鉴定有毒植物的DNA条形码及其检测方法与流程

鉴定有毒植物的dna条形码及其检测方法
技术领域
1.本发明属于研究领域，具体涉及鉴定有毒植物的dna条形码及其检测方法。


背景技术：

2.有毒植物在自然界中广泛分布，十分常见，与人们的生活息息相关。若在日常生活中不慎接触到或者误食有毒植物，可能会引起很多中毒现象、疾病甚至死亡。此外，在因食物中毒引起的某些死亡案件中，判断中毒的源头是破案的关键。因此，对于有毒植物的检测，特别是区分和判别常见有毒植物种类具有重要意义。
3.dna条形码是一种分子鉴定新技术，该技术能够利用标准的、具有足够变异、易扩增且相对较短的dna片段实现物种鉴定。该技术可用于发现新种和保护生物多样性，可有效监控珍稀濒危物种进、出口贸易，可实现有害生物及入侵种的快速查验，对我国生物资源保护具有重大意义。dna条形码的概念2003年由加拿大分类学家paμl hebert首次提出后就在世界范围内受到了广泛关注。2005年前后，dna条形码被引入植物研究中。2009年，国际生命条形码联盟植物工作组(cbol plant working group)初步推荐使用叶绿体基因rbcl和matk片段。我国学者陈士林等对dna条形码在药用植物中的研究进行了详细的论述，并建议建立以its2为核心以trnh-psba为辅的植物类药材dna条形码鉴定体系。laura jaakola等利用dna条形码技术结合高分辨率溶解曲线成功的鉴别了蓝莓品种northcountry和northblue，为以dna条形码鉴别有毒植物种类的可行性提供了参考。线粒体coi基因的序列作为dna条形码在大部分动物中十分有效。在植物分类学研究中，由于物种多样性的影响，dna条形码的进展相对缓慢，尚未找到统一且有效鉴定的dna条形码能够鉴别所有物种。
4.有毒植物在自然界分布广泛且常见，容易被人或牲畜等误用误食，在毒物溯源的过程中，由于很多成分在不同的物种中都有一定的含量，使用成分分析等化学方法无法唯一有效确定中毒源头植物，使用dna鉴定方法快速简便有效且唯一。本发明针对常见的24种有毒植物，通过对叶绿体基因组比对分析，筛选出了能够准确鉴定这24种有毒植物的dna条形码及其组合。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种鉴别有毒植物的dna条形码及其检测方法，本发明的目的之二在于提供一种快速鉴别有毒植物种类的方法。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.1、鉴定有毒植物的dna条形码，所述dna条形码的核苷酸序列如seq id no.1～3所示。
8.作为优选的技术方案之一，用于扩增seq id no.1的引物对的核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.5所示。
9.作为优选的技术方案之一，若所述的引物对所扩增产物的32bp，36bp，349bp，588bp和669bp为c，则分别为玉掌半夏、匍枝毛茛、夹竹桃、千里光和洋地黄；
10.若扩增产物的126bp，180bp，372bp，447bp，645bp和656bp为g，则分别为蔓长春花、鸡矢藤、络石、曼陀罗、芸香和南方紫铃花；
11.若扩增产物的162bp，270bp为a，则分别为乌桕和小果博落回；若39bp，621bp为t，则分别为毛地黄叶钓钟柳和银杏；
12.若扩增产物的247bp为a，且256bp为g，则为白屈菜。
13.作为优选的技术方案之一，用于扩增seq id no.2的引物对的核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.7所示。
14.作为优选的技术方案之一，若所述的引物对所扩增产物的143bp，208bp，292bp为a，则分别为开口箭、互叶醉鱼草、鹅绒藤；若扩增产物的39bp，121bp为c，则分别为南天竹和金钱蒲；若扩增产物的33bp，69bp为g，则分别为蓍草和玉簪。
15.作为优选的技术方案之一，用于扩增seq id no.3的引物对的核苷酸序列如seq id no.8、seq id no.9所示。
16.作为优选的技术方案之一，若所述引物对扩增产物的156bp为g则为萱草。
17.2、一种快速鉴别有毒植物种类的方法，其特征在于，包括以下步骤：
18.1)以待测有毒植物dna为模板，用上述引物对进行聚合酶链式反应扩增，对扩增产物进行电泳检测；
19.2)若电泳结果中存在与上述dna条形码对应的dna条带，则对扩增产物进行测序，对测序结果比对分析后，通过碱基序列的差异进行鉴定。
20.本发明的有益效果在于：
