包含选择标记物的新型细胞系及其用于蛋白质生产的用途的制作方法

1.本发明涉及用于蛋白质生产的细胞系和选择标记物。


背景技术：

2.以工业规模生产重组蛋白需要分离可产生大量重组蛋白的克隆。将异种基因引入动物宿主细胞中并针对所添加的基因的表达进行筛选是漫长而复杂的过程。所述过程包括转染和选择具有长期稳定表达的克隆，以及筛选具有相应重组蛋白的高表达率的克隆。
3.当产生从表达载体表达重组蛋白的克隆时，通常用在同一载体上编码目的蛋白质和选择标记物的dna载体转染宿主细胞。这种表达载体因此包含可选择标记物，其允许选择其中存在所述表达载体的克隆。这种可选择标记物也可以导致转染dna的共扩增，从而允许分离高产克隆。
4.大多数可选择标记物是赋予抗生素或其他有毒物质抗性的蛋白质或者是细胞存活所必需的蛋白质。若干种此类可选择标记物是本领域已知的，包括例如g418、潮霉素、嘌呤霉素、博来霉素(zeomycin)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、谷氨酰胺合成酶(gs)和次黄嘌呤
‑
鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)。特别地，gs在真核细胞中工业重组蛋白生产的领域被广泛用作可选择标记物。gs基因允许合成细胞生长所必需的谷氨酰胺，并被msx(l
‑
甲硫氨酸亚砜亚胺)抑制。在存在msx的情况下，只有表达较高量的gs的细胞才能存活。经过适当筛选后，可以选择产生外源性蛋白的细胞。
5.在先前的申请wo 2016/062837中，发明人开发了一种基于使用二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)作为可选择标记物的表达系统。dhodh是嘧啶合成所需的酶。因此，抑制dhodh的化合物抑制dna合成，从而抑制细胞增殖。该选择标记物因此构成编码dhodh的表达载体，其与dhodh抑制剂(如来氟米特和特立氟胺)组合使用。
6.然而，与上述选择标记物一起使用的大多数抑制剂是有毒的。在dhodh选择标记物的情况下，特立氟胺是例如有效的免疫抑制剂，并且出于安全原因，它的处理尤其是大规模处理可能具有挑战性。在gs选择标记物的情况下，msx在高剂量时是惊厥剂，因此也可能引起处理问题。在dhfr选择标记物的情况下，已知甲氨蝶呤展示出造血和消化毒性，因此也引起处理问题。
7.因此，需要这样的表达系统，其中可以在不添加难以处理的化合物的情况下进行产生目的蛋白质的克隆的选择。
8.本发明满足了这种需要。


技术实现要素：

9.本发明由发明人对细胞系的设计产生，在所述细胞系中由于所述细胞系中dhodh基因的部分或完全失活，因此可以在不含尿苷的培养基中选择产生目的蛋白质的细胞。通常使其中所述dhodh基因部分或完全失活的这种细胞系在补充有尿苷的培养基中生长，但是当用包含编码哺乳动物dhodh、特别是编码突变的哺乳动物dhodh的核苷酸序列和用于表
达目的蛋白质的表达盒的表达载体转染时，通常将所述培养基改为不含尿苷的培养基，从而选择所述产生目的蛋白质的细胞。
10.这种表达系统是特别有利的，因为通过避免使用抑制剂作为选择压力，这增加了生产细胞的活力。发明人还证明了毒性的这种降低与高生产力相关。
11.因此，本发明涉及一种包含部分或完全失活的内源性二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)基因的细胞系。
12.在特定实施方案中，所述细胞系是中国仓鼠卵巢(cho)细胞系。
13.在更特定的实施方案中，所述细胞系通过以下方式产生：
14.a)使细胞中的内源性dhodh基因失活，特别是通过基因编辑方法，如通过crispr
‑
cas9方法，以及
15.b)在适合于产生其中所述内源性dhodh基因部分或完全失活的细胞系的条件下，在包含尿苷的培养基中培养所述细胞。
16.在特定实施方案中，所述细胞系的内源性dhodh基因的所有等位基因部分或完全失活。
17.在其他实施方案中，所述细胞系还包含含有编码外源性哺乳动物dhodh的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒的表达载体，其中所述外源性dhodh包含与序列seq id no:2或序列seq id no:4至少60％相同的序列。
18.在其特定实施方案中，所述核苷酸序列包含seq id no:1的序列或seq id no:3的序列。
19.在其另一个特定实施方案中，所述重组蛋白是单克隆抗体。
20.在其又一个特定实施方案中，所述载体包含适合于克隆抗体轻链的第一表达盒和适合于克隆抗体重链的第二表达盒。
21.本发明的另一个目的是一种表达系统，所述表达系统包含：
22.(i)如上定义的包含部分或完全失活的内源性二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)基因的细胞系以及
23.(ii)包含编码外源性哺乳动物dhodh的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒的表达载体，其中所述外源性dhodh包含与序列seq id no:2或序列seq id no:4至少60％相同的序列。
24.在特定实施方案中，所述核苷酸序列包含seq id no:1的序列或seq id no:3的序列。
25.在另一个特定实施方案中，所述重组蛋白是单克隆抗体。
26.在仍特定实施方案中，所述载体包含适合于克隆抗体轻链的第一表达盒和适合于克隆抗体重链的第二表达盒。
27.本发明还涉及(i)如上定义的细胞系或如上定义的表达系统以及(ii)不含尿苷的培养基。
28.本发明的另一个目的涉及一种产生重组蛋白的体外方法，所述体外方法包括以下步骤：
29.a)a1)提供如上定义的细胞系，其还包含含有编码外源性哺乳动物dhodh的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒的表达载体，其中所述外源性dhodh包含与序
列seq id no:2或序列seq id no:4至少60％相同的序列；
30.或
31.a2)提供如上定义的细胞系以及
32.a2’)将如上定义的表达载体引入步骤a2)中提供的细胞系中；
33.或
34.a3)提供包含内源性dhodh基因的细胞系，
35.a3’)使步骤a3)中提供的细胞系中的内源性dhodh基因部分或完全失活以及
36.a3”)将如上定义的表达载体引入包含步骤a3')中获得的包含部分或完全失活的内源性dhodh基因的细胞系中；
37.b)在适合于产生所述重组蛋白的条件下培养所述细胞系；以及
38.c)分离和/或纯化所述重组蛋白。
39.在特定实施方案中，所述方法的步骤b)在不含尿苷的培养基中进行。
40.在另一个特定实施方案中，所述方法还包括将所述重组蛋白配制成药物组合物的步骤d)。
41.本发明还涉及如上定义的细胞系、如上定义的表达系统或如上定义的试剂盒用于产生重组蛋白的用途。
42.在特定实施方案中，所述细胞系、所述表达系统或所述试剂盒与不含尿苷的培养基组合使用。
附图说明
43.图1显示了2018年12月21日在genbank ncbi上可获得的以gene id：100756632引用的人dhodh基因的基因组结构。
44.图2显示了序列n
°
1dhodh外显子2的比对。pam：前间区序列邻近基序序列(tgg)。
45.图3显示了在存在不同浓度的特立氟胺作为选择剂的情况下筛选用于产生抗体的不同ko(敲除)dhodh克隆。
46.图4显示了使用不同的dhodh变体作为选择标记物产生的以mg/ml为单位的蛋白质数量。
47.图5显示了使用人dhodh g202a或人gs选择标记物和dhodh ko或野生型cho细胞得到的第14天脂肪酶产量。
48.图6显示了使用人dhodh g202a或人gs选择标记物和dhodh ko或野生型cho细胞得到的第14天单克隆抗体mab
‑
b产量。
49.图7显示了使用人dhodh g202a和/或人gs选择标记物和dhodh ko或野生型cho细胞得到的第14天双特异性抗体产量。
50.图8显示了使用人dhodh g202a和人gs选择标记物和dhodh ko或野生型cho细胞得到的第14天三特异性抗体产量。
具体实施方式
51.二氢乳清酸脱氢酶
52.如本文所用，术语“二氢乳清酸脱氢酶”或“dhodh”是指能够催化二氢乳清酸盐(4,
5
‑
二氢乳清酸或2,6
‑
二氧代
‑
1,3
‑
二嗪农
‑4‑
甲酸)转化为乳清酸盐(乳清酸或1,2,3,6
‑
四氢
‑
2,6
‑
二氧代
‑4‑
嘧啶甲酸)的多肽，如以下反应所示：
[0053][0054]
这种多肽被分类为酶学委员会(ec)编号1.3.3.1。能够催化上述反应的多肽展现出“dhodh活性”。
[0055]
上述反应是合成dna和rna所需的单磷酸尿苷(rump)的从头合成的第四步。因此，dhodh的抑制或失活具有抑制dna和rna合成的作用，从而抑制细胞增殖。
[0056]
细胞系
[0057]
本发明涉及一种包含部分或完全失活的内源性二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)基因的细胞系。
