一种抗人CD47的单克隆抗体及其应用的制作方法

一种抗人cd47的单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗人cd47的单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.cd47又称整合素相关蛋白(iap)，为免疫球蛋白超家族的成员之一，是一个五次跨膜蛋白，由这五次跨膜区域片段以及一个短小的羟基端胞质尾区构成。cd47蛋白有3个结构域，其中一个igv样细胞外结构域，已经证明能直接结合到信号调节蛋白α(sirpα)上。sirpα首次被发现是作为一种特异性的表达于脑组织细胞表面的糖蛋白的形式。当sirpα与cd47相互作用后，介导sirpα胞内域酪氨酸磷酸化，而sirpα反作用于cd47使其胞内域的cdc42被激活。
3.cd47是一个广泛表达的抗原，存在于大多数组织的多种细胞上。并且，cd47在大多数肿瘤细胞上的表达高于其相应的正常细胞，如肝癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种实体瘤细胞，以及aml、cml、all、nhl、mm等多种血液肿瘤。研究表明，cd47的高表达与不良预后相关。cd47作为最重要的“自我”识别分子，在免疫识别尤其是固有免疫识别中发挥着关键作用，被认为是调节固有免疫的检验点分子。cd47与骨髓来源的固有免疫细胞尤其是巨噬细胞表面的免疫负调控分子，sirpα结合，释放“do not eat me”信号，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用，是肿瘤逃避免疫攻击的机制之一。
4.因此，阻断cd47与sirpα的结合对于恢复抗肿瘤免疫反应，从而获得有效的肿瘤免疫治疗，是一个非常有希望的治疗策略。
5.目前以肿瘤治疗为目的提出了多种靶向cd47/sirpα的策略。例如，将人sirpα的结合域修饰成高亲和变体，同样的，cd47的变体也用于肿瘤免疫治疗。另外，抗体或者其他靶向cd47/sirpα的阻断性药物能够阻断肿瘤细胞和巨噬细胞的相互作用从而诱导吞噬作用，具有有效治疗肿瘤的潜力。
6.对cd47的运用不是一帆风顺的。2012年6月，celgene公司的cd47抗体cc-90002试验项目成立，此项目的临床前动物实验表明，cd47抗体cc-90002几乎对所有的肿瘤类型都有效果。然而在2018年底，celgene公司中止了cd47单抗cc-90002用于治疗aml和mds的单药临床试验。
7.cd47在红细胞上的表达量是随着细胞周期发生变化的，这种细胞表面表达量的变化使得衰老的红细胞表面cd47的表达量减弱，促使巨噬细胞对其进行吞噬，以保证红细胞在体内的平衡。然而，由于cd47药物的干预，在促进巨噬细胞清除肿瘤细胞的同时，由于正常血液系统表面cd47表达，因此cd47/sirpα信号通路会参与红细胞吞噬过程的调节，也一定程度上参与血小板及淋巴细胞的调节，导致不可避免的误伤红细胞，导致红细胞凝集。在临床中，血液系统副作用例如贫血、血小板减少症成为限制cd47在临床上使用的限制因素，从而影响靶向cd47抗体药物的临床应用前景。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题是降低cd47抗体的副作用，筛选出减少或者消除血红细胞结合力的cd47抗体。
9.为了解决上述技术问题，本发明提供一种新型鼠抗人cd47抗体，在能够在人cd47和人或鼠sirpα的结合中起到阻断作用，可应用于肿瘤免疫治疗。更重要的是，2c8在体外血细胞凝集试验中表现出良好的安全性。
10.本发明所要解决的技术问题是提供一种新型鼠抗人cd47抗体及其可变区序列，本抗体与cd47特异性强，其可变区序列可用于构建基因工程抗体，在体外不引起血细胞凝集，并且已经在体内外验证了其抗肿瘤活性。
11.本发明提供一种抗原结合蛋白，具有seq id no.1-3所示的或具有与其80％以上同一性的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区域。
12.优选地，所述抗原结合蛋白具有seq id no.5-7所示的或具有与其80％以上同一性的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区域；更优选地，所述抗原结合蛋白选自fab、fab'、f(ab')2、fd、dab、互补决定区片段、单克隆抗体、单链抗体、单结构域抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
13.所述的抗原结合蛋白其重链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示的或具有与其80％以上同一性，和/或轻链可变区氨基酸序列如seq id no.8所示的或具有与其80％以上同一性。
