使用适配体检测口腔样品中的微生物内毒素的制作方法

1.本发明整体涉及对牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)和苍白普雷沃菌(prevotella pallens)具有高结合亲和力和特异性的核酸适配体。本发明还涉及此类适配体作为试剂以开发用于评估口腔样品中微生物毒素和微生物丰度的测定和即时测试的用途。


背景技术：

2.牙周病，诸如齿龈炎和牙周炎，涉及由功能失调的微生物群落和宿主免疫应答引起的齿龈组织中的慢性炎症。它们是世界上最普遍的疾病之一，并且仍然是当今世界牙齿脱落的最常见原因，并且可以影响全世界高达90％的人口。根据fda专论(12 cfr part 356，第68卷，第103期(2003))将齿龈炎定义为“最常由牙菌斑引起的齿龈的炎性病变。齿龈炎的特征在于组织肿胀和发红、点彩(正常状态，其中健康齿龈的表面由小叶构成)丧失、有光泽的表面和增加的组织温度。齿龈也可能在轻微刺激(诸如刷牙)时出血或可能自发出血。齿龈炎通常不会疼痛。”在健康的齿龈中，微生物群落与宿主处于稳态平衡，并且宿主免疫系统限制细菌过度生长并中和有毒产物，诸如脂多糖(lps)和脂磷壁酸(lta)。随着细菌在齿龈边缘或龈下缝隙中过度生长，宿主和细菌之间错综复杂的平衡被破坏。来自宏基因组学研究的最新数据显示，细菌物种诸如苍白普雷沃菌、中间普雷沃菌(prevotella intermedia)、牙龈卟啉单胞菌和龈沟产线菌(filifactor alocis)在龈上和龈下菌斑中增加。虽然齿龈炎和牙周炎的病因仍然难以捉摸，但有一点是清楚的；与临床确定的疾病部位相比，牙菌斑的组成在健康部位显著不同。这一观察结果，以及使用基因组学、蛋白质组学和代谢组学中新开发的工具表征宿主和细菌相互作用的进展，导致注意到齿龈炎和牙周炎是宿主和多微生物群落之间破坏的稳态的结果(lamont rj和hajishengallis g.polymicrobial synergy and dysbiosis in inflammatory disease.g trends mol med.2015；21:172-83)中所述的那些。
3.牙菌斑中的多微生物群落产生各种毒力因子；例如，许多细菌产生消化酶(诸如透明质酸酶)以分解将宿主细胞粘合在一起的多糖、溶解血凝块的纤维蛋白的纤维蛋白溶解酶和降解结缔组织中胶原蛋白的胶原酶。革兰氏阴性细菌分泌内毒素，也称为lps，而革兰氏阳性细菌产生lta和肽糖。此外，一种病原菌可以产生多种毒力因子；例如，据报道，牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)产生多种毒力因子，这些因子参与牙周组织的炎性和破坏性事件。这些影响因子包括荚膜、外膜、其相关的lps、菌毛、蛋白酶和选定的酶。
4.lps是所有革兰氏阴性细菌的整体组分，并且存在于外膜层中。牙龈卟啉单胞菌lps具有显著量的含有四酰化和五酰化结构的异质性。它们中的一些已被纯化。lps 1690是高毒性的，而lps 1435/1449相对温和。从化学上讲，lps由亲水性多糖和被称为脂质a的疏水脂质部分组成。后者是lps分子的实际毒性部分，并含有显示对其促炎活性必不可少的磷酸根基团。从机制上讲，lps首先结合到lps结合蛋白(lbp)，然后将lbp-lps复合体转移至膜结合的cd14，从而能够与细胞膜上的toll样受体(tlr)4相互作用。lps与细胞膜上的tlr4的
结合激活tirap-myd88依赖性nfkb和tram-trif依赖性irf3或irf7两者信号转导途径，并随后刺激促炎细胞因子和趋化因子(诸如干扰素(ifn)γ、肿瘤坏死因子-α(tnfα)、白细胞介素(il)-1β、il-6、il-8和il-12)的产生。此外，诱导产生一氧化氮、前列腺素、白三烯和蛋白水解酶。重要的是，据报道lps在小鼠和大鼠中引起牙周炎。
5.牙龈卟啉单胞菌还分泌外毒素和酶，在它们释放后会对宿主造成损伤。这些酶包括蛋白酶、凝固酶和纤维蛋白溶酶。值得注意的是，牙龈卟啉单胞菌产生肽基精氨酸脱亚胺酶，其可以将游离的或肽结合的精氨酸修饰为瓜氨酸。瓜氨酸化蛋白质特别有害，因为它们会引起自身免疫应答，并被假设为类风湿性关节炎的罪魁祸首。此外，牙龈卟啉单胞菌还产生两种类型的牙龈蛋白酶、赖氨酸特异性(kgp)和精氨酸特异性(rgps)。牙龈蛋白酶在激活牙周组织中的炎症和组织破坏中起主要作用。
6.目前通过临床量度诸如牙龈发红、牙龈出血或袋深度来实现对人的齿龈炎和牙周炎的严重度的评估。虽然这些量度基于专业开发的量表，但实际值可能因审查员的不同而变化。需要量化齿龈炎严重程度和口腔卫生产品在降低炎性反应方面的治疗效果。期望从没有人为可变性和误差的仪器获得客观读数。
7.已开发出多种即时测试，如最近综述的(nancy srivastava、prathibha anand nayak和shivendra rana.j clin diagn res.2017年8月；11(8):ze01
–