[0058]
所述细胞系是真核细胞系，例如哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢(cho)细胞系、猴细胞系或人细胞系。
[0059]
在特定实施方案中，所述细胞系是cho细胞系。
[0060]
cho细胞系通常用于工业蛋白质生产，并且许多cho细胞系是本领域技术人员已知的。例如，此类cho细胞系包括公众可从美国典型培养物保藏中心获得的品系，如cho
‑
k1细胞系(atcc编号：ccl
‑
61)、cho
‑
s细胞系(例如由invitrogen和gibco销售)、cho dp
‑
12细胞系(atcc编号crl
‑
12444和12445)和cho 1
‑
15细胞系(atcc编号crl
‑
9606)。另一种适合于工业蛋白质生产的细胞系是cho 9e4细胞系。所述9e4细胞系是通过单细胞克隆过程从cho
‑
k1细胞系的克隆建立的。实施例1中更深入地呈现了9e4细胞系的建立。所述cho
‑
k1细胞系由puck于1957年获得，并以编号ccl
‑
61保藏在atcc。
[0061]
人细胞(如hek293(atcc编号crl
‑
1573)、hkb11(atcc编号crl
‑
12568)、per
‑
c6(crucell)、ht1080(atcc编号crl
‑
121)、jurkat、daudi、raji和cap(atcc编号crl
‑
1098)细胞)也可以用于蛋白质生产，以获得重组人蛋白的天然糖基化模式。
[0062]
在一个实施方案中，所述细胞系能够在无血清培养基(例如化学成分确定的培养基)和/或悬浮液中生长。本领域技术人员可以通过使亲本细胞系在无血清培养基和/或悬浮液中适应(例如通过单细胞克隆、通过逐渐适应和/或通过“饥饿和保存”过程)来获得这种细胞系。
[0063]
本发明的细胞系是一种包含部分或完全失活的内源性二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)基因的细胞系。
[0064]“内源性dhodh基因”在本文中意指在特定环境条件下在特定发育阶段正常存在于所述特定细胞中的dhodh基因。
[0065]“内源性dhodh基因”与下文定义的“外源性dhodh”的区别在于所述外源性dhodh由下文定义的表达载体提供，如果所述表达载体已被引入本发明的细胞系中，则所述表达载体可存在于本发明的细胞系中。
[0066]
正如技术人员所理解的，所述内源性dhodh基因将取决于所述细胞系。例如，在cho细胞系中，所述内源性dhodh基因是中国仓鼠dhodh基因；在人细胞系中，所述内源性dhodh基因是人dhodh基因。
[0067]
通常，野生型中国仓鼠dhodh是指包含seq id no:2或由其组成的序列以及展现出dhodh活性的所述序列的变体。此类变体可以例如对应于仓鼠物种中天然存在的变体(如等
位基因变体或剪接变体)。
[0068]
通常，野生型人dhodh是指包含seq id no:4或由其组成的序列以及展现出dhodh活性的所述序列的变体。此类变体可以例如对应于人物种中天然存在的变体(如等位基因变体或剪接变体)。
[0069]
如本文所用，“基因”包括编码基因产物的dna区域以及调节基因产物产生的所有dna区域，无论此类调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。
[0070]
基因“失活”是指与相应的野生型细胞相比基因表达的任何降低。基因失活可以是完全的(完全失活或敲除)或部分的(例如，其中基因展现出低于正常表达水平的亚等位基因，或显示出其影响的活性的部分降低的突变基因产物)。
[0071]
在特定实施方案中，所述内源性dhodh基因的所有等位基因部分或完全失活。
[0072]
在特定实施方案中，所述内源性dhodh基因完全失活。
[0073]
在更特定的实施方案中，所述内源性dhodh基因的所有等位基因完全失活。
[0074]
在特定实施方案中，使用如aga等人(2015)bmc proceedings 9(增刊9):p2中所述的crispr
‑
cas9方法使所述内源性dhodh基因失活。
[0075]
如技术人员所熟知，crispr
‑
cas9系统是原核适应性免疫应答系统，其使用非编码rna来引导cas9核酸酶诱导位点特异性dna切割。这种dna损伤通过细胞dna修复机制经由非同源末端连接dna修复途径(nhej)或同源定向修复(hdr)途径修复。为了产生基因破坏，由对dna靶标具有特异性的crrna序列和与cas9蛋白相互作用的tracrrna序列组成的单一引导rna(grna)与具有dna核酸内切酶活性的重组形式的cas9蛋白结合。所得复合物将导致靶标特异性双链dna切割。切割位点将通过非同源末端连接(nhej)dna修复途径修复，这是一个容易出错的过程，其可以导致插入/缺失(indel)从而可以破坏基因功能。
[0076]
在特定实施方案中，dhodh基因的至少一个外显子被靶向失活，特别是通过基因编辑方法(如cripr
‑
cas9方法)靶向失活。在更特定的实施方案中，dhodh基因中编码dhodh蛋白的n末端部分的一部分被靶向失活，特别是通过基因编辑方法(如crispr
‑
cas9方法)靶向失活。在又一个实施方案中，dhodh基因的第二外显子被靶向失活，特别是通过基因编辑方法(如crispr
‑
cas9方法)靶向失活。
[0077]
在一个实施方案中，序列caaggatgatggctgcatcc(seq id no:23)或序列ggatgcagccatcatccttg(seq id no:5)的20核苷酸序列或与在不损害cho存活的情况下敲除dhodh基因相容的任何序列用作用于产生grna的相应dna片段，所述grna靶向dhodh基因的第二外显子。该grna通常使用序列caccgcaccgggatgcagccatcatccttg(seq id no:6)和aaaaccaaggatgatggctgcatcc(seq id no:7)的寡核苷酸或使用序列ggatgcagccatcatccttggtttt(seq id no:24)和caaggatgatggctgcatcccggtg(seq id no:25)的寡核苷酸获得，所述寡核苷酸通常克隆在质粒的独特限制性位点，如pcm3561质粒(由invitrogen商业化)的baei位点，使得克隆的dna序列处于u6启动子的控制之下，并且在将所述质粒引入细胞中后被转录成含有与tracrrna融合的crrna的单个转录单元，所述crrna部分对于dhodh基因的第二外显子具有特异性并且所述tracrrna部分被cas9酶识别。
[0078]
为了鉴定对于dhodh基因失活的细胞系，通常通过在孔板中有限稀释来分离单个
细胞，并且在达到适当的汇合度(例如90％汇合度)后，将细胞分装到至少2种条件中，如一种在补充有尿苷的培养基中并且另一种在不含尿苷的培养基中。目的克隆通常是对缺乏尿苷敏感的克隆。
[0079]
分离后，这些目的细胞可以在包含嘧啶碱基的培养基、特别是包含尿苷的培养基中培养。
[0080]“嘧啶碱基”在本文中意指嘧啶本身和具有嘧啶核作为骨架的各种嘧啶衍生物。此类嘧啶碱基的例子包括尿嘧啶核酸相关物质，如尿嘧啶、尿苷、磷酸尿苷(特别是单磷酸尿苷(ump)、二磷酸尿苷(udp)和三磷酸尿苷(utp))、脱氧尿苷、磷酸脱氧尿苷(特别是单磷酸脱氧尿苷(dump)、二磷酸脱氧尿苷(dudp)和三磷酸脱氧尿苷(dutp))；胞嘧啶核酸相关物质，如胞嘧啶、胞苷、磷酸胞苷(特别是单磷酸胞苷(cmp)、二磷酸胞苷(cdp)、三磷酸胞苷(ctp))、脱氧胞苷、2'
‑
脱氧胞苷、磷酸脱氧胞苷(特别是单磷酸脱氧胞苷(dcmp)、二磷酸脱氧胞苷(dcdp)和三磷酸脱氧胞苷(dctp))；胸腺嘧啶、胸苷、磷酸胸苷(特别是单磷酸胸苷(tmp)、二磷酸胸苷(tdp)和三磷酸胸苷(ttp))、脱氧胸苷、磷酸脱氧胸苷(特别是单磷酸脱氧胸苷(dtmp)、二磷酸脱氧胸苷(dtdp)和三磷酸脱氧胸苷(dttp))。
[0081]
在特定实施方案中，所述嘧啶碱基是尿苷。
[0082]“尿苷”在本文中意指下式的核苷
[0083][0084]“不含尿苷的培养基”意指适合于特定细胞系生长的任何基础培养基，其中所述培养基包含小于1mm的尿苷，特别地所述培养基不包含任何尿苷。
[0085]“包含尿苷的培养基”意指适合于特定细胞系生长的任何基础培养基，其中所述培养基还包含1mm至25mm尿苷，特别是5mm至10mm尿苷。
[0086]“基础培养基”在本文中意指适合于暴露于细胞，例如暴露于cho细胞的未补充培养基。本领域技术人员将理解，要使用的基础培养基将取决于所使用的细胞类型。基础培养基的例子包括cdcho培养基、opticho
tm
培养基、fecto cho
tm
培养基、forticho
tm
培养基、expicho
tm
培养基、ex
‑
cell
tm
培养基、actipro
tm
培养基、mam pf77
tm
培养基和powercho
tm
培养基。
[0087]
在特定实施方案中，所述基础培养基还补充有谷氨酰胺，通常补充有4mm至6mm谷氨酰胺。
[0088]
