一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法与流程

1.本发明涉及一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法，属于代谢技术领域。


背景技术：

2.维生素k作为一类重要的脂溶性维生素，是人体不可缺少的重要维生素之一，在加速凝血、预防心血管硬化和治疗骨质疏松等方面起着关键作用。维生素k以2
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甲基
‑
1,4
‑
萘醌为骨架，根据c3位支链结构的不同，可将维生素k分成不同的亚型。其中七烯甲萘醌(menaquinone
‑
7,mk
‑
7)由于具有在人体中半衰期长、亲缘性高等特点，目前在功能性食品和医药等领域备受关注。发明人课题组前期申请的中国专利目cn110157749b已在枯草芽孢杆菌中达到了较高mk
‑
7产量，但是在研究中发现常规的代谢改造，如强化合成途径、阻断副产物的形成等，很难进一步提高mk
‑
7的产量。
3.功能膜微域(functional membrane microdomains,fmms)是细菌细胞脂膜上富含固醇类似物聚异戊二烯化合物的一类结构致密性微域，并且富含特殊的脚手架蛋白。这类脚手架蛋白作为一种膜结合伴侣蛋白，仅定位在fmms上，可以招募需要定位在fmms上的蛋白并促进这些蛋白的相互作用以及寡聚化，在组织和形成fmms的过程中起到重要作用。目前还没有研究表明是否能够通过对枯草芽孢杆菌中的fmms进行强化，增加fmms在细胞质膜中的占比，增加mk
‑
7在细胞质膜上的存储空间以提高mk
‑
7的产量。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明通过对fmms中的floa、flot蛋白进行强化，增加fmms在细胞质膜上的占比后，进一步提高了mk
‑
7的产量。
5.本发明的第一个目的是提供一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法，所述方法是通过强化表达产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌功能膜微域中的脚手架蛋白floa。
6.进一步地，所述的强化表达是通过使用强启动子进行强化表达。
7.进一步地，所述的强启动子为p43启动子。
8.本发明的第二个目的是提供一种产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌重组菌，所述的枯草芽孢杆菌重组菌是通过强化表达枯草芽孢杆菌宿主功能膜微域中的脚手架蛋白floa获得。
9.进一步地，所述的强化表达是通过使用强启动子p43进行强化表达。
10.进一步地，所述的强启动子p43的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.进一步地，所述的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌bs20。枯草芽孢杆菌bs20在专利cn110157749b中公开。
12.进一步地，所述的脚手架蛋白floa的编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
13.本发明的第三个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌重组菌在发酵生产七烯甲萘醌中的应用。
14.进一步地，所述应用具体是将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，进行发酵培养，获得七烯甲萘醌。
15.本发明的有益效果是：
16.本发明通过对已高产mk
‑
7的重组枯草芽孢杆菌bs20中的脚手架蛋白使用强启动子p43进行强化，增加fmms在细胞质膜上的占比后，进一步提高了mk
‑
7的产量，与对照菌株bs20相比，强化floa的重组枯草芽孢杆菌bsq1产量最高，发酵6天后，bsq1菌株产量达到417.08mg/l，较bs20菌株提升了16.57％。
附图说明：
17.图1为发酵6天后，bs20、bsq1、bsq2、bsq12菌株发酵生产mk
‑
7的产量。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
19.(1)培养基
20.种子培养基的成分包括：10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉和10g/l氯化钠。
21.发酵培养基的成分包括：50g/l葡萄糖、50g/l甘油、50g/l大豆蛋白胨、0.6g/l磷酸二氢钾。
22.(2)mk
‑
7萃取剂：异丙醇和正已烷混合物(1:2,v/v)
23.(3)hplc检测mk
‑
7产量：采用agilent zorbax eclipsexdb
‑
c18分离柱(5μm，250