ze06.point of care-a novel approach to periodontal diagnosis-a review)。宿主生物标志物和微生物生物标志物均用于口腔样品中的诊断，此类生物标志物的示例包括唾液、口腔灌洗液、龈下和龈上菌斑、龈沟液、颊刷样品和齿龈刷样品。dna聚合酶链式反应已被用于针对病原性细菌检测唾液样品中存在的细菌的类型和浓度，诸如牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、伴放线聚集杆菌(aggregatibacter actinomycetem-comitans)、核粒梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、啮蚀艾肯氏菌(eikenella corrodens)、直肠弯曲杆菌(campylobacter rectus)、福赛斯坦纳菌(tannerella forsythia)和齿垢密螺旋体(treponema denticola)。rna也已被用于检测导致牙周炎的微生物，例如伴放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体。
8.另选的方法涉及检测由牙周病原体产生的酶。具有胰蛋白酶样活性的酶仅由可培养的口腔微生物区系的少数成员产生，即牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体和二氧化碳嗜纤维菌属(capnocytophaga sp.)(hemmings kw,griffiths gs,bulman js.the presence of this enzyme in a plaque sample can be elicited by the hydrolysis of a synthetic trypsin substrate,n-benzoyl-dl-arginine-2-naphthylamide(bana).j clin periodontol.1997；24:110-4)。它们的酶可裂解n-苯甲酰基-dl-精氨酸-2-萘酰胺并产生蓝黑色产物。baba测试用于检测广泛认为是牙周炎病原体的牙龈卟啉单胞菌、福赛斯拟杆菌(bacteroides forsythus)、齿垢密螺旋体和二氧化碳嗜纤维菌属。
9.periocheck(advanced clinical technologies inc.,westwood,ma 02090,usa)也是检测与胶原蛋白分解有关的中性蛋白酶存在的即时测试。胶原蛋白的分解是牙周病的重要特征。对于该测试，将龈沟液收集在滤纸条上并置于胶原蛋白染料标记的凝胶基质上。来自龈沟液的酶将胶原蛋白消化成片段，并且可溶性染料标记的片段扩散到样品条纸上，从而使条变成蓝色。将显色反应的量和强度与标准着色表进行比较，并计算沟液样品中的中性蛋白酶活性水平。
10.基于蛋白酶的即时测试方便且易于运行，但它们不能辨别确切的细菌物种。dna和rna方法提供了种特异性，但dna聚合酶反应和rna测量是不方便的。从以上内容应当显而易见的是，需要更灵敏、准确和一致的测试。


技术实现要素：

11.本发明提供了一种包含寡核苷酸的适配体组合物，该寡核苷酸为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物、或它们的混合物中的至少一种；其中所述适配体组合物对来自普雷沃菌属或卟啉单胞菌属的一种或多种细菌物种具有结合亲和力。
12.本发明提供了一种用于检测内毒素和外膜囊泡的方法，该方法包括获得口腔样品；将口腔样品施加到测定试剂盒；以及测量测定结果。
13.该测定试剂盒可包含seq id no 1001至seq id no 1105或seq id no 2001至seq id no 2108的至少一种寡核苷酸。该测定试剂盒可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸与seq id no 1001至seq id no 1105或seq id no 2001至seq id no 2108具有至少50％核苷酸序列同一性。该测定试剂盒可包含至少一种寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有seq id no 1001至seq id no 1105或seq id no 2001至seq id no 2108的天然或非天然核碱基。该测定试剂盒可包含为seq id no 1001至seq id no 1105或seq id no 2001至seq id no 2108中的至少一者的寡核苷酸。
14.该方法可包括共价或非共价地附接到一个或多个报告分子的至少一种寡核苷酸；其中所述一种或多种报告分子为金纳米粒子、荧光标签、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白和乳胶、或它们的混合物中的至少一种。