因此，在特定实施方案中，本发明的细胞系通过以下方式产生：
[0089]
a)使细胞中的内源性dhodh基因失活，特别是通过基因编辑方法，如crispr
‑
cas9方法，以及
[0090]
b)在适合于产生其中所述内源性dhodh基因部分或完全失活的细胞系的条件下，在包含尿苷的培养基中培养所述细胞。
[0091]
包含通过crispr
‑
cas9方法完全或部分失活的内源性dhodh基因的cho细胞系的产生在实施例2和3中得到更深入的例证。
[0092]
包含完全或部分失活的内源性dhodh基因的细胞系(如cho细胞系)的产生可以通过本领域已知的多种其他分子生物学技术产生。例如，可用于产生具有完全或部分失活的内源性dhodh基因的细胞系的其他基因编辑技术包括使用锌指核酸酶(zfn)或转录因子样效应物核酸酶(talen)。cre/lox方法也可以用于敲除dhodh基因的一个或多个或所有等位基因。
[0093]
在特定实施方案中，本发明的细胞系还包含如下文“表达载体”章节中所定义的表达载体。
[0094]
所述表达载体可以通过技术人员熟知的任何合适的技术(如通过转染、特别是通过电穿孔或化学转染或转导)引入细胞系中。
[0095]
在特定实施方案中，本发明的所述细胞系还可以包含不同于本发明的表达载体的含有选择标记物的另外的表达载体，通常是含有编码谷氨酰胺合成酶的序列的另外的表达载体。
[0096]
外源性dhodh
[0097]
由本发明中使用的表达载体编码的dhodh(还称为“外源性dhodh”)可以包含与seq id no:2或seq id no:4至少60％、62％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同的序列或由其组成的序列。其还可以包含seq id no:2或seq id no:4的至少100、150、200、250、300或350个连续氨基酸的片段或由其组成，前提是所述蛋白质保留dhodh活性。
[0098]
在一些实施方案中，根据本发明的外源性dhodh包含与seq id no:2的序列和seq id no:4的序列二者至少60％、62％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同的序列或由其组成。
[0099]
在一些实施方案中，根据本发明的外源性dhodh是人dhodh，即人起源的dhodh。
[0100]
如本文所用，术语“人dhodh”是指具有包含seq id no:4或由其组成的序列的蛋白质以及展现出dhodh活性的所述蛋白质的变体。此类变体可以例如对应于人物种中天然存在的变体(如等位基因变体或剪接变体)。可替代地，此类变体可以对应于通过基因工程化获得的变体。在一个实施方案中，此类变体与seq id no:4的序列的不同之处仅在于与seq id no:4相比，存在至多150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异(所述变异包括取代、插入和缺失)。
[0101]
在特定实施方案中，所述人dhodh是与野生型序列相比包含g202a突变的变体，通常是包含氨基酸序列seq id no:26或由其组成的蛋白质。
[0102]
在一些实施方案中，所述外源性dhodh是仓鼠dhodh，即仓鼠起源的dhodh。所述仓鼠dhodh可以是例如中国仓鼠(灰仓鼠(cetulus griseus))dhodh。
[0103]
如本文所用，术语“中国仓鼠dhodh”是指包含seq id no:2或由其组成的序列以及展现出dhodh活性的所述序列的变体。此类变体可以例如对应于仓鼠物种中天然存在的变体(如等位基因变体或剪接变体)。可替代地，此类变体可以对应于通过基因工程化获得的变体。在一个实施方案中，此类变体与seq id no:2的序列的不同之处仅在于与seq id no:2相比，存在至多150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、
19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异(所述变异包括取代、插入和缺失)。
[0104]
在另一个实施方案中，所述变体dhodh将具有dhodh活性，任选地具有与野生型蛋白质相同的活性水平，或野生型蛋白质的50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或更高的活性水平。
[0105]
具有与本发明的查询氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽意指主题多肽的氨基酸序列与查询序列相同，但主题多肽序列可以包含查询氨基酸序列的每100个氨基酸中最多五个氨基酸改变。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，可以主题序列中最多5％(100个中的5个)氨基酸残基可以是插入、缺失的或用另一个氨基酸取代。
[0106]
可以在变体序列的全长、参考序列的全长或二者上鉴定序列同一性。例如，可以使用全局比对计算同一性百分比(即在整个长度上比较这两个序列)。用于比较两个或更多个序列的同一性和同源性的方法是本领域熟知的。可以例如在执行全局比对时使用“needle”程序，其使用needleman
‑
wunsch全局比对算法(needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443
‑
453)在考虑两个序列的整个长度的情况下找到它们的最佳比对(包括空位)。该needle程序例如可在万维网站上在ebi.ac.uk上获得。根据本发明的同一性百分比优选地使用emboss::need|e(全局)程序计算，其中采用“gap open”参数等于10.0、“gap extend”参数等于0.5以及blosum62矩阵。
[0107]
与参考序列相比，参考序列的变体可以包含突变如缺失、插入和/或取代。在取代的情况下，所述取代优选地对应于如下表中所示的保守取代。
[0108]
保守取代氨基酸类型ala、val、leu、ile、met、pro、phe、trp具有脂肪族疏水性侧链的氨基酸ser、tyr、asn、gln、cys具有不带电荷但极性侧链的氨基酸asp、glu具有酸性侧链的氨基酸lys、arg、his具有碱性侧链的氨基酸gly中性侧链
[0109]
表达载体
[0110]
本发明的上下文中使用的表达载体适合于产生重组蛋白，并且包含编码二氢乳清酸脱氢酶(dhodh)的序列。
[0111]
所述表达载体优选地是dna载体。
[0112]
本发明的上下文中使用的表达载体包含编码如上文“外源性dhodh”章节中所定义的外源性dhodh的序列。
[0113]
在具体实施方案中，所述表达载体将被引入其中的细胞系是cho细胞系，并且外源性dhodh是异种起源的(即外源性dhodh不是仓鼠dhodh)。
[0114]
编码这种外源性dhodh的序列可以是天然存在的核苷酸序列。可替代地，编码这种dhodh的序列的三联密码子对于在cho细胞中表达可以是偏倚的。用于偏倚序列以获得最佳表达的软件和算法是本领域已知的并且包括例如raab等人(2010)syst synth biol.4:215
‑
225中描述的算法。该算法不仅提供了对于表达的最佳可用密码子，而且还考虑了gc含量和不需要的dna基序的不存在。
[0115]
例如，编码外源性dhodh的序列可以包含与seq id no:3的序列(即编码seq id no:4的人dhodh的序列，其已被设计用于在cho细胞中最佳表达)和/或seq id no:1的序列(即编码seq id no:2的仓鼠dhodh的序列，其已被设计用于在cho细胞中最佳表达)至少60％、62％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列或由其组成。
[0116]
在一个实施方案中，编码外源性dhodh的序列包含seq id no:1或seq id no:3的序列或由其组成。
[0117]
在本发明的上下文中使用的表达载体中，编码上文定义的外源性dhodh的序列可以被置于本领域技术人员已知的任何启动子的控制之下。
[0118]
例如，编码上文定义的外源性dhodh的序列可以例如被置于适合于驱动dhodh表达的启动子的控制之下，所述启动子例如猿猴空泡形成病毒40(sv40)启动子(例如sv40的晚期或早期启动子)、cmv启动子、延伸因子1启动子、gapdh启动子、rpl37启动子、肌动蛋白启动子。例如，在benoist和chambon(1981)nature 290:304
‑
310以及moreau等人(1981)nucleic acids res.9:6047
‑
6068中描述了早期sv40启动子。特别地，所述sv40启动子是全长启动子。所述sv40启动子还可以具有含有72bp重复序列的复制起点。
[0119]
在一些实施方案中，所述sv40启动子不是其中位置128至270已被去除的sv40启动子，即所述sv40启动子不是韩国专利号10
‑