×
4.6mm)，检测的温度在40℃，流动相使用甲醇：二氯甲烷(9:1,v/v)，流速为1ml/min，检测波长254nm，进样量10μl。
24.(4)菌株生长情况检测：使用紫外
‑
可见分光光度计定时测定发酵液的吸光光度值od
600
。
25.实施例1：重组枯草芽孢杆菌bsq1、bsq2的构建
26.分别将p43启动子通过cre/loxp系统整合在重组枯草芽孢杆菌bs20基因组上floa(yuag)和flot(yqfb)的上游，构建重组枯草芽孢杆菌bsq1和bsq2，具体构建过程如下。
27.通过重叠延伸pcr，对以下序列进行片段扩增，p43
‑
floa整合框所需的扩增序列为floa上游序列(长度1000bp，序列如seq id no.1)、氯霉素抗性基因zeo序列(1309bp，序列如seq id no.2)、p43启动子(0.3bp，序列如seq id no.3)和floa序列(996bp，序列如seq id no.4)。p43
‑
flot整合框所需的扩增序列为flot上游序列(长度1000bp，序列如seq id no.5)、氯霉素抗性基因zeo序列(1309bp)、p43启动子(0.3bp)和flot序列(1000bp，序列如seq id no.6)。引物序列见表1，其中floa
‑
p7c6
‑
1r和floa
‑
p43
‑
1f为两个整合框的通用引物。通过融合pcr获得floa
up
‑
lox71
‑
zeo
‑
lox66
‑
p43
‑
floa和flot
up
‑
lox71
‑
zeo
‑
lox66
‑
p43
‑
flot融合表达框。
28.表1
[0029][0030]
将获得的融合表达框片段通过化学转化的方式整合至重组枯草芽孢杆菌bs20基因组中，整合片段的添加量约为1000ng。通过添加氯霉素抗性的lb固体培养基进行筛选、挑取单菌落进行pcr验证、测序验证，确认整合成功。
[0031]
对整合成功的重组枯草芽孢杆菌进行氯霉素抗性的消除，通过化学转化的方式将cre质粒转入构建好的重组枯草芽孢杆菌中，经添加卡纳抗生素的lb固体培养基筛选后，通过iptg诱导cre质粒的表达，消除抗性基因。cre质粒的消除通过挑取单菌落接种到lb液体培养基中，50℃摇床培养12h消除。通过点板无抗、添加氯霉素抗生素、添加卡纳抗生素的lb平板进行筛选，挑选成功消除氯霉素抗性和cre质粒的单菌落，最后得到分别整合p43
‑
floa和p43
‑
flot的重组枯草芽孢杆菌，命名为bsq1和bsq2。
[0032]
实施例2：重组枯草芽孢杆菌bsq12的构建
[0033]
在实施例1得到的bsq1的基础上采用与实施例1类似的方法，将p43启动子整合在bsq1基因组上flot的上游，构建重组枯草芽孢杆菌bsq12。
[0034]
将实施例1构建好的flot
up
‑
lox71
‑
zeo
‑
lox66
‑
p43
‑
flot融合表达框通过化学转化的方式转入bsq1中，经氯霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证、测序、转入cre质粒、卡纳抗性平板筛选、iptg诱导表达、cre质粒消除、点板验证，最后获得整合p43
‑
floa和p43
‑
flot表达框的重组枯草芽孢杆菌bsq12。
[0035]
实施例3：菌株发酵生产mk
‑7[0036]
(1)种子液制备
[0037]
将重组枯草芽孢杆菌bs20、以及实施例1、2中构建的bsq1、bsq2、bsq12挑取单菌落分别接种到15ml摇菌管中，每管含有2ml液体种子培养基，在37℃、220rpm条件下摇床培养10h。bs20作为对照，每株菌三个平行。
[0038]
(2)发酵培养
[0039]
将步骤(1)得到的种子液按照10％的接种量接种到250ml锥形瓶中，每瓶装有发酵培养基20ml，于41℃、220rpm条件下摇床培养3d，每隔24h取样进行od
600
的检测和样品的制备。具体方法如下。
[0040]
每天取发酵液1.2ml。取20μl发酵液，用无菌水稀释50倍，摇晃均匀，进行od
600
的检测；取500μl发酵液加入到4倍体积的mk
‑
7萃取剂中，涡旋振荡提取10min后，滤出提取液，8000r/min离心5min。收集上清液，hplc检测全细胞组分mk
‑
7的含量。检测结果见图1。发酵6天后，bsq1菌株产量达到417.08mg/l，较bs20菌株提升了16.57％；bsq2菌株在发酵前期mk
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7含量略有增加，发酵后期产量明显降低；bsq12菌株在发酵过程中mk
‑
7含量均低于对照，后期下降幅度增大。结果表明强化fmms脚手架蛋白合成基因floa、flot对mk
‑
7产量的合成是有影响的，其中floa对mk
‑
7的合成有一定的正向效果，达到了提升mk
‑
7产量的效果。
[0041]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。