14.所述的抗原结合蛋白，其重链可变区核苷酸序列如seq id no.9所示或具有与其80％以上同一性，和/或其轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.10所示的或具有与其80％以上同一性
15.在本发明的实施例中，提供的抗原结合蛋白为单克隆抗体。
16.作为优选，所述单克隆抗体由选自sp2/0、yb2/0、ir983f、人骨髓瘤namalwa、perc6或cho细胞系的细胞产生。
17.本发明具体提供了一种抗人cd47的单克隆抗体，其由保藏编号为cgmcc no.17683的细胞产生。
18.本发明还提供所述的抗原结合蛋白或单克隆抗体在制备检测或治疗肿瘤药物的用途。
19.作为优选，所述肿瘤包括但不限于burkitt淋巴瘤或结肠癌。
20.本发明还提供了保藏号为cgmcc no.17683的鼠抗人cd47的杂交瘤细胞株2c8。
21.本发明还提供了由保藏号为cgmcc no.17683的鼠抗人cd47的杂交瘤细胞株2c8产生的鼠抗人cd47单克隆抗体。
22.本发明还提供了一种核苷酸分子，所述的核苷酸分子编码上述鼠抗人cd47单克隆抗体。所述的核苷酸分子编码鼠抗人cd47单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如seq id no.9所示；编码鼠抗人cd47单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.10所示。
23.上述杂交瘤细胞株2c8的编号为cgmcc no.17683，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2019年5月15日。
24.本发明通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选，运用rt-pcr克隆ig可变区基因，获得1株
能够稳定分泌cd47抗体的杂交瘤，鉴定出其可变区序列，并用流式细胞术对抗体结合特异性进行了检测，所述cd47单克隆抗体2c8与cd47蛋白具有高亲和性，kd值为0.2991
×
10-9
m，结合特异性强，能够特异性结合cd47阳性细胞系jurkat与敲降细胞系cd47shrna-gfp-jurkat的结合弱。且本发明所述cd47单克隆抗体2c8能够显著体外促进人和小鼠巨噬细胞吞噬肿瘤。
25.本发明提供的cd47单克隆抗体2c8能够有效抑制nod/scid鼠burkitt’s淋巴瘤异种移植瘤，最小剂量200ug，每周两次，治疗两周，肿瘤抑制率高达95％，较高剂量(400ug)抑制率约100％，并且显著延长小鼠生存期。
附图说明
26.图1：流式检测2c8抗体与cd47阳性细胞株的亲和能力结果图；
27.图2：2c8抗体与市售抗体b6h12的竞争能力比较结果图；
28.图3：2c8抗体与cd47阳性细胞特异性结合结果图；
29.图4：2c8抗体对人和小鼠巨噬细胞吞噬cd47敲降细胞系的促进作用较弱的结果图；
30.图5：2c8抗体促进小鼠巨噬细胞吞噬不同肿瘤细胞的结果图；
31.图6：2c8抗体促进人巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的结果图；
32.图7：2c8抗体对人巨噬细胞的促吞噬作用具有剂量依赖的结果图；
33.图8：2c8抗体对小鼠巨噬细胞的促吞噬作用的剂量依赖的结果图；
34.图9：2c8抗体在不同剂量下对红细胞(rbc)凝聚的影响的结果图；
35.图10：2c8抗体显著抑制小鼠移植瘤生长图；
36.图11：2c8抗体显著延长移植瘤小鼠生存的结果图。
37.保藏说明：
38.杂交瘤细胞株2c8的编号为cgmcc no.17683，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
39.保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2019年5月15日。
具体实施方式
40.本发明公开了一种抗人cd47的单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
41.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
42.实施例1：小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选
43.将cd47插入pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp载体以构建慢病毒表达载体，包装293t细胞产生慢病毒，转染3t3细胞为免疫原(以下称为cd47 -3t3细胞)，令3t3细胞膜表面稳定表达人cd47蛋白。
44.采用1x107个cd47