0267720中描述的sv40启动子，而是转化1997年12月17日以保藏号kctc 8860p保藏于kist生物工程研究所的基因库(gene bank,institute of bioengineering)。
[0120]
在其他实施方案中，编码上文定义的外源性dhodh的序列未被置于sv40启动子的控制之下。
[0121]
适合于产生重组蛋白的表达载体是本领域技术人员已知的。此类载体通常对应于包含复制起点和至少一个表达盒的表达载体，所述表达盒允许克隆和表达需要产生的重组蛋白。表达盒通常包含5'非翻译区(包含启动子和任选的增强子序列或由其组成)、一个或多个允许克隆编码所述重组蛋白的序列的限制性位点、3'非翻译区(例如聚a信号)以及任选的一个或多个内含子。所述启动子序列可以对应于本领域熟知的任何强启动子，例如像人cmv启动子。任选地，本发明的上下文中使用的表达载体包含原核复制起点(例如原核复制子，如大肠杆菌中的cole1)和至少一个原核生物选择性标记基因(也称为原核可选择标记物)，使得载体允许在原核细胞中复制。复制所述载体的细胞也表达原核生物选择性标记基因，因此可以被鉴定和选择。原核生物选择性标记基因是本领域技术人员熟知的。原核生物选择性标记基因的例子是例如编码赋予抗生素抗性的蛋白质的核酸序列(例如，编码赋予氨苄青霉素、氯霉素、杀稻瘟素或卡那霉素抗性的蛋白质的序列)。
[0122]
所述重组蛋白可以对应于对于本领域技术人员感兴趣的任何蛋白质。
[0123]
如本文所用，术语“蛋白质”意在包括肽(即少于50个氨基酸的氨基酸链)、多肽(即至少50个氨基酸的氨基酸链)、单体蛋白质(即由一个氨基酸链组成的蛋白质)和多聚体蛋白质(即由两个或更多个氨基酸链组成的蛋白质，例如像单克隆抗体)。
[0124]
本发明的上下文中使用的表达载体通常包含一定数量的表达盒，所述数量与构成所述蛋白质的不同氨基酸链的数量相同(例如，在单体蛋白质或同二聚体蛋白质的情况下为一个表达盒，在异二聚体蛋白质或单克隆抗体的情况为两个表达盒，等等)。
[0125]
可替代地，本发明的上下文中使用的表达载体可以仅包含一个表达盒，即使当需要产生异二聚体蛋白质或单克隆抗体时。在这种情况下，编码所述蛋白质的其他一个或多个氨基酸链的一个或多个序列存在于单独的表达载体上，所述单独的表达载体与根据本发明的表达载体共转染至宿主细胞系、特别是cho细胞系中。
[0126]
在这种情况下，补充的单独表达载体可以包含不同于本文所述的dhodh选择标记物的选择标记物，如dhfr、gs或hprt。
[0127]
在一个实施方案中，本发明的上下文中使用的表达载体可以不含表达盒。在这种情况下，适合于表达重组蛋白的表达盒存在于单独的载体上，所述单独的载体与根据本发明的表达载体共转染至宿主细胞系、特别是本发明的dhodh失活的细胞系、更特别地是本发明的dhodh失活的cho细胞系中。
[0128]
因此，在一些实施方案中，本发明的上下文中使用的表达载体包含：
[0129]
‑
被置于早期sv40启动子的控制之下的编码如上定义的外源性dhodh的序列；
[0130]
‑
第一表达盒，其中编码所述抗体的轻链的序列被置于cmv启动子的控制之下；
[0131]
‑
第二表达盒，其中编码所述抗体的重链的序列被置于cmv启动子的控制之下；
[0132]
‑
原核复制起点；以及
[0133]
‑
被置于其天然启动子的控制之下的用于原核细胞中的可选择标记物，即编码赋予氨苄青霉素抗性的蛋白质的序列。
[0134]
贯穿本说明书，术语“重组蛋白”是指任何需要产生的重组蛋白。其可以例如对应于治疗性和/或预防性蛋白质，即旨在用作药物(包括疫苗)的蛋白质。在具体实施方案中，所述需要产生的重组蛋白不是dhodh。在另一个具体实施方案中，所述需要产生的重组蛋白是抗体，例如单克隆抗体。在又一个具体实施方案中，所述需要产生的重组蛋白是抗原性蛋白。
[0135]
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且具体涵盖任何同种型(如lgg、lgm、lga、lgd和lge)的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性和三特异性抗体)、抗体片段(例如像fv、scfv、ds、fab、fab'或f(ab')2片段)、单结构域抗体及其片段以及包含抗体片段的融合蛋白。与特异性抗原反应的抗体可以通过重组方法(如选择噬菌体或类似载体中的重组抗体的文库)或者通过用抗原或抗原编码核酸免疫动物产生。
[0136]
如本文所用，“单克隆抗体”是从基本上均质的抗体的群体获得的抗体，所述基本上均质的抗体的群体即形成该群体的抗体基本上相同，但可能以少量存在可能天然存在的突变。这些抗体针对单个表位(或在多特异性单克隆抗体的情况下是一组表位)，因此具有高度特异性。
[0137]
典型的单克隆抗体由通过二硫键连接的两个相同的重链和两个相同的轻链构成。每个重链和轻链都含有恒定区和可变区。每个可变区含有称为“互补决定区”(“cdr”)或“高变区”的三个片段，其主要负责结合抗原的表位。它们通常被称为cdr1、cdr2和cdr3，从n末端依次编号(参见kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版,national institute of health,bethesda,md,1991)。可变区的更加高度保守的部分被称为“框架区”。
[0138]
所述单克隆抗体可以是例如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
[0139]
所述单克隆抗体可以是单特异性、双特异性或三特异性抗体。
[0140]
当所述需要产生的重组蛋白是单克隆抗体时，根据本发明的表达载体可以包含适合于克隆所述抗体轻链的第一表达盒和适合于克隆所述抗体重链的第二表达盒。
[0141]
在具体实施方案中，所述第一和第二表达盒各自包含巨细胞病毒(cmv)启动子，例如来自人或鼠cmv的cmv启动子。更具体地，所述第一和第二表达式盒可以包含：
[0142]
‑
cmv立即早期增强子启动子(例如具有teschendorf等人(2002)anticancer res.22:3325
‑
3330中描述的序列的一种)；或
[0143]
‑
来自小鼠cmv的ie2启动子/增强子(例如具有chatellard等人(2007)biotechnol bioeng.96:106
‑
117中描述的序列的一种)；或
[0144]
‑
hcmv
‑
mie调节元件(例如具有wo 89/01036中描述的序列的一种)。
[0145]
术语“抗原性蛋白质”在本文中以最广泛的含义使用，并且覆盖单独的或与佐剂组合的任何能够产生免疫应答的蛋白质。其可以旨在用于预防性疫苗或治疗性疫苗中。在具体实施方案中，所述抗原性蛋白质是疫苗蛋白，即旨在用于预防性疫苗中的蛋白质。
[0146]
所述表达载体可以包含编码目的重组蛋白的至少一个序列(例如，编码单体蛋白质的一个序列、编码抗体链的一个序列或分别编码抗体轻链和抗体重链的两个序列)，或者其可以是空的(即不含编码目的重组蛋白的这种序列)。
[0147]
表达系统、试剂盒、方法和用途
[0148]
本发明提供了一种表达系统，所述表达系统包含：
[0149]
(i)如上文的“细胞系”章节中所定义的细胞系，其包含如上文的“细胞系”章节中所定义的部分或完全失活的内源性dhodh基因以及
[0150]
(ii)如上文的“表达载体”章节中所定义的表达载体。
[0151]
本发明的表达系统还可以包含补充的单独表达载体，所述充的单独表达载体各自包含编码不同于dhodh的选择标记物(如dhfr、gs或hprt)的核苷酸序列以及用于表达重组蛋白的至少一个表达盒。
[0152]
可替代地，本发明的表达系统还可以包含如上文的“表达载体”章节中所定义的补充的表达载体。
[0153]
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含(i)含有如上文的“表达载体”章节中所定义的表达载体的根据本发明的细胞系或根据本发明的表达系统，以及(ii)如上所定义的不含尿苷的培养基。
[0154]
所述试剂盒可以包含如上所述的编码外源性dhodh的表达载体(在所述表达系统中)。在这种试剂盒中，所述载体优选地是空的，因为这允许克隆对于本领域技术人员的目的蛋白质。另外，所述表达载体优选地与这种试剂盒中的细胞系分离。
[0155]
所述试剂盒还包含如上文的“细胞系”章节中所定义的不含尿苷的培养基。
[0156]
所述试剂盒还可以包含适合于培育所述细胞系的培养基、适合于将所述载体转染至所述细胞系中的培养基、包装材料和/或用于使用所述表达系统的说明书。
[0157]
在特定实施方案中，所述试剂盒不含dhodh抑制剂。
[0158]
dhodh抑制剂的例子包括二辛可宁酸、布喹那(6
‑
氟
‑2‑
(2'
‑
氟
‑
1,1'
‑
联苯
‑4‑
基)
‑3‑
甲基
‑4‑
喹啉甲酸)、萘醌衍生物(如二氯烯丙基散沫花素)、异噁唑衍生物(如来氟米特(5
‑
甲基
‑
n
‑
[4
‑
(三氟甲基)苯基]
‑
异噁唑
‑4‑
甲酰胺)及其活性代谢物特立氟胺((2z)
‑2‑
氰
基
‑3‑
羟基
‑
n
‑
[4
‑
(三氟甲基)苯基]丁
‑2‑
