一种食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针及试剂盒的制作方法

1.本发明属于微生物检测技术领域，具体地，涉及一种食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针及试剂盒。


背景技术：

2.铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，pa），又称绿脓杆菌，假单胞菌属，是一种人兽共患性常见致病菌，因其对营养条件要求较低，且易在潮湿环境中存活，因此广泛存在于土壤、水和空气以及人的皮肤、肠道、呼吸道中，属于条件性致病菌，其所产生的各种内毒素、致死性外毒素能广泛侵袭机体各个脏器、组织，引起各种病变和炎症，严重时甚至引起死亡。在日常食品检测中，铜绿假单胞菌未被列入常规项目，但铜绿假单胞菌已被确认为食源性和水源性致病菌。
3.研究发现，在食品领域，凉拌菜、熟肉制品、饮用水等产品经常存在被铜绿假单胞菌污染的状况。在gb 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》、gb 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》中都将铜绿假单胞菌列为不得检出的致病菌，最新版《化妆品安全技术规范》（2015 年）也要求化妆品中的铜绿假单胞菌不得检出。
4.目前，微生物发酵法及pcr 技术、lamp等温扩增等已广泛应用于铜绿假单胞菌的筛查和检测中，但传统微生物发酵法利用细菌培养、生化鉴定检测铜绿假单胞菌，检验周期长，且对场所、人员要求较高；pcr 法需要电泳处理或实时荧光定量检测设备，且需时较长；lamp等温扩增速度快，但是特异性不高，容易污染；这些均不利于推广及大批量筛查，也不便应用于餐饮环节及销售现场。
5.荧光重组酶介导等温扩增（raa）技术是最新的等温扩增技术之一，由一种可替代传统pcr的新型核酸检测技术。与传统pcr 及等温扩增技术相比较，其最显著的优势是可在室温下反应，反应时间短，在25℃-43℃条件下，5-20min 内观察到检测结果，且操作简单，对检测设备依赖小，适合于样品dna现场快速检测。目前，raa 技术已应用于病毒、转基因作物、寄生虫、动物源性、癌细胞、细菌等各方面的检测研究，展现出了良好的应用前景。
6.因此，基于raa技术的优势以及对铜绿假单胞菌快速检测的需求，开发一种便捷、快速的铜绿假单胞菌快速检测方法很有必要。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供一种新型的食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针及试剂盒。本发明作为一种应用于食品中铜绿假单胞菌检测的raa快速检测方法，可以满足食品中低成本、现场快速检测的需求。
8.本发明的技术方案为；一种食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针，其特征在于，由序列表seq id no.1至序列表seq id no.3所示的核苷酸序列组成；其中seq id no.1至seq id no.2所示的核苷酸序列分别为上游引物和下游引物，seq id no.3所示的核苷酸序列为探针；
所述探针中，对探针中间和3’端进行修饰，其中fam为荧光基团，thf为四氢呋喃，bhq1为淬灭基团，c3-spacer为3’封闭基团。
9.具体为：seq id no.1：accgagaatgacaaagtggaactggtgatccgcct；seq id no.2：ggccttcccactgatcgagcacttcgccggtcttg；seq id no.3：cgcccaactggtctacaacgtctcctacc-t（fam）-g-thf-t-t（bhq1）-cccggcgagggactgt-c3-spacer。
10.在本发明的一种实施例中，提供一种食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针，由序列表seq id no.1、序列表seq id no.4、序列表seq id no.3所示的核苷酸序列组成；其中seq id no.1至seq id no.4所示的核苷酸序列分别为上游引物和下游引物，seq id no.3所示的核苷酸序列为探针；所述探针中，对探针中间和3’端进行修饰，其中fam为荧光基团，thf为四氢呋喃，bhq1为淬灭基团，c3-spacer为3’封闭基团。
11.具体为：seq id no.1：accgagaatgacaaagtggaactggtgatccgcct；seq id no.4：ggccaggccttcccactgatcgagcacttcgccgg；seq id no.3：cgcccaactggtctacaacgtctcctacc-t（fam）-g-thf-t-t（bhq1）-cccggcgagggactgt-c3-spacer。