附图说明
15.图1a示出了在第1、3和6周相对于阴性对照组测试方案组中的较低平均出血(gbi)。
16.图1b示出了在第1、3和6周相对于阴性对照组测试方案组中的较低平均炎症(mgi)。
17.图2a示出了说明在生长期间或在应激下细菌释放外膜囊泡(omv)的扫描电子显微照片。
18.图2b示出了在不同放大倍率下细菌的透射电子显微镜图像。
19.图2c示出了细菌膜的透射电子显微镜图像及其测量。
20.图2d示出了细菌外膜囊泡的透射电子显微镜图像。
21.图2e示出通过切向流过滤牙龈卟啉单胞菌培养基过滤的滤液中的内毒素活性低。
22.图2f示出当将牙龈卟啉单胞菌渗余物用水稀释并通过100kd切向流过滤工艺时滤液中lps活性高。
23.图2g示出在苍白普雷沃菌中几乎所有内毒素活性保留在渗余物中。
24.图2h示出当将苍白普雷沃菌渗余物用水稀释并通过100kd切向流过滤工艺时滤液中lps活性低。
25.图2i示出将浓缩的渗余物通过超速离心沉淀，然后用不连续的碘克沙醇梯度分
离，并且在不连续的碘克沙醇梯度中出现了黄色带。
26.图2j示出以od260测量的dna和rna分子漂浮在梯度的顶部。通过od280估计的蛋白质位于dna和rna分子的正下方。
27.图3a示出牙龈卟啉单胞菌的超纯lps制备物具有两个峰。以一分钟的间隔收集洗脱液，在注入样品后10分钟开始，以考虑从检测器到样品收集出口的流动时间。在每个级分中测量内毒素活性，并且大部分内毒素活性在级分8至11中。
28.图3b示出实验室纯化的牙龈卟啉单胞菌的细菌结合型lps在光谱分析方面具有与超纯lps制备物类似的图案。主要内毒素活性在级分9至13中。
29.图3c示出从培养基中分离的lps与细菌结合型lps稍有不同，因为从培养基中分离的lps显示出宽的一个峰。
30.图3d示出了质谱中纯化的牙龈卟啉单胞菌细菌细胞脂多糖的多个种类。
31.图3e示出了质谱中纯化的分泌型牙龈卟啉单胞菌脂多糖的多个种类。
32.图3f示出了质谱中纯化的苍白普雷沃菌细菌细胞脂多糖的多个种类。
33.图3g示出了质谱中invivogen(来自大肠杆菌(e.coli)055:b5的超纯lps)的超纯大肠杆菌细菌细胞脂多糖的多个种类。
34.图4a示出通过碱基对互补相互作用与捕获探针杂交的ssdna。当结合靶标分子时，ssdna发生构象变化，这解开了捕获探针与ssdna之间的碱基对，从而导致ssdna从捕获探针解离。
35.图4b示出ssdna带逐渐富集。在selex的每一轮中，使用pcr程序扩增所选择的ssdna，并且在琼脂糖凝胶上观察部分pcr产物。
36.图4c示出使用来自不同物种的细菌材料进行阴性选择。
37.图5a-j示出了预测的适配体二级结构。
38.图6a示出了与淬灭剂连接的适配体，如果将淬灭剂和荧光分子两者邻近放置，则淬灭剂可降低荧光分子的强度。
39.图6b示出了如何使用酶来测定口腔样品中内毒素的丰度。
40.图7a示出了通常由硝酸纤维素膜、样品垫、缀合物垫、芯吸或吸收垫和背衬垫组成的侧向流测定。
41.图7bi-biii示出了用于检测一个或多个靶标的侧向流测定。在图7b中，仅检测到一种类型的来自一种细菌物种的内毒素或外膜囊泡。例如，齿龈卟啉单胞菌内毒素的一种或两种适配体缀合至报告分子诸如金纳米粒子。
42.图7ci-ciii示出当样品混合物迁移至测试线时，报告金纳米粒子-寡核苷酸与固定在测试线中的捕获寡核苷酸杂交。
43.图7di-diii示出随着金纳米粒子-适配体-内毒素复合物迁移至对照线，金纳米粒子-适配体-内毒素复合物中的生物素将与对照线中的链霉抗生物素蛋白结合。
44.图7e示出在一个装置中可检测一种、两种或更多种内毒素、外膜囊泡或细菌。
具体实施方式
45.本发明涉及适配体及其在确定口腔中特定种类的细菌和内毒素的存在中的用途。
46.在实施方案中，本发明包括用于监测口腔样品中特定内毒素水平变化的适配体、
方法和试剂盒。该方法包括收集口腔样品，将样品施加到测定格式，并读取内毒素与相关适配体的特异性结合。该试剂盒包括基于特定适配体的96孔测定格式和即时测定格式。
47.在实施方案中，本发明涉及开发适配体的方法；例如，通过使用selex选择针对牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和其他革兰氏天然细菌的内毒素和外膜囊泡的适配体，并使用这些适配体开发用于定性和定量测量口腔样品中的内毒素、外膜囊泡和细菌的测定。
48.在实施方案中，本发明提供了适配体组合物。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸由以下项组成：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物以及它们的混合物，其中所述适配体组合物对牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和其他革兰氏天然细菌具有结合亲和性。