酰胺))、喹诺酮甲酸、萘醌、异噁唑、苯氧基喹啉、redoxal和衍生物、散沫花素、拉帕醇(iapachol)、阿托伐醌和(8
‑
氯
‑4‑
(2
‑
氯
‑4‑
氟
‑
苯氧基)喹啉)。dhodh的抑制剂可能能够使dhodh活性抑制至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
[0159]
在特定实施方案中，所述试剂盒不含特立氟胺。
[0160]
本发明还提供了包含如上文的“表达载体”章节中定义的表达载体的根据本发明的细胞系、根据本发明的表达系统或根据本发明的试剂盒用于体外产生重组蛋白的用途。
[0161]
在特定实施方案中，所述细胞系、表达系统或试剂盒与如上定义的不含尿苷、更特别地是在不存在dhodh抑制剂的情况下的培养基组合使用。
[0162]
本发明还提供了根据本发明的表达系统、包含如上文的“表达载体”章节中所定义的表达载体的根据本发明的细胞系或根据本发明的试剂盒用于特别是在不存在dhodh抑制剂的情况下分离在体外产生高水平的重组蛋白的克隆细胞(“高生产克隆”)的用途。
[0163]
在本发明的上下文中，术语“高水平的重组蛋白”旨在意指在培养基中重组蛋白的浓度为至少0.05g/l、优选至少0.1g/l、仍优选至少0.2g/l、更优选在0.3g/l与1g/l之间。重组蛋白的浓度可以通过本领域技术人员熟知的方法确定，特别包括酶联免疫吸附测定(elisa)、蛋白质印迹、caliper技术和对应于所述重组蛋白的纯化蛋白的浓度范围。
[0164]
本发明还提供了一种产生重组蛋白的体外方法，所述体外方法包括以下步骤：
[0165]
a)a1)提供包含如上文的“表达载体”章节中所定义的表达载体的根据本发明的细胞系；
[0166]
或
[0167]
a2)提供根据本发明的细胞系以及
[0168]
a2’)将如上文的“表达载体”章节中所定义的表达载体引入步骤a2)中提供的细胞系中；
[0169]
或
[0170]
a3)提供包含内源性dhodh基因的细胞系，
[0171]
a3’)使步骤a3)中提供的细胞系中的内源性dhodh基因部分或完全失活以及
[0172]
a3”)将如上文的“表达载体”中所定义的表达载体引入包含步骤a3')中获得的包含部分或完全失活的内源性dhodh基因的细胞系中；
[0173]
b)在适合于产生所述重组蛋白的条件下培养所述细胞系；以及
[0174]
c)分离和/或纯化所述重组蛋白。
[0175]
在特定实施方案中，上述方法的步骤b)在不含尿苷、更特别地也不含dhodh抑制剂的培养基中进行，并且特别包括以下子步骤：选择尽管不存在尿苷、特别是在不存在dhodh抑制剂的情况下但仍生长的转染的细胞。
[0176]
本发明还提供了一种分离产生高水平的重组蛋白的克隆细胞的体外方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
[0177]
a)a1)提供包含如上文的“表达载体”章节中所定义的表达载体的根据本发明的细胞系；
[0178]
或
[0179]
a2)提供根据本发明的细胞系以及
[0180]
a2’)将如上文的“表达载体”章节中所定义的表达载体引入步骤a2)中提供的细胞系中；
[0181]
或
[0182]
a3)提供包含内源性dhodh基因的细胞系，
[0183]
a3’)使步骤a3)中提供的细胞系中的内源性dhodh基因部分或完全失活以及
[0184]
a3”)将如上文的“表达载体”中所定义的表达载体引入包含步骤a3')中获得的包含部分或完全失活的内源性dhodh基因的细胞系中；
[0185]
b)在适合于产生所述重组蛋白的条件下培养所述细胞系；以及
[0186]
c)分离产生高水平的重组蛋白的克隆。
[0187]
在特定实施方案中，上述方法的步骤b)在不含尿苷、更特别地也不含dhodh抑制剂的培养基中进行，并且特别包括以下子步骤：选择尽管不存在尿苷、特别是在不存在dhodh抑制剂的情况下但仍生长的转染的细胞。
[0188]
在步骤a2')或a3")中，所述表达载体可以通过技术人员熟知的任何技术(如通过转染、特别是通过电穿孔或化学转染或转导)引入所述细胞系中。
[0189]
适合于产生重组蛋白的条件是本领域技术人员熟知的。例如可以使用实施例中描述的方案。
[0190]
在具体实施方案中，步骤b)中使用的培养基包含渐减浓度的尿苷。这允许选择其中已经扩增了载体来源的外源性dhodh基因(以及因此编码所述重组蛋白的序列)的克隆。
[0191]
上述方法还可以包括将所述重组蛋白配制成药物组合物的步骤。
[0192]
贯穿整个说明书，术语如“包含”(“comprises”、“comprised”和“comprising”)具有在大多数专利管辖范围、优选在所讨论的管辖范围中归于它们的含义；例如它们可以意指“包括”(“includes”、“included”、“including”)等。术语如“由
……
组成”、“基本上由
……
组成”(“consisting essentially of”和“consists essentially of”)具有在大多数专利管辖范围、优选在所讨论的管辖范围中赋予它们的含义；例如它们意味着排除全部、大部分其他要素或全部但可忽略量的其他要素除外，它们允许未明确列举的要素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。
[0193]
在本说明书的整个正文中引用了若干文献。本文中引用的每个文献(包括任何期刊文章或摘要、已发表或未发表的专利申请、已授权的专利、制造商的规范、说明书等)均通过引用并入于此。然而，不承认本文中引用的任何文献实际上是关于本发明的现有技术。
[0194]
参照以下附图和实施例对本发明作进一步描述，所述附图和实施例仅用于说明，并不旨在限制本发明。
[0195]
本发明由权利要求书限定，权利要求书应在说明书和附图的帮助下进行解释。
[0196]
序列的简要描述
[0197]
[0198][0199]
实施例
[0200]
实施例1：获得cho 9e4细胞系
[0201]
本实施例描述了从可从atcc以编号atcc ccl
‑
61商购的cho
‑
k1细胞系获得cho 9e4细胞系。
[0202]
1.cho
‑
k1细胞系
[0203]
从atcc获得在1969年在存在小牛血清的情况下冷冻的一小瓶cho
‑
k1细胞(atcc ccl
‑
61)。
[0204]
2.在ex
‑
cell
tm 302培养基中解冻小瓶并制备cho
‑
lg
‑
apf库
[0205]
将cho
‑
k1小瓶直接在补充有4mm谷氨酰胺的ex
‑
cell
tm 302培养基(safc)中解冻，并在静态支持物上扩增，然后在旋转器中扩增。将所得的cho
‑
lg
‑
apf库在ex
‑
cell
tm 302培养基中12次传代和17.3个世代之后冷冻。
[0206]
3.将ex
‑
cell
tm 302培养基中的cho
‑
lg
‑
apf库解冻并制备abc
‑
024p22库
[0207]
将cho
‑
lg
‑
apf小瓶在ex
‑
cell
tm 302培养基中解冻并扩增。将所得的abc
‑
024p22库在18.5个世代后解冻。
[0208]
4.使cmv07
‑
024库适应cdcho融合培养基并制备abc
‑
003库
[0209]
将cmv07
‑
024库解冻并使其直接适应补充有4mm谷氨酰胺的ex
‑
cell
tm cdcho融合培养基(safc)，并在摇床中适应12.5个世代，直到将在ex
‑
cell
tm cdcho融合培养基中的abc
‑
003库冷冻。
[0210]
5.将在cdcho融合培养基中的abc
‑
003库解冻并在cdcho融合培养基中制备abc
‑
053库
[0211]
将abc
‑
003小瓶在cdcho融合培养基中解冻，并且在稀释后将abc
‑
53库在4.2个世代后冷冻。
[0212]
6.将在cdcho融合培养基中的abc
‑
053库解冻，在cdcho融合培养基中选择、克隆和制备p15a11库
[0213]
将abc
‑
053库在补充有4mm谷氨酰胺的ex
‑
cell
tm cdcho融合培养基(safc)中解冻。在培养物扩增后，通过有限稀释在板中进行克隆，然后在cdcho融合培养基中扩增。将由该克隆产生的克隆p15a11的库冷冻。该克隆和扩增对应于约94个世代。
[0214]
7.将在cdcho融合培养基中的p15a11库解冻，通过直接在cdcho中传代来使库适应并在cdcho培养基中制备chosp10
‑
002库
[0215]
将p15a11库在补充有4mm谷氨酰胺的ex
‑
cell
tm cdcho融合培养基(safc)中解冻，并且在cdcho融合培养基中2次传代后，将细胞在cdcho培养基中稀释。在cdcho培养基中3次传代后，将chosp10
‑
002库在总共15.9个世代后冷冻。
[0216]
8.将在cdcho培养基中的chosp10
‑
002库解冻，扩增，通过离心消除团块并通过在96孔板中无团块的情况下传代培养进行选择，在6孔板和摇床中扩增以在cdcho培养基中制备chosp10
‑
012库
[0217]
将chosp10
‑