21.本发明公开的有毒植物种类的鉴定方法，以待检测的有毒植物dna为模板，对有毒植物的dna条形码进行pcr扩增，并进行电泳检测，电泳结果中存在与所述dna条形码对应的dna条带，进一步对扩增产物进行测序，对扩增产物序列的比对分析，通过dna条形码的碱基序列差异进行鉴定。本发明由于采用的dna条形码碱基序列长度较短，仅需1到2小时即可获得扩增条带，扩增条带测序过程仅需1小时左右，因此可以用于有毒植物种类的快速鉴定；又因为在dna水平的检测结果对于该物种是唯一且不变的，因此可以实现准确鉴定。
附图说明
22.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
23.图1中为被检测的16种有毒植物dna条形码rbcl序列比对结果；
24.图2为被检测的13种有毒植物dna条形码ropb序列比对结果；
25.图3为被检测的6种有毒植物dna条形码ropc1序列比对结果。
26.图4为被检测的24种有毒植物的系统发育分析结果。a为rbcl序列片段；b为ropb序列片段；c为rpoc1序列片段。
27.图5为24种被检测有毒植物样本的形态照片。
具体实施方式
28.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实
施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
29.实施例1
30.以seq01，seq02，seq03，seq04，seq05和seq06作为三个dna条形码引物对，以待检测的有毒植物dna为模板，对有毒植物中特定的dna条形码片段进行pcr扩增，对扩增获得的产物进行电泳检测，筛选出了3个dna条形码，大小约为743bp(seq id no.1)，518bp(seq id no.2)和529bp(seq id no.3)(种类间长度无差异)。
31.进一步对扩增产物进行dna序列测序，通过对扩增产物序列的比对，分析dna条形码的碱基序列有无差异进行鉴定。
32.具体步骤如下：
33.(1)采用常规ctab法分别提取24种待测有毒植物的基因组dna(即样品dna)，24种有毒植物如图5所示，提取步骤如下：
34.①
取0.5g左右叶片组织经液氮速冻后快速研磨成粉末状，转入2ml离心管中；
35.②
立即加入65℃预热的ctab提取缓冲液700μl以及β-巯基乙醇20μl，剧烈震荡至充分混匀，置65℃水浴中保温20min，期间不断取出上下颠倒混匀，后冷却至室温；
36.③
加等体积的氯仿/异戊醇＝24:1，轻轻地颠倒混匀，于室温下12000rpm离心10min，转移上清液至新的1.5ml离心管中；
37.④
向上述上清液中加入等体积经-20℃预冷的异丙醇，轻轻地颠倒混匀至有白色絮状沉淀出现后，静置于-20℃15min使沉淀生成,于4℃12000rpm离心10min，倒掉上清液，保留沉淀物(dna)；
38.⑤
加入700μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀物，上下颠倒混匀之后(13000rpm离心1min)，倒掉上清液，保留沉淀，并重复本步骤一次；
39.⑥
加入500μl预冷的无水乙醇洗涤沉淀(13000rpm离心1min)，倒掉上清液，沉淀静置风干后溶于50μlddh2o中4℃过夜；
40.⑦
取溶解后的样品dna 1μl用核酸浓度测定仪测定dna浓度、纯度。经检测样品dna的od260/280介于1.8-2.0之间、经0.8％的琼脂糖核酸电泳检测dna样品无杂质、无明显降解的条件下，将各待检测植物的dna加水稀释至终浓度为100ng/μl待用；
41.(2)按照seq01、seq02、seq03、seq04、seq05和seq06合成的单链寡聚dna，分别加水稀释成10μmol/l水溶液，序列分别为：
42.seq01:5
’‑
atgtcaccacaaacagagac-3’(seq id no.4)
43.seq02:5
’‑
tcgcatgtacctgcagtagc-3’(seq id no.5)
44.seq03:5
’‑
aagtgcattgttggaactgg-3’(seq id no.6)
45.seq04:5
’‑
gatcccagcatcacaattcc-3’(seq id no.7)
46.seq05:5
’‑
ggcaaagagggaagatttcg-3’(seq id no.8)
47.seq06:5
’‑
ccataagcatatcttgagttg-3’(seq id no.9)