-3t3细胞/次，共3次腹腔注射方式免疫六周龄balb/c雌鼠，每次免疫间隔1～2周，第三次免疫后第八天取小鼠尾血与cd47阳性细胞jurkat流式鉴定效价。并在三次免疫1～2周后进行腹腔注射1
×
107个cd47
-3t3细胞加强免疫。
45.鉴定效价的步骤如下：
46.取小鼠尾血溶于pbs中，室温静置1小时。12000rpm 4℃离心10分钟，收上清，弃沉淀，用pbs对倍稀释成不同浓度，从1:200稀释到1:12800。收集3t3、cd47
-3t3细胞，pbs洗1次，每个样品用1
×
106个细胞，将100μl不同稀释度的小鼠血清加入到细胞中，混匀，以未免疫小鼠血清作为阴性对照组，4℃孵育30min，pbs洗两次，每孔加入0.2μl抗小鼠igg抗体(apc标记)，4℃避光孵育30分钟，于500μl pbs缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测血清中抗体与细胞的结合情况，分析百分率及荧光强度，当检测cd47
-3t3细胞平均荧光强度为3t3细胞的两倍以上时，对应的稀释度为有效效价，效价高于6400时，对应的免疫小鼠可作为融合小鼠。
47.融合前3天，对融合小鼠通过尾静脉注射免疫细胞的方式进行冲击免疫。融合前两天在融合用的平底96孔板上铺滋养层细胞。步骤如下：健康八周大balb/拖颈处死，体表消毒后在下腹部中央剪开一个小口，划开腹膜，
48.融合步骤如下：取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤sp2/0细胞在37℃水浴的环境下进行细胞混合(以5:1～10:1比例)，离心后，充分弃去上清。将50％peg在1min之内加入该混匀细胞团之中，37℃水浴震荡1min；在2min之内加入10ml无血清1640培养基；500g，5min离心，弃上清；用含有hat的1640培养基重悬细胞，混匀并移液入平底96孔板，细胞数为2.5x107个/板；在37℃，5％co2条件下培养细胞。
49.大约在一周后，当观察到所述克隆足够大时(至少为平底96孔板单孔面积的1/8)，进行培养上清筛选检测。即每孔取100μl上清液与2x105个cd47
-3t3细胞共孵育，流式检测阳性情况，操作方法与检测效价相同。平均免疫荧光强度为阴性孔两倍以上作为阳性孔，对应的杂交瘤作为阳性杂交瘤，进行下一步操作，否则作为阴性杂交瘤弃去。
50.将阳性杂交瘤克隆从96孔板扩至24孔板培养3-5天，再次进行培养上清重复筛选检测，复测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。
51.有限稀释法对复测阳性的24孔板进行亚克隆。对将24孔板中杂交瘤细胞吹匀，细胞密度调整为10个/ml，将细胞铺到平底96孔板中，每孔200μl，37℃、5％co2孵箱培养，培养10天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取100μl培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，至少进行3轮亚克隆培养后，直至随机选取孔板中的所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。
52.向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，本次鼠抗人cd47的杂交瘤细胞株编号2c8获得的保藏号为cgmcc no.17683。
53.重链
54.qvqlqqsgaelmkpgasvkisckatgytfsrywiewvnqrpghglewigeilpgnininynekfkgkatftadtssntaymqlssltsddsavyycartglrrfdywgqgttltvss
55.cdrh1:gytfsrywie
56.cdrh2:eilpgnininynekfkg
57.cdrh3:tglrrfdy
58.轻链
59.envltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsssylhwyqqksgaspklwiystsnlasgvparfsgsgsgtsysltissveaedaatyycqqysgypytfgggtkmeikrad
60.cdrl1：rasssvsssylh
61.cdrl2：stsnlas
62.cdrl3：qqysgypyt
63.实施例2：腹水制备及纯化
64.0.5ml液体石蜡腹腔注射到8～10周balb/c雌鼠体内。一周后，收2c8杂交瘤细胞，pbs洗两次，离心500g，5min。以每只5x106/0.5ml的细胞量腹腔注射到预致敏的balb/c小鼠体内。7天后密切观察到小鼠的状态及腹部情况，观察到小鼠活动受限时，脱椎处死小鼠并取出腹水。
65.收集腹水，3000rpm，10min，rt，收集上清。以终浓度为33％的饱和硫酸铵对抗体进行粗纯，边加硫酸铵边搅拌，放置4℃过夜。第二天离心10000rpm，10min，弃上清，用少量pbs溶解后装入预处理的透析袋内，扎紧透析袋，在4℃环境下pbs透析除盐2天，期间每天换液3次。