002库在补充有6mm谷氨酰胺的cdcho培养基(invitrogen)中解冻，然后进行扩增。将培养物离心以消除细胞团块并通过仅从上清液分离细胞来继续培养。在这一阶段，从解冻起，产生了11.3个世代。
[0218]
将该培养物以每孔10个细胞分装在96孔板中。具有单独地在悬浮液中增殖的细胞的孔在6孔板中扩增，然后在摇床中扩增。存在23.2个另外的世代直到chosp10
‑
012库被冷冻。
[0219]
9.将chosp10
‑
012库解冻，扩增并制备chosp11
‑
008库(9e4库)
[0220]
将chosp10
‑
012库在补充有6mm谷氨酰胺的cdcho培养基(invitrogen)中解冻，然后从锥形瓶阶段扩增到17l生物反应器。
[0221]
将9e4库在总共10个世代后冷冻。
[0222]
实施例2：产生其中dhodh基因无效的cho细胞系
[0223]
a
‑
crisprcas9引导rna(grna)的设计和构建
[0224]
为了使cho细胞中的dhdoh基因无效，发明人首先从恢复仓鼠dhodh基因序列开始并使用公众可获得的tefor软件设计不同的引导rna(grna)以用于在cho基因组中用crispr
‑
cas9转染。具有内含子和外显子的整个cho dhodh序列如图1中所示。
[0225]
所述软件确定了可以靶向dhodh基因的8个序列：
[0226]
序列1
[0227]
caccgggatgcagccatcatccttg(seq id no:6)
[0228]
aaaaccaaggatgatggctgcatcc(seq id no:7)
[0229]
序列2
[0230]
caccggatgcagccatcatccttgg(seq id no:8)
[0231]
aaaacccaaggatgatggctgcatc(seq id no:9)
[0232]
序列3
[0233]
caccggcagccatcatccttggggg(seq id no:10)
[0234]
aaaaccccccaaggatgatggctgc(seq id no:11)
[0235]
序列4
[0236]
caccggccatcatccttgggggagg(seq id no:12)
[0237]
aaaaccctcccccaaggatgatggc(seq id no:13)
[0238]
序列5
[0239]
caccggctattcgcttcacgtccct(seq id no:14)
[0240]
aaaacagggacgtgaagcgaatagc(seq id no:15)
[0241]
序列6
[0242]
caccggcctctacaaactgggcttt(seq id no:16)
[0243]
aaaacaaagcccagtttgtagaggc(seq id no:17)
[0244]
序列7
[0245]
caccgggctttgggtttgtcgaggt(seq id no:18)
[0246]
aaaacacctcgacaaacccaaagcc(seq id no:19)
[0247]
序列8
[0248]
caccggctggtctgaggagcctaca(seq id no:20)
[0249]
aaaactgtaggctcctcagaccagc(seq id no:21)
[0250]
虽然测试并克隆了8个序列，但在8个序列中，只有四个克隆序列被转染并且只有一个成功敲除dhodh基因。以下20核苷酸序列ggatgcagccatcatccttg(seq id no:5)用作相应的dna片段，以用于产生如图2中所示的grna。其靶向dhodh基因的第二外显子。为了获得合适的grna的转录，两个寡核苷酸caccgggatgcagccatcatccttg(oligo1，seq id no:6)和aaaaccaaggatgatggctgcatcc(oligo2，seq id no:7)被合成制备、退火并克隆在pcm3561(由invitrogen商业化)的独特baei位点。
[0251]
克隆的dna序列因此在u6启动子的控制之下，并且在dna被转染在cho细胞中后，其被转录成含有与tracrrna融合的crrna的单个转录单元。crrna部分对于dhodh基因的第二
maxcyte电穿孔盒中。使用的处理组件是特定于100μl盒的oc
‑
100，并选择对于cho的优化程序。
[0266]
进行以下转染。
[0267]
t1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pbh6840ko dhodh seq1t2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pbh6841ko dhodh seq4t3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pbh6842ko dhodh seq5t4
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pbh6843ko dhodh seq7t5
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
w/o adnh2o
[0268]
在电穿孔后，将细胞转移到25ml工作锥形烧瓶中。将它们放入37℃、5％co2静态培养箱中持续45min。然后添加补充有6mm l
‑
谷氨酰胺的25ml cdcho培养基以使细胞重悬，并将锥形烧瓶放入37℃、5％co2、70％湿度、110rpm摇床中。
[0269]
电穿孔后的第二天，通过有限稀释从上述cho9e4转染池中接种每孔单个细胞。大约20天后，一旦细胞达到约90％汇合度并在显微镜下检查时显现为健康的，就将细胞分装至有或没有尿苷的2个新的96孔板中。
[0270]
针对其对于缺乏尿苷的敏感性选择若干个克隆。使这些克隆适应以在补充有6mm谷氨酰胺和5mm尿苷的cdcho培养基中生长。
[0271]
为了证实基因编辑成功，使用qiagen dneasy kit
tm
(qiagen)从crispr
‑
cas9克隆细胞提取基因组dna。使用对于由crispr
‑
cas9靶向的dhodh基因座区域的适当引物进行pcr来扩增靶基因座，并使用覆盖潜在缺失区域的pcr片段通过ngs对pcr产物进行测序。
[0272]
实施例3：可替代地产生其中dhodh基因无效的cho细胞系
[0273]
a
‑
crispr cas9引导rna(grna)的设计和构建
[0274]
为了使cho细胞中的dhdoh基因无效，发明人首先从恢复仓鼠dhodh基因序列开始并使用公众可获得的tefor软件设计不同的引导rna(grna)以用于在cho基因组中用crispr
‑
cas9转染。
[0275]
所述软件确定了可以靶向dhodh基因的8个序列：
[0276]
序列1’[0277]
ggatgcagccatcatccttggtttt(seq id no:24)
[0278]
caaggatgatggctgcatcccggtg(seq id no:25)
[0279]
序列2’[0280]
gatgcagccatcatccttgggtttt(seq id no:27)
[0281]
ccaaggatgatggctgcatccggtg(seq id no:28)
[0282]
序列3’[0283]
gcagccatcatccttggggggtttt(seq id no:29)
[0284]
cccccaaggatgatggctgccggtg(seq id no:30)
[0285]
序列4’[0286]
gccatcatccttgggggagggtttt(seq id no:31)
[0287]
cctcccccaaggatgatggccggtg(seq id no:32)
[0288]
序列5’[0289]
gctattcgcttcacgtccctgtttt(seq id no:33)
[0290]
agggacgtgaagcgaatagccggtg(seq id no:34)
[0291]
序列6’[0292]
gcctctacaaactgggctttgtttt(seq id no:35)
[0293]
aaagcccagtttgtagaggccggtg(seq id no:36)
[0294]
序列7’[0295]
ggctttgggtttgtcgaggtgtttt(seq id no:37)
[0296]
acctcgacaaacccaaagcccggtg(seq id no:38)
[0297]
序列8’[0298]
gctggtctgaggagcctacagtttt(seq id no:39)
[0299]
tgtaggctcctcagaccagccggtg(seq id no:40)
[0300]
虽然测试并克隆了8个序列，但在8个序列中，只有四个克隆序列被转染并且只有一个成功敲除dhodh基因。以下20核苷酸序列ggatgcagccatcatccttg(seq id no:5)用作相应的dna片段，以用于产生grna。其靶向dhodh基因的第二外显子。为了获得合适的grna的转录，两个寡核苷酸ggatgcagccatcatccttggtttt(oligo1'，seq id no:24)和caaggatgatggctgcatcccggtg(oligo2'，seq id no:25)被合成制备、退火并克隆在pcm3561(由invitrogen商业化)的独特baei位点。