48.(3)在0.2mlpcr管中加入：4μl 2.5mmol/l的dntp,1.5μl 25mmol/l的mgcl2,5μl 10*rtaq缓冲液，步骤(2)配制的seq01和seq02引物溶液各1.0μl，步骤(1)配制的待测样品(seq01、seq02、seq03、seq04、seq05或seq06)dna溶液1.5μl，加入taq聚合酶1个单位，加水至总体积50μl，轻微震荡混匀，瞬时离心；
49.在0.2ml pcr管中加入：4μl 2.5mmol/l的dntp,1.5μl 25mmol/l的mgcl2，5μl 10*rtaq缓冲液，步骤(2)配制的seq03和seq04引物溶液各1.0μl，步骤(1)配制的待测样品dna溶液1.5μl,加入taq聚合酶1个单位，加水至总体积50μl，轻微震荡混匀，瞬时离心；
50.在0.2ml pcr管中加入：4μl 2.5mmol/l的dntp,1.5μl 25mmol/l的mgcl2，5μl 10*rtaq缓冲液，步骤(2)配制的seq05和seq06引物溶液各1.0μl，步骤(1)配制的待测样品dna溶液1.5μl,加入taq聚合酶1个单位，加水至总体积50μl，轻微震荡混匀，瞬时离心；
51.(4)把上述配置的3种pcr管置于pcr仪上，分别执行下述程序：
52.①
94℃5min9994℃30s,55℃30s,72℃35s9*35cycles972℃10min94℃10min；
53.②
94℃5min9994℃30s,56℃30s,72℃46s9*35cycles972℃10min94℃10min；
54.③
94℃5min9994℃30s,56.5℃30s,72℃46s9*35cycles972℃10min94℃10min；
55.(5)把pcr管中的产物6μl进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，检查不同待测样品dna pcr反应中产生的dna条带；
56.(6)把pcr管中剩下产物送华大基因进行序列测定，检查不同待测样品dna条形码的碱基序列。
57.将测序结果进行序列比对分析和系统进化分析，获得待测样本的种属信息。
58.结果如下：
59.1.通过seq01和seq02获得第一个dna条形码(rbcl序列)大小为743bp，如图1中序列比对图所示，有16处不一样：
60.玉掌半夏的序列在32bp处为c，匍枝毛茛的序列在36bp处为c，夹竹桃的序列在349bp处为c，千里光的序列在588bp处为c，洋地黄的序列在669bp处为c；蔓长春花的序列在126bp处为g，鸡矢藤的序列在180bp处为g，络石的序列在372bp处为g，曼陀罗的序列在447bp处为g，芸香的序列在645bp处为g，南方紫铃花的序列在656bp处为g；乌桕的序列在162bp处为a，小果博落回的序列在270bp处为a；毛地黄叶钓钟柳的序列在39bp处为t，银杏的序列在621bp处为t；白屈菜的序列在247bp处为a，且在256bp处为g。
61.2.通过seq03和seq04获得第二个dna条形码(ropb序列)大小为518bp，如图2中序列比对图所示，有7处不一样：
62.开口箭的序列在143bp处为a，互叶醉鱼草的序列在208bp处为a，鹅绒藤的序列在292bp处为a；南天竹的序列在39bp处为c，金钱蒲的序列在121bp处为c；蓍草的序列在33bp处为g，玉簪的序列在69bp处为g。
63.3.通过seq05和seq06获得第三个dna条形码(rpoc1序列)大小为529bp，如图3中序列比对图所示，有1处不一样：
64.萱草的序列在156bp处为g。
65.实施例2
66.系统发育树鉴定
67.对实施例1中的二十四种有毒植物的三个dna条形码测序结果进行系统发育分析。具体地，系统发育树构建步骤如下：
68.1.将所扩增的对应dna条形码的测序结果格式改为fasta格式，并放在一个txt文件中；
69.2.在mega5.0软件中，点击align，按照默认选项进行序列比对；
70.3.将比对好序列文件进行保存，此处保存为meg格式；
71.4.点击phylogeny构建进化树，用neighbor-joining法构建进化树，其中用bootstrap method重复1000次。
72.所获得的系统进化分析结果如图4所示，其中，a为rbcl序列片段；b为ropb序列片段；c为rpoc1序列片段；从图4可以看出，通过系统分析所获得的进化树结果与本发明的技术方案结果一致，发明的鉴定结果吻合，进一步说明了本发明的准确性和可靠性。
73.采用有毒植物叶片提取dna进行检测，取样部位不影响检测结果的一致性，取样部位和取样时间不影响检测结果。本发明可以用于有毒植物种类的快速准确鉴定，从而为有毒植物的快速鉴别提供实验依据。
74.最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。