66.粗纯后的抗体利用akta蛋白纯化系统，按照ge公司提供的纯化手册，经1ml proteing纯化预装柱纯化，并用超滤管浓缩。经纯化浓缩后可得到高浓度的抗体纯品。
67.实施例3：单克隆抗体效价检测
68.对抗体纯品进行pe荧光标记。标记后的抗体以终浓度479.50nm、239.75nm、119.87nm、59.94nm、29.97nm、14.98nm、7.49nm、3.75nm、1.87nm、0.94nm、0.47nm、0.23nm分别与2.5
×
105jurkat室温避光共孵育30min。500g，5min离心，弃上清，pbs洗细胞，重复三次，400μl pbs重悬细胞中，facs测定荧光强度，统计平均值。用graphpad prism 5软件分析抗体的kd值。2c8的kd值为0.2991
×
10-9
m。(见图1)
69.rt-pcr法克隆ig可变区基因
70.总rna提取，单链cdna合成，步骤如下：
71.收2c8杂交瘤细胞株，用trizol(invitrogen)提取细胞总rna，用m-mlv逆转录酶(invitrogen)将总rna逆转为cdna文库。rt-pcr扩增抗人cd47抗体重链(vh)、轻链(vl)可变区基因片段。
72.重链骨架区上游引物
73.p1:5’saggtgmagctkcassartcwgg3’74.重链可变区下游引物
75.p2:5’tggggstgtygttttggctgmrgagacrgtga3’76.轻链前导肽上游引物
77.p3:5’atggagacagacacactcctgctat3’78.轻链可变区下游引物
79.p4:5’ggatacagttggtgcagcatcagcccgttt3’80.配制50ulpcr反应体系如下(takara)：primestar max premix(2
×
)25μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、cdna 2μl、ddh2o补足到50ul。pcr反应条件如下：95℃
5min；95℃30s、58℃30s、72℃1min，循环35次；72℃10min。
81.用胶回收试剂盒回收vl、vh片段；
82.将回收后的片段分别与pmd19-t(simple)载体(takara)连接酶(takara)进行连接，连接体系如下：pcr产物1μl，t-vector pmd19(simple)1μl，补足ddh2o至3μl
83.向以上的dna溶液中加入等体积(5μl)dna ligation kit《mighty mix》(code no.6023)，充分混匀，16℃反应30分钟；
84.全量(10μl)加入至50μl e.coli感受态细胞中，轻柔混合，冰浴30分钟。42℃水浴45s后，迅速转入冰中放置1分钟。加入890μl 2-yt培养基，37℃振荡培养60min。取100μl转化液涂在含有amp的琼脂平板培养基上，37℃过夜培养。挑选白色菌落，pcr验证。
85.配制25μl菌液pcr反应体系如下：菌液1μl、上游引物(10μm)1μl、下游引物(10μm)1μl、dntp mixture 2μl、taq dna聚合酶(5u/μl)0.5μl、10
×
taq buffer(mg2 plus)2.5μl、补足ddh2o至10μl。反应条件如下：95℃5min；95℃30s、58℃30s、72℃1min，循环30次；72℃10min。
86.选取菌pcr阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(takara)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检8个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到符合典型抗体可变区序列特征的2c8的重链、轻链可变区序列。
87.实施例4：
88.facs法检测抗体2c8与商品anti-cd47抗体b6h12的竞争关系。
89.将商品抗体b6h12在用量为0.625ng/孔时，raji细胞呈现97％以上阳性率。将抗体2c8对倍稀释成最高每孔1280ng，最低每孔0.3125ng，体积为50ul，每孔与0.625ng b6h12商品抗体体积50ul混匀，与2x105/孔细胞，体积50ul室温避光孵育30min。500g，5min离心，弃上清，pbs洗两次，将细胞重悬于400μl pbs中，facs测定荧光强度。随着2c8用量的增加，与商品抗体竞争的程度也随之增加，在2c8用量低于10ng时，与b6h12基本无竞争(见图2)。
90.实施例5：与高表达cd47的jurkat细胞特异性结合
91.以人细胞株jurkat为研究对象，通过转染cd47-shrna建立稳定干扰cd47表达的jurkat细胞株：cd47shrna-gfp-jurkat。