[0301]
克隆的dna序列因此在u6启动子的控制之下，并且在dna被转染在cho细胞中后，其被转录成含有与tracrrna融合的crrna的单个转录单元。crrna部分对于dhodh基因的第二外显子具有特异性，而tracrrna被cas9酶本身识别。
[0302]
b
‑
用于crispr
‑
cas9基因编辑的材料的制备
[0303]
如实施例1中所公开的，从购自atcc的cho k
‑
1细胞分离并选择cho9e4细胞，并使其在针对中国仓鼠卵巢(cho)细胞的生长优化的补充有6mm l
‑
谷氨酰胺的cdcho无血清和化学成分确定的培养基中在37℃下在8％co2和80％湿度的培养箱中以悬浮培养物的形式生长和维持。
[0304]
将10μg sgrna表达载体(pcm3561)用1μl baei酶以5个单位/μl具有20μm s
‑
腺苷甲硫氨酸(sam)的补充剂在25℃下消化1小时，然后通过电泳使用1％琼脂糖凝胶分离消化的质粒。然后通过凝胶提取试剂盒(qiagen kit)回收所得sgrna克隆载体。
[0305]
使用t4 dna连接酶(biolabs)连接sgrna克隆载体和退火的引导寡核苷酸，并将其在室温下孵育10min。
[0306]
将5μl连接产物添加至50μl大肠杆菌dh5a感受态细胞(invitrogen)。
[0307]
将细胞和dna在冰上孵育30min，然后在42℃下热激45s。添加500ml s.o.c培养基后，在37℃下(以800rpm)孵育1小时，使细菌有时间产生在质粒骨架上编码的抗生素抗性蛋白。孵育后，将每个管散布在一个补充有100μg/ml氨苄青霉素的lb上。将培养皿在37℃下孵育过夜。阴性对照(用水代替插入dna)用于评价转化的成功。
[0308]
对于扩增步骤，每次构建选择两个菌落并将所述菌落接种在管中的补充有100μg/ml氨苄青霉素的2ml lb培养基中，将其置于培养箱中过夜(37℃，700rpm)。通过离心收获过夜孵育的培养物。使用qiaprep miniprep kit
tm
(qiagen)回收扩增的dna(在eb缓冲液中洗脱)。然后通过sanger测序(有义和反义测序，gatc company)检查目的引导寡核苷酸的序列。在vector nti软件(thermofisher scientific)上通过比对验证后，将相应的菌落用于
接种补充有100μg/ml氨苄青霉素的200ml lb培养基。孵育24小时后，通过在4℃下以6000g离心15min来收获细菌。使用endofree plasmid maxi kit
tm
(qiagen)制备maxiprep。通过添加室温异丙醇使dna沉淀。离心1h(4℃，8000rpm)后，将dna沉淀物用无内毒素的室温70％乙醇洗涤。短暂新的离心后，将沉淀物风干1h，并重新溶解在合适体积的无内毒素无菌水中，以使dna浓度为5mg/ml。使用nanodrop设备测量dna浓度。
[0309]
制备了四种不同的质粒，即pbh6840质粒(ko dhodh seq1)、pbh6841质粒(ko dhodh seq4)、pbh6842质粒(ko dhodh seq5)和pbh6843质粒(ko dhodh seq7)。
[0310]
dna测序由gatc分包商(eurofins genomics company)进行。
[0311]
c
‑
crispr
‑
cas9基因编辑
[0312]
使用maxcyte stx及其cho定义的方案通过电穿孔进行转染。它们是在oc
‑
100(每次转染2000万个细胞)处理组件中进行的。
[0313]
转染前一天，将细胞以1.5
×
106个细胞/ml接种在补充有6mm l
‑
谷氨酰胺的cdcho培养基中。
[0314]
转染当天，将细胞用vicell装置(beckman&coulter)编号。将所需数量的细胞以250g离心10min，并丢弃上清液。
[0315]
对于每个转染条件，将20
×
106个细胞以250g离心10min。将沉淀物用70μl maxcyte缓冲液重悬。添加30μg dna，并将混合物(细胞、缓冲液和dna)转移到100μl maxcyte电穿孔盒中。使用的处理组件是特定于100μl盒的oc
‑
100，并选择对于cho的优化程序。
[0316]
进行以下转染。
[0317]
t1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pbh6840ko dhodh seq1t2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pbh6841ko dhodh seq4t3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pbh6842ko dhodh seq5t4
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pbh6843ko dhodh seq7t5
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
w/o adnh2o
[0318]
在电穿孔后，将细胞转移到25ml工作锥形烧瓶中。将它们放入37℃、5％co2静态培养箱中持续45min。然后添加补充有6mm l
‑
谷氨酰胺的25ml cdcho培养基以使细胞重悬，并将锥形烧瓶放入37℃、5％co2、70％湿度、110rpm摇床中。
[0319]
电穿孔后的第二天，通过有限稀释从上述cho9e4转染池中接种每孔单个细胞。大约20天后，一旦细胞达到约90％汇合度并在显微镜下检查时显现为健康的，就将细胞分装至有或没有尿苷的2个新的96孔板中。
[0320]
针对其对于缺乏尿苷的敏感性选择若干个克隆。使这些克隆适应以在补充有6mm谷氨酰胺和5mm尿苷的cdcho培养基中生长。
[0321]
为了证实基因编辑成功，使用qiagen dneasy kit
tm
(qiagen)从crispr
‑
cas9克隆细胞提取基因组dna。使用对于由crispr
‑
cas9靶向的dhodh基因座区域的适当引物进行pcr来扩增靶基因座，并使用覆盖潜在缺失区域的pcr片段通过ngs对pcr产物进行测序。
[0322]
实施例4：使用dhodh缺陷型cho细胞系产生重组蛋白
[0323]
在实施例2或3中获得的经验证的dhodh缺陷型cho克隆上测试抗体产生以验证这些克隆是否可以在没有特立氟胺的情况下表达抗体。
[0324]
产生并制备5mg/ml浓度的设计的载体。除了编码转座酶的质粒pbh6209外，它们全部都具有itr，其允许使用转座子系统将质粒整合到生产细胞的基因组中。
[0325]
使用的细胞系是cho 9e4_sp11野生型以及敲除dhodh的ko2和ko19。
[0326]
将cho 9e4_sp11在添加了6mm l
‑
谷氨酰胺的cdcho培养基中培养。
[0327]
将ko2和ko19在添加了6mm l
‑
谷氨酰胺和5mm尿苷的cdcho培养基中培养。
[0328]
开始时将它们培养在25ml工作锥形烧瓶中，并进行扩增直到达到所需的活细胞数量。
[0329]
在maxcyte stx装置上使用由maxcyte开发的高效电穿孔方案产生不同的蛋白质。
[0330]
在转染前一天将细胞以1.5
×
106分装。
[0331]
在转染当天，将细胞用两种载体共转染：含有人抗cd38重链(hc)和轻链(lc)表达盒和dhodh选择标记物(如wo 2016/062837中所述)的dna质粒表达载体，所述表达盒和选择标记物侧翼为piggybac识别位点(反向末端重复序列，itr)；以及来自transposagen的转座酶载体，其催化转座子迁移至cho基因组中的ttaa位点。
[0332]
对于每个转染条件，将80
×
106个细胞以250g离心10min。将沉淀物用250μl maxcyte缓冲液重悬。添加120μg dna，并将混合物(细胞、缓冲液和dna)转移到400μl maxcyte电穿孔盒中。使用的处理组件是特定于400μl盒的oc
‑
400，并选择对于cho的优化程序。
[0333]
对于恢复期，将转染的细胞在37℃、40min且无搅拌的情况下立即转移到125ml烧瓶中。添加补充有6mm谷氨酰胺(对于ko细胞， 5mm尿苷)的25ml预热的cdcho培养基，并将转染的培养物在37℃下保持在8％co2和80％湿度的培养箱中。在转染后第1天，将细胞离心并1
×
106个细胞/ml重悬于补充有6mm谷氨酰胺、30％feedb(gibco)和不同量的特立氟胺(0、5、15和25μm)的cd opticho
tm
选择培养基(gibco)中。
[0334]
在转染后第14天，将细胞在25℃下以200g离心10min。将上清液通过0.22μm pes过滤器过滤，并使用octet装置测量抗体滴度。
[0335]
