbs洗涤两次。将3ml alp染色溶液添加至每个培养插件中，并且在室温下在黑暗中将培养插件孵育约20分钟至1小时以达成蓝色显影。alp染色溶液是含0.1mg/ml萘酚as-mx磷酸盐(sigma n5000)、0.5％,n-二甲基甲酰胺(sigma d8654)、2mm mgcl2、0.3mg/ml快速蓝色bb盐(sigma f3378)的0.1m tris-hcl，ph 8.5。
[0118]
实施例ii
–
实验方法和结果
[0119]
兔关节软骨缺损的再生-选择称重是2.0-2.5kg的新西兰白兔用于动物研究。这些兔是成熟的，并且具有潮标。使膝关节暴露，并且用手术刀在股骨髁的透明软骨层上产生部分软骨缺损(3mm x 6mm，1-2mm深)或全层缺损(3mm x 6mm，2-3mm深)。将对照人软骨细胞(hchon)或hchon和nih3t3-tgf-β1细胞或nih3t3-bmp-2细胞的混合物注射至具有缺损的兔膝关节中。将这些细胞(15-20μl，2x106个细胞/ml)装载至缺损的上部，接着在缺损中留置15-20分钟以允许在缝合之前细胞渗入伤口。在其中将hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物注射至具有全层缺损的兔中的实验中，在产生缺损之后3周将这些混合细胞组合物注射至缺损中。在细胞注射后6或12周时收集股骨髁，并且加以检查。
[0120]
在具有部分缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和nih3t3-tgf-β1细胞)注射来再生软骨-将对照hchon或包含hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物的组合物注射至在股骨髁上含有部分软骨缺损(3mm x 5mm，1-2mm深)的兔膝关节中。将细胞混合物(15-20μl，2x106个细胞/ml，10:1比率的hchon和nih3t3-tgf-β1)装载至缺损的上部，接着在缺损中留置15-20分钟以允许在缝合之前细胞渗入伤口。在注射之后6周时收集标本，并且用显微镜观察。图3a和3c显示在用hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物(a)或单独hchon(c)注射后6
周的股骨髁的图片。图3b和3d显示来自用hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物(b)或单独hchon(d)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色。[原始放大倍数：(b和d)x12.5]。
[0121]
在具有全层缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和nih3t3-tgf-β1细胞)注射来再生软骨-将对照hchon或hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物注射至在股骨髁上含有全层软骨缺损(3mm x 5mm，2-3mm深)的兔膝关节中。将细胞混合物(20-25μl，2x106个细胞/ml，10:1比率的hchon和nih3t3-tgf-β1)装载至缺损的上部，接着在缺损中留置15-20分钟以允许在缝合之前细胞渗入伤口。在注射之后12周时收集标本，并且用显微镜观察。图4a和4d显示在用hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物(a)或单独hchon(d)注射后12周的股骨髁的图片。图4b、4c和4e显示来自用hchon和nih3t3-tgf-β1细胞的混合物(b和c)或单独hchon(e)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色(b和e)和番红-o染色(c)。[原始放大倍数：(b、c和e)x12.5]。
[0122]
在具有部分缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和nih3t3-bmp-2细胞)注射再生软骨-将对照hchon或hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物注射至在股骨髁上含有部分软骨缺损(3mm x 5mm，1-2mm深)的兔膝关节中。将细胞混合物(15-20μl，2x106个细胞/ml，10:1比率的hchon和nih3t3-bmp-2)装载至缺损的上部，接着在缺损中留置15-20分钟以允许在缝合之前细胞渗入伤口。在注射之后6周时收集标本，并且用显微镜观察。图5a和5c显示在用hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物(a)或单独hchon(c)注射后6周的股骨髁的图片。图5b和5d显示来自用hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物(b)或单独hchon(d)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色。[原始放大倍数：(b和d)x12.5]。
[0123]
在具有全层缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和nih3t3-bmp-2细胞)注射再生软骨-将对照hchon或hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物注射至在股骨髁上含有全层软骨缺损(3mm x 5mm，2-3mm深)的兔膝关节中。在这个情况下，在产生缺损之后3周注射细胞。将细胞混合物(20-25μl，2x106个细胞/ml，10:1比率的hchon和nih3t3-bmp-2)装载至缺损的上部，接着在缺损中留置15-20分钟以允许在缝合之前细胞渗入伤口。在注射之后6周时收集标本，并且用显微镜观察。图6a和6d显示在用hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物(a)或单独hchon(d)注射后12周的股骨髁的图片。图6b、6c和6e显示来自用hchon和nih3t3-bmp-2细胞的混合物(b和c)或单独hchon(e)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色(b和e)和番红-o染色(c)。[原始放大倍数：(b、c和e)x12.5]。
[0124]
在具有全层缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和人293-tgf-β1细胞)注射来再生软骨-将对照人软骨细胞(hchon)或hchon和293-tgf-β1细胞的混合物注射至在股骨髁上含有全层软骨缺损(3mm x 5mm，2-3mm深)的兔膝关节中。将细胞混合物(20-25μl，2x106个细胞/ml，1:1比率的hchon和293-tgf-β1)装载至缺损的上部，接着在缺损中留置15-20分钟以允许在缝合之前细胞渗入伤口。在注射之后6周时收集标本，并且用显微镜观察。图7a和7c显示在用hchon和293-tgf-β1细胞的混合物(a)或单独hchon(c)注射后6周的股骨髁的图片。图7b和7d显示来自用hchon和293-tgf-β1细胞的混合物(b)或单独hchon(d)注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色。[原始放大倍数：(b和d)x12.5]。
[0125]
在具有部分缺损的兔中以混合细胞(人软骨细胞和人293-tgf-β1细胞)注射来再生软骨-将hchon和293-tgf-β1细胞的混合物注射至在股骨髁上含有部分软骨缺损(3mm x 5mm，1-2mm深)的兔膝关节中。将细胞混合物(15-20μl，2x106个细胞/ml，3:1或5:1比率的
hchon和293-tgf-β1)装载至缺损的上部，接着在缺损中留置15-20分钟以允许在缝合之前细胞渗入伤口。在注射之后6周时收集标本，并且用显微镜观察。图8a和8c显示在用hchon和293-tgf-β1细胞(3:1比率)的混合物(a)或hchon和293-tgf-β1细胞(5:1比率)的混合物(c)注射后6周的股骨髁的图片。图8b和8d显示来自用3:1比率(b)或5:1(d)的hchon和293-tgf-β1细胞的混合物注射的股骨髁的切片的梅森氏三色染色。[原始放大倍数：(b和d)x12.5]。
[0126]
本文引用的所有参考文献都通过引用以它们的整体并入本文。
[0127]
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[0128]
尽管已出于说明的目的在以上描述了本发明的特定实施方案，但将为本领域技术人员显而易知的是可在不脱离如随附权利要求中限定的本发明的情况下对本发明的细节作出众多变化。