92.facs检测抗体2c8与jurkat和cd47shrna-gfp-jurkat表面cd47蛋白的结合：将两种细胞等比例混合，用2c8室温孵育细胞混合物30min后用pbs洗两次，500g，5min离心，弃上清；100ul重悬细胞，加入apc标记抗小鼠igg二抗0.2μl，常温避光孵育30分钟后pbs洗两次，500g，5min离心，弃上清。细胞重悬于500μlpbs缓冲液中。以b6h12商品抗体(abcam：ab3283；apc直标)为阳性对照。facs检测结果可见2c8能有效特异性结合jurkat细胞(gfp阴性)，与cd47弱表达的cd47shrna-gfp-jurkat细胞(gfp阳性)结合明显较弱(见图3)。
93.实施例6：2c8的能体外诱导人和小鼠巨噬细胞吞噬肿瘤细胞
94.人巨噬细胞制备：无菌抗凝管获取健康志愿者外周血，加入等体积pbs混匀，用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离外周血单核细胞(pbmc)，取白细胞层用pbs洗涤2次，加入含l0％fbs的1640培养基，37℃，5％co2培养箱中培养3h后，轻轻吸去上清，以去除未贴壁细胞，换成加10ng/ml m-csf(peprotech)dmem完全培养；三天后换液，接下来每两天换液，培养至第7～10天进行吞噬实验。
95.小鼠巨噬细胞制备：实验前3天向balb/c小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml，颈椎脱臼
处死小鼠，将小鼠浸泡于酒精中5min，然后将小鼠移至超净工作台中；用dmem培养基8ml灌洗小鼠腹腔，回吸注射器，吸取腹腔液。将吸取的腹腔液离心500g，10min，弃上清。生理盐水洗涤1次；将收获的细胞2
×
106个/ml密度接种于孔板中培养箱培养3h后，轻轻吸去上清，以去除未贴壁细胞，换成dmem完全培养；三天后换液，接下来每两天换液，培养至第7～10天进行吞噬实验。
96.吞噬实验：实验前4h将巨噬细胞的培养基换成无血清培养基，用于饥饿巨噬细胞。期间，制备肿瘤细胞单细胞悬液，用预冷pbs洗涤细胞2遍，洗去血清。将显示绿色荧光的cfse避光操作标记于肿瘤细胞上，暗室孵育20min，加入10ml dmem完全培养基，37℃5min。离心弃上清，500g，10min，完全培养基重悬后，调整细胞密度至2
×
105个/ml接种于上述实验用的巨噬细胞中。加入10ug/ml 2c8抗体，肿瘤细胞和预饥饿的巨噬细胞于孵箱中孵育2h。吞噬结束后弃去上清液，pbs清洗3次，于高内涵显微镜(perkinelmer)下拍摄，并应用高内涵算法功能分析吞噬率，每孔至少分析3000个细胞。
97.人和小鼠巨噬细胞吞噬cd47敲降细胞系，对于cd47表达较低的cd47shrna-gfp-jurkat细胞系，巨噬细胞的吞噬作用也相应降低(见图4)。
98.2c8抗体能够促进人和小鼠巨噬细胞吞噬不同肿瘤细胞(见图5、图6)。
99.人和小鼠巨噬细胞与淋巴瘤细胞daudi细胞共培养的体外实验表明，随着所用抗体浓度的改变，其吞噬指数呈明显的剂量依赖关系(见图7、图8)。
100.实施例7：2c8抗体对于红细胞凝集的影响
101.收集抗凝剂处理的人血液样本。将rbc与pbs混合成10％(v/v)细胞悬液。将2c8抗体对倍稀释(400ug/ml～0.76ng/ml)，与rbc在96圆底孔板中37℃孵育4h。血细胞凝聚会出现红细胞不沉淀的现象，未凝聚则能形成清晰的红点。而cd47抗体5f9在等于或高于0.1ug/ml用量下即引起红细胞凝集反应(请参考专利号201780003451.2)
102.从凝聚实验结果看，2c8在浓度为400ug/ml时仍不会出现血细胞凝聚。(见图9)
103.实施例8：2c8抗体对人burkitt's淋巴瘤异种移植肿瘤的nod/scid鼠治疗。
104.nod/scid鼠在spf级实验室进行饲养，饲养约1周后，称量小鼠体重，待小鼠体重达到16g左右，皮下注射raji细胞细胞悬液，每只注射1x107/100μl，每隔两天观察肿瘤的生长情况，生长一周左右，肿瘤的大小为米粒大小后，人burkitt's淋巴瘤模型建立完成。计算肿瘤体积并按照肿瘤体积和裸鼠体重进行科学分组，将移植瘤小鼠随机分为4组实验组和1组对照组，每组至少6只小鼠。实验a组小鼠每3～4天尾静脉注射1200ug 2c8抗体，实验b组小鼠每3～4天尾静脉注射800ug 2c8抗体，实验c组小鼠每3～4天尾静脉注射400ug 2c8抗体，实验d组小鼠每3～4天尾静脉注射200ug 2c8抗体，对照组同时注射等体积pbs。治疗4次，并在每两天对小鼠的肿瘤体积进行测量，并统计生存率。肿瘤抑制率高达95％，较高剂量(400ug)抑制约100％，并且显著延长小鼠生存期。(见图10、图11)
105.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。