12.在本发明的一种实施例中，提供一种食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针，其特征在于，由序列表seq id no.5、序列表seq id no.2、序列表seq id no.3所示的核苷酸序列组成；其中seq id no.5至seq id no.2所示的核苷酸序列分别为上游引物和下游引物，seq id no.3所示的核苷酸序列为探针；所述探针中，对探针中间和3’端进行修饰，其中fam为荧光基团，thf为四氢呋喃，bhq1为淬灭基团，c3-spacer为3’封闭基团。
13.具体为：seq id no.5：gggccgcaagaccgagaatgacaaagtggaactgg；seq id no.2：ggccttcccactgatcgagcacttcgccggtcttg；seq id no.3：cgcccaactggtctacaacgtctcctacc-t（fam）-g-thf-t-t（bhq1）-cccggcgagggactgt-c3-spacer。
14.与其它核酸扩增技术相比，raa 技术具有操作简便、反应时间短、特异性强、灵敏性高、对核酸质量要求不高等优势。但由于raa 反应原理和反应过程的特殊性，对引物探针的设计要求与其他分子生物学方法不同，没有合适的引物设计软件可以使用，只能按照其规则和经验，通过大量创造性试验进行人工设计及校对。本发明引物探针设计遵循以下原则：引物的长度一般为30至35个碱基，引物过短会严重影响重组酶的活性，5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，能促进重组。3’末端的3个核苷酸可以是鸟嘌呤或胞嘧啶，有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能。引物中最好不要出现特殊序列，比如长串的聚嘌呤或聚嘧啶。gc含量应在40%-60%之间。此外，引物设计时应当尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成，尽量不含正/反向重复和回文序列，靶标区域最好避开基因组中的重复元件。
15.本发明的创新点在于exo探针的设计，探针长度一般为45-53个碱基，荧光探针包含一个荧光报告基团和一个荧光猝灭基团，分别取代原有序列的胸腺嘧啶，在距离5’端约30个碱基的位置有一个脱碱基位点，该位点如果结构完整，该体系中的荧光强度极低，另外在探针3’末端需要利用阻塞基团进行修饰，以免该探针充当引物进行扩增。随着探针与靶序列结合，探针上的脱碱基位点会被核酸外切酶识别并剪切，使荧光报告基团与荧光猝灭
基团分离，从而产生荧光。探针的设计需要通过大量创造性试验，获得不同菌类的raa 引物和探针的设计原则，才能获得最佳的探针。
16.本发明中，发明人通过大量创造性试验，选择lasb基因作为raa检测的目标基因，lasb基因合成一种弹性蛋白酶，是铜绿假单胞菌的重要毒力因子。通过ncbi网站 genbank 数据库中查询lasb基因序列（nr_113599.1），选择其特异性保守区域，设计raa引物和exo探针，并利用 ncbi 网站中的 blast 功能检验探针的特异性。本发明设计探针一条，对探针中间和3’端进行修饰，其中fam为荧光基团，thf为四氢呋喃，bhq1为淬灭基团，c3-spacer为3’封闭基团；在探针两端分别设计上下游引物各十条，经过交叉组合，反复试验验证，找到能够达到优异的反应时间和荧光值的上下游引物组合。
17.本发明还提供一种食品中铜绿假单胞菌快速检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。
18.进一步的，所述试剂盒的反应体系为：在装有冻干粉的反应单元中加入缓冲液 40.9μl，上游引物 2.0μl、下游引物 2.0μl，探针 0.6μl，dna模板 2μl；在每个反应单元的管盖上加入2.5μl乙酸镁，盖上管盖，颠倒混匀后短暂离心，体系总体积为50μl。本发明试剂盒的反应体系，可通过现有技术的raa核酸扩增试剂盒（荧光法）试剂提供，如杭州众测生物科技有限公司生产的raa核酸扩增试剂盒（荧光法）提供的试剂。
19.进一步的，加入的上游引物、下游引物浓度为10μm；加入的探针浓度为10μm。
20.进一步的，所述dna模板的制备方法为：取1ml菌液，8000g 离心5min，弃上清，加入50μl dna提取液（0.1% chelex 100），混匀后100℃水浴5min，12000g 离心5min，取上清，即为基因组dna，使用 nanodrop 2000超微量分光光度计测定浓度，-20℃保存备用。
21.进一步的，所述试剂盒的检测方法为：将上述的反应单元放入荧光检测仪中，36-42℃反应15-30min。
22.进一步的，所述试剂盒的检测方法为：将上述的反应单元放入荧光检测仪中，39℃反应20min。
23.本发明还提供一种上述试剂盒在快速检测食品中铜绿假单胞菌的应用。