如图3所示，两个克隆(ko2和ko19)在没有特立氟胺的情况下展示出良好的产量，并且基因组ngs显示这两个克隆在dhodh基因座的两个等位基因处含有敲除突变。
[0336]
值得注意的是，即使在不存在特立氟胺作为选择剂的情况下，所有ko克隆也能产生抗体。选择两个克隆ko2和ko19进行进一步研究。此外，这些引用的克隆是唯一显示dhodh基因的纯合敲除的克隆。
[0337]
因此，本实施例表明本发明提供了一组细胞系和载体，其允许在不使用任何选择压力的情况下产生抗体。
[0338]
实施例5：评价三种人dhodh变体
[0339]
为了验证使用受损形式的人dhodh是否增强了整合到cho基因组中的拷贝数从而允许更好的生产力，将dhodh ko2、ko19和wt cho 9e4细胞系用米勒综合征患者中所描述的三种人dhodh cdna变体(r135c、g202a和r346w，特别参见fang等人(2012)biosci.32:631
‑
639)转染。作为对照载体，将携带编码人wt dhodh的cdna的质粒转染。
[0340]
将用sali
‑
bglii限制性酶消化的50ng编码人抗cd38单克隆抗体mab
‑
a的质粒载体(pbh6204)与37.5ng对应于每种变体(r135c、g202a和r346w)的sali
‑
bglii纯化的dna片段混合。添加1μl t4
‑
dna连接酶(biolabs)和浓缩的连接缓冲液后，使连接反应(最终体积10μ
l)在室温下进行10min。
[0341]
然后使用该dna池的等分试样转化大肠杆菌感受态细胞(stellar
tm
，塔卡拉)。
[0342]
根据制造商的建议，使用可商购的qiagen质粒小量制备试剂盒(qiagen)进行小规模质粒制备。
[0343]
使用603有义(序列gttggccttccaatggctt，seq id no:41)和503反义(序列gttccttcacaaagat，seq id no:42)寡核苷酸的dna测序由gatc分包商(eurofins genomics company)进行。
[0344]
使用maxcyte stx通过电穿孔进行dhodh变体的转染。如上所述，它们是在oc
‑
100处理组件中进行的。
[0345]
在转染后一天，将细胞离心并以1
×
106个细胞/ml重悬于cd cho选择培养基中，所述选择培养基对于9e4 cho细胞补充有6mm谷氨酰胺和25μm特立氟胺并且对于ko2和ko19克隆不补充特立氟胺。
[0346]
两次传代后，以0.3
×
106个细胞/ml在对于9e4 cho细胞添加了30％feedb和6mm谷氨酰胺和25μm特立氟胺并且对于ko2和ko19克隆不添加特立氟胺的cd opticho培养基中开始产生mab
‑
a。
[0347]
在转染后第14天，将细胞在25℃下以200g离心10min。将上清液通过0.22μm pes过滤器过滤，并使用octet装置测量抗体滴度。
[0348]
如图4所示，未观察到r138c和r346w dhodh突变对wt cho 9e4和dhodh ko克隆的显著影响。另一方面，g202a突变允许使用wt cho 9e4系获得克规模的抗体产量，并提高dhodh ko2和ko19克隆的生产力。
[0349]
实施例6：使用本发明的表达系统产生蛋白质
[0350]
使用本发明的表达系统、特别是使用人dhodh cdna(其包含上文实施例3中公开的经验证的克隆cho 9e4 ko2和ko19上的上文公开的g202a突变)产生不同类型的蛋白质，以证实最终生产力至少与使用人谷氨酰胺合成酶(gs)作为可选择标记物的现有技术的表达系统的最终生产力在相同的范围内。
[0351]
产生了以下蛋白质：
[0352]
‑
脂肪酶：
[0353]
ο使用单顺反子cdna plbl2
‑
his以及
[0354]
ο使用可选择标记物hdhodh g202a质粒或hgs质粒，
[0355]
‑
单克隆抗体(mab
‑
b)：
[0356]
ο使用编码所述抗体的vh和vl链的双顺反子cdna以及
[0357]
ο使用可选择标记物hdhodh g202a质粒或hgs质粒；
[0358]
‑
双特异性抗体：
[0359]
ο使用(i)编码所述抗体的vh和vl链的双顺反子cdna或(ii)分别编码所述抗体的vh和vl链的两个单顺反子cdna，以及
[0360]
ο使用可选择标记物(i)hdhodh g202a质粒(用于双顺反子cdna)或(ii)两个hdhodh g202a质粒或hdhodh g202a质粒和hgs质粒(用于单顺反子cdna)；
[0361]
‑
三特异性抗体：
[0362]
ο使用两个双顺反子cdna以及
[0363]
ο使用可选择标记物hdhodh g202a质粒和hgs质粒。
[0364]
在转染前一天，将细胞在补充有6mm谷氨酰胺和5mm尿苷的cd cho培养基中以1.5
×
106个细胞/ml稀释。
[0365]
在转染当天，将细胞悬浮液在补充有6mm l
‑
谷氨酰胺和5mm尿苷的cd cho中以1.1
×
106个细胞/ml稀释。将试剂涡旋5s并减慢旋转，然后以25μl/管添加至50ml空管中。在第二个50ml管中，将12.5μg cdna在cd cho培养基中稀释，然后将稀释的dna一次性倒入纯试剂中。立即将溶液均质化并孵育10min。将/dna转染混合物倒在细胞上，并将培养物在37℃、190rpm和8％的co2水平下孵育。
[0366]
使用invitrogen
tm
countess
tm
装置对转染后24小时的细胞进行计数。将整个细胞培养物以200g离心10min。将沉淀物在以下公开的条件下用2 5ml预热的生产培养基重悬。
[0367]
在包含3个或更多个亚基的复合蛋白质的情况下，再次使用上述转染方案进行第二次转染。
[0368]
‑
对于脂肪酶单顺反子载体(具有his标签的蛋白质)
[0369][0370][0371]
msx：l
‑
甲硫氨酸亚砜亚胺；gln：谷氨酰胺；uri：尿苷；tnf：特立氟胺
[0372]
‑
对于单克隆抗体mab
‑
b双顺反子vh和vl载体：
[0373][0374]
msx：l
‑
甲硫氨酸亚砜亚胺；gln：谷氨酰胺；uri：尿苷；tnf：特立氟胺；feedb：商业进料
[0375]
‑
对于双特异性抗体双顺反子或两个单顺反子vh和vl载体：
[0376]
[0377][0378]
msx：l
‑
甲硫氨酸亚砜亚胺；gln：谷氨酰胺；uri：尿苷；tnf：特立氟胺；feedb：商业进料
[0379]
‑
对于三特异性抗体双顺反子vh和vl载体：
[0380][0381]
msx：l
‑
甲硫氨酸亚砜亚胺；gln：谷氨酰胺；uri：尿苷；tnf：特立氟胺；feedb：商业进料
[0382]
转染后72小时，使用invitrogen
tm
countess
tm
装置对细胞进行计数，并通过更换另一种培养基提高蛋白质产量。此外，在转染后3天和7天测量转染的细胞的活力。
[0383]
在转染后第14天，将细胞在25℃下以200g离心10min。将上清液通过0.22μm pes过滤器过滤，并使用octet装置测量蛋白质滴度。
[0384]
获得了以下结果。
[0385]
a)脂肪酶
[0386][0387]
第14天的脂肪酶产量如图5所示。
[0388]
这些结果表明，两种ko dhodh细胞系都具有在不存在特立氟胺选择压力的情况下产生脂肪酶的能力，这能够降低对生产细胞的毒性。
[0389]
此外，ko dhodh细胞系能够产生与现有技术gs系统(在野生型9e4cho细胞中)相同范围的脂肪酶，即在25ml规模下为1g/l。
[0390]
b)单克隆抗体mab
‑
b
[0391][0392][0393]
第14天的单克隆抗体mab
‑
b产量如图6所示。
[0394]
这些结果表明，ko dhodh细胞系在该特定抗体的产生过程中表现不同。事实上，即使两个克隆的生产力都比现有技术特立氟胺产生具有更好的生产力，但ko19克隆的生产力明显优于ko2克隆。
[0395]
在最佳ko细胞系(ko19)中，抗体产量与现有技术gs系统(在野生型9e4 cho细胞
中)在相同范围内，在25ml规模下为约0.67g/l。
[0396]
此外，使用ko细胞系观察到增加的活力。
[0397]
c)双特异性抗体
[0398][0399]
图7显示了第14天的双特异性抗体产量。
[0400]
在所有测试情况中，双特异性抗体的生产效率不如单特异性抗体。然而，尽管产生这种双特异性抗体存在困难，但最佳ko细胞系的生产力与现有技术gs系统(在野生型9e4 cho细胞中)在相同范围内，在25ml规模下为约0.145g/l。
[0401]
此外，使用ko细胞系观察到增加的活力。
[0402]
d)三特异性抗体
[0403][0404]
第14天的三特异性抗体产量如图8所示。
[0405]
在所有条件下，两种ko细胞系得到了与现有技术选择系统的结果在相同范围内的结果，即显著的0.5g/l。
[0406]
因此，本实施例证实了ko dhodh cho克隆适合于表达各种蛋白质形式(蛋白质、单
克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体)。这些克隆甚至可以用于双转染以产生复合蛋白质。