24.本发明基于荧光重组酶介导等温扩增（recombinase-aided amplification，raa）技术，建立快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的方法。通过大量创造性试验，针对铜绿假单胞菌lasb基因的特异性保守区域，获得raa特异性引物和exo探针；并对提取的基因组dna进行检测，确定方法的特异性和灵敏度。
25.本发明中，特异性检测结果表明该方法仅扩增铜绿假单胞菌，与其他非铜绿假单胞菌无交叉反应，特异性良好。灵敏度检测结果显示方法对纯菌液的检测限为1.7 pg/μl。人工污染实验表明，当肉制品样液中铜绿假单胞菌污染量≥1.0
×
10
3 cfu/ml时，可以通过raa方法检出，与传统划线培养方法对比，检出限一致，同现有技术中的real-time pcr 方法也一致；但raa方法仅需20min，比后两种方法更快。
26.本发明建立的实时荧光raa检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短，为食品中铜绿假单胞菌的检测提供了新的技术平台。
27.本发明选取铜绿假单胞菌特异性基因lasb 为靶基因，设计raa 引物和exo 探针，建立了铜绿假单胞菌的实时荧光raa 方法。本发明方法具有良好的特异性；对铜绿假单胞菌的纯菌基因组dna检出限可以达到1.7
×
10
0 pg/μl，相对于现有技术（10 pg/μl），灵敏度
更高，同时可以广泛适用于食品样品中的检测。
28.通过进一步对人工污染不同浓度铜绿假单胞菌的肉制品进行raa方法检测，证明本发明raa方法对肉制品样品中铜绿假单胞菌的检出限为2.0
×
103cfu/ml，与sn/t 2099-2008的传统划线培养法检出限一致；与现有技术中建立的铜绿假单胞菌rt-pcr方法检测灵敏度1
×
10
3 cfu/ml相比略高，但是检测时间大大缩短，有效节约了人力物力成本，能够实现对铜绿假单胞菌的快速检测。
29.本发明方法能够在短时间内实现对食品中铜绿假单胞菌的快速分子检测，通过对不同样品的检测结果的对比，表明raa方法检测结果与行业标准sn/t 2099-2008的传统划线培养法法检测结果一致。
30.本发明方法作为一种简便快速的初筛方法，能够成功检出食品中的铜绿假单胞菌，检测体系特异性强，灵敏度高，检测结果准确，并且不需要复杂的仪器设备，大大缩短检测时间，可应用于食品中铜绿假单胞菌的现场快速检测，对保障我国食品安全具有重要意义。
附图说明
31.图1为实施例1-3引物探针的raa反应测试结果；图2为实施例1引物探针的特异性测试raa反应结果；图3为实施例1引物探针的特异性测试raa反应结果；图4为实施例1引物探针的对铜绿假单胞菌raa反应灵敏度结果。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
33.实施例1一种食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针，其特征在于，由序列表seq id no.1至序列表seq id no.3所示的核苷酸序列组成；其中seq id no.1至seq id no.2所示的核苷酸序列分别为上游引物和下游引物，seq id no.3所示的核苷酸序列为探针；所述探针中，对探针中间和3’端进行修饰，其中fam为荧光基团，thf为四氢呋喃，bhq1为淬灭基团，c3-spacer为3’封闭基团。
34.具体为：seq id no.1：accgagaatgacaaagtggaactggtgatccgcct；seq id no.2：ggccttcccactgatcgagcacttcgccggtcttg；seq id no.3：cgcccaactggtctacaacgtctcctacc-t（fam）-g-thf-t-t（bhq1）-cccggcgagggactgt-c3-spacer。
35.实施例2一种食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针，由序列表seq id no.1、序列表seq id no.4、序列表seq id no.3所示的核苷酸序列组成；其中seq id no.1至seq id no.4所示的核苷酸序列分别为上游引物和下游引物，seq id no.3所示的核苷酸序列为探针；所述探针中，对探针中间和3’端进行修饰，其中fam为荧光基团，thf为四氢呋喃，bhq1为淬灭基团，c3-spacer为3’封闭基团。
36.具体为：seq id no.1：accgagaatgacaaagtggaactggtgatccgcct；seq id no.4：ggccaggccttcccactgatcgagcacttcgccgg；seq id no.3：cgcccaactggtctacaacgtctcctacc-t（fam）-g-thf-t-t（bhq1）-cccggcgagggactgt-c3-spacer。
37.实施例3一种食品中铜绿假单胞菌快速检测引物、探针，其特征在于，由序列表seq id no.5、序列表seq id no.2、序列表seq id no.3所示的核苷酸序列组成；其中seq id no.5至seq id no.2所示的核苷酸序列分别为上游引物和下游引物，seq id no.3所示的核苷酸序列为探针；所述探针中，对探针中间和3’端进行修饰，其中fam为荧光基团，thf为四氢呋喃，bhq1为淬灭基团，c3-spacer为3’封闭基团。
38.具体为：seq id no.5：gggccgcaagaccgagaatgacaaagtggaactgg；seq id no.2：ggccttcccactgatcgagcacttcgccggtcttg；seq id no.3：cgcccaactggtctacaacgtctcctacc-t（fam）-g-thf-t-t（bhq1）-cccggcgagggactgt-c3-spacer。
39.实施例4一种食品中铜绿假单胞菌快速检测试剂盒，所述试剂盒包括实施例1-3任一项所述的引物和探针。
40.进一步的，所述试剂盒的反应体系为：在装有冻干粉的反应单元中加入缓冲液 40.9μl，上游引物 2.0μl、下游引物 2.0μl，探针 0.6μl，dna模板 2μl；在每个反应单元的管盖上加入2.5μl乙酸镁，盖上管盖，颠倒混匀后短暂离心，体系总体积为50μl。本发明试剂盒的反应体系，由杭州众测生物科技有限公司生产的raa核酸扩增试剂盒（荧光法）提供的试剂。
41.进一步的，加入的上游引物、下游引物浓度为10μm；加入的探针浓度为10μm。
42.进一步的，所述dna模板的制备方法为：取1ml菌液，8000g 离心5min，弃上清，加入50μl dna提取液（0.1% chelex 100），混匀后100℃水浴5min，12000g 离心5min，取上清，即为基因组dna，使用 nanodrop 2000超微量分光光度计测定浓度，-20℃保存备用。
43.进一步的，所述试剂盒的检测方法为：将上述的反应单元放入荧光检测仪中，39℃反应20min。
44.实施例5本实施例提供一种与实施例4相同的食品中铜绿假单胞菌快速检测试剂盒，所不同的是，所述试剂盒的检测方法为：将上述的反应单元放入荧光检测仪中，37℃反应22min。
45.实施例6本实施例提供一种与实施例4相同的食品中铜绿假单胞菌快速检测试剂盒，所不同的是，所述试剂盒的检测方法为：将上述的反应单元放入荧光检测仪中，41℃反应18min。
46.实验效果验证：1、实验菌株4株铜绿假单胞菌标准菌株，20株非铜绿假单胞菌菌株，均保存于本实验室，具体信息见表1；21株从检测样品中分离的经过生化确认为铜绿假单胞菌的菌株。其中17株分离自不同批次的包装饮用水，4株分离自肉制品样品。
47.表1 实验菌株信息
序号菌株来源1铜绿假单胞菌（p.aeruginosa）atcc278532铜绿假单胞菌（p.aeruginosa）atcc90273铜绿假单胞菌（p.aeruginosa）cmcc（b）101044铜绿假单胞菌（p.aeruginosa）cctccab910955类产假单胞菌（p.pseudoalcaligenes）cgmcc1.00316恶臭假单胞菌（p.putida）atcc126337施氏假单胞菌（p.stutzeri）cgmcc1.02028浅黄假单胞菌（p.luteola）cgmcc1.39499荧光假单胞菌（p.fluorescens）cgmcc1.180210栖稻假单胞菌（p.oryzihabitans）cgmcc1.339211产碱假单胞菌（p.alcaligenes）cgmcc1.180512大肠杆菌（e.coli）atcc2592213志贺氏菌（shigellacastellani）cmcc51252-714副溶血性弧菌（vibrioparahemolyticus）atcc1780215鼠李糖乳杆菌（l.rhamnosus）atcc746916单增李斯特菌（listeriamonocytogenes）cctccab9702117沙门氏菌（salmonella）cctccab9401818沙门氏菌（salmonella）cmcc(b)5007119金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）atcc653820金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）atcc3359121创伤弧菌（vibriovulnificus）atcc2756222阪崎肠杆菌（enterobactersakazalii）atcc5132923空肠弯曲菌（campylobacterjejuni）atcc3329124蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus.frankland）cctccab920232、特异性测试特异性测试包括包含性测试和排外性测试。以表1中所示菌株dna为模板，按本发明实施例4的方法进行检测。包含性测试所用菌株为4株铜绿假单胞菌标准菌株及实验室从检测样品中分离的经过生化确认为铜绿假单胞菌的菌株21株，共25株。排外性测试所用菌株包括与铜绿假单胞菌亲缘关系较近的假单胞菌属菌7株，及非假单胞菌属常见致病菌13株，共20株。
48.3、灵敏度测试提取 1ml 纯培养铜绿假单胞菌的基因组 dna，并测定其浓度，进行 10 倍梯度稀释，以不同稀释度的基因组dna 作为模板，根据按本发明实施例4的方法进行检测。
49.4、人工污染样品检测使用经sn/t 2099-2008检测确定不含铜绿假单胞菌的鸡肉、猪肉、鱼肉样品，分别称取25 g样品于225ml scdlp培养液中，拍打均匀。分别吸取混合液于7个试管中，每个试管9ml。取1.0
×
10
8 cfu/ml的铜绿假单胞菌菌悬液，稀释至107~10
1 cfu/ml系列梯度，分别加入7个试管中，制成不同初始污染浓度（106cfu/ml~10
0 cfu/ml）的肉制品样液，每个稀释度
分别取1ml进行核酸提取，并作为模板进行raa检测。同时采用传统分离划线方法进行检测，对两种方法的检测结果进行比较。
50.5、实际样品检测选取市售手撕鸡、凉拌猪耳朵、卤水猪舌、酱牛肉、凉拌莲藕、凉拌蔬菜、6 种矿泉水共12个样品。手撕鸡、凉拌猪耳朵、卤水猪舌、酱牛肉、凉拌莲藕、凉拌蔬菜无菌取样25 g；矿泉水无菌取样25ml分别加入scdlp培养液中，36℃培养16 h。取增菌液1ml 提取dna，采用建立的raa方法进行检测，同时采用sn/t 2099-2008中的传统划线培养方法进行检测，比较两种方法的检测结果。
51.6、结果分析引物探针测试结果：图1中的1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3中的引物对探针。根据图1可知，实施例1-3中的引物探针扩增效率和荧光值均较高，其中，实施例1的引物探针扩增效率和荧光值最高，最终产物长度为160bp。
52.特异性测试结果：采用实施例1的引物探针，通过建立的raa方法，分别对24株铜绿假单胞菌和18株非铜绿假单胞菌基因组dna进行特异性实验分析。结果表明，仅铜绿假单胞菌有特异性扩增曲线，其他菌株均无扩增曲线，本实验选取的引物探针和方法对铜绿假单胞菌有良好的特异性。部分菌株raa扩增曲线见图2、图3，其中，测试模板为铜绿假单胞菌atcc27853、铜绿假单胞菌atcc9027、铜绿假单胞菌cmcc（b）10104、类产假单胞菌（cgmcc 1.0031）、恶臭假单胞菌（atcc12633）、施氏假单胞菌（cgmcc1.0202）、浅黄假单胞菌（cgmcc1.3949）、荧光假单胞菌（cgmcc1.1802）、栖稻假单胞菌（cgmcc1.3392）、产碱假单胞菌（cgmcc1.1805）、大肠杆菌（atcc 25922）、志贺氏菌（51252-7）、副溶血性弧菌（atcc17802）、金黄色葡萄球菌（atcc6538）、无菌水。
53.灵敏度测试结果：测定所提取的铜绿假单胞菌基因组dna 为1.7
×
10
5 pg/μl，将其10 倍梯度稀释至1.7
×
10-1 pg/μl，进行raa检测。结果表明，实时荧光 raa方法的检出限为1.7
×
10
0 pg/μl，如图4所示，其中，1：1.7
×
105，2：1.7
×
104，3：1.7
×
103，4：1.7
×
102，5：1.7
×
101，6：1.7
×
100，7：1.7
×
10-1
，8：ddh2o。
54.人工污染样品检测结果：对人工污染铜绿假单胞菌的鸡肉、猪肉、鱼肉制品样品，每个稀释度取1ml模拟污染液，提取核酸，分别进行raa方法和传统划线方法检测，并对结果进行比对分析。
55.样品中人工污染不同浓度的铜绿假单胞raa检测结果和传统划线培养结果见表2，结果表明， raa对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限为1.0
×
103cfu/ml，传统划线培养法检出限为1.0
×
10
3 cfu/ml，说明肉制品中raa灵敏度与传统划线培养法一致。raa方法能在20min内完成检测，而标准检测方法需要进行36℃ 18-24h增菌，相比之下，raa方法能大幅度节省检测时间。
56.表2 肉制品中不同浓度的铜绿假单胞菌raa和传统方法检测结果比较
食品中铜绿假单胞菌的实际检测结果：手撕鸡、凉拌猪耳朵、卤水猪舌、酱牛肉、凉拌莲藕、凉拌蔬菜、6 种矿泉水共12 个样品的营养肉汤增菌液进行dna 提取，以铜绿假单胞菌为阳性对照，采用建立的raa方法进行检测，同时采用sn/t 2099-2008中的传统划线培养方法进行检测，结果显示，凉拌猪耳朵和一种矿泉水中检测出含有铜绿假单胞菌。raa方法检测结果与现有行业标准sn/t 2099-2008检测结果一致。
57.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
58.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过本领域任一现有技术实现。