49.在实施方案中，本发明涉及分析牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和其他革兰氏天然细菌的内毒素和外膜囊泡的方法。这些方法包括选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的至少一种寡核苷酸。
50.在实施方案中，检测内毒素和外膜囊泡的试剂盒可包括至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的一个或多个基序。
51.此外，本发明还描述了用于纯化来自牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的内毒素以及用于分离牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的外膜囊泡的方法和程序。
52.本发明涉及通过捕获探针选择高亲和力适配体的方法。在selex的前几轮中，使用17个核苷酸的捕获探针。随着选择的进行，捕获探针的长度从17个核苷酸增加到30个核苷酸。很可能，结合强度随着捕获探针的长度而增加。较长的捕获探针将有助于选择较高亲和力的适配体。
53.i.定义
[0054]“适配体”可为能够以高亲和力和特异性结合特定分子的肽或核酸分子，诸如rna或dna。结合适配体的示例性配体包括但不限于小分子，诸如药物、代谢物、中间体、辅因子、过渡态类似物、离子、金属、核酸和毒素诸如内毒素。适配体还可结合天然和合成聚合物，包括蛋白质、肽、核酸、多糖、糖蛋白、激素、受体和细胞表面诸如细胞壁和细胞膜。配体与适配体的结合引起效应结构域中的构象变化并改变其与其靶标分子相互作用的能力。适配体将最典型地通过针对靶标分子结合的体外选择来获得。然而，适配体的体内选择也是可能的。适配体具有能够在环境中与预期靶标分子形成复合物的特异性结合区域，其中相同环境中的其他物质不与核酸复合。结合的特异性根据如与适配体对环境中其他材料或一般来讲不相关分子的解离常数相比适配体对其配体的比较解离常数(kd)来定义的。配体是与适配体结合的亲和力比与不相关材料结合的亲和力更大的配体。通常，适配体相对于其配体的kd将比适配体与环境中不相关材料或伴随材料的kd小至少约10倍。甚至更优选地，kd将小至少约50倍，更优选地小至少50至约100倍，并且最优选地小至少约200倍。适配体的长度通常将介于约10与约300个核苷酸之间。更常见的是，适配体的长度将介于约30与约100个核苷酸之间。
[0055]
术语“核酸分子”和“核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该已知类似物具有与参考核酸类似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式
代谢。除非另外指明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(诸如简并密码子置换)和互补序列以及明确指明的序列。核酸可为任何物理形式，例如线性形式、环状形式或超螺旋形式。术语核酸可与寡核苷酸、基因、cdna和基因编码的mrna互换使用。如本文所用，术语“核酸”是指核苷酸的聚合物或低聚物。当核苷酸的糖部分是d-核糖时，核酸也被称为“核糖核酸”，当糖部分为2-脱氧-d-核糖时，核酸也被称为“脱氧核糖核酸”。
[0056]
如本文所用，术语“核苷”是指由通常通过β-糖苷键连接至5-碳糖(例如，d-核糖或2-脱氧-d-核糖)的核酸碱基诸如嘌呤或嘧啶组成的糖胺。当糖部分是d-核糖时，核苷也被称为“核糖核苷”，当糖部分为2-脱氧-d-核糖时，核苷也被称为“脱氧核糖核苷”。如本文所用，术语“核酸碱基”是指具有碱基的化学性质的包含氮原子的化合物。核碱基的非限制性示例为包含吡啶、嘌呤或嘧啶部分的化合物，包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。
[0057]
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指由核苷酸组成的低聚物。
[0058]
如本文所用，在两种或更多种寡核苷酸、核酸或适配体的上下文中，术语“相同”或“序列同一性”是指当比较和比对以达到最大对应性时两个或更多个相同或具有指定百分比的相同核苷酸的序列，诸如当使用序列比较算法或通过手动序列列表比较进行测量时。
[0059]
如本文所用，在两种或更多种寡核苷酸、核酸或适配体的上下文中，术语“基本上同源”或“基本上相同”通常是指当比较和比对以达到最大对应性时两个或更多个具有至少40％、60％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸同一性的序列，如使用序列比较算法或通过目测进行测量的。
[0060]
如本文所用，术语“表位”是指靶标的与适配体相互作用的区域。表位可以是靶标内的邻接片段，或者可由在靶标的折叠形式中物理上邻近的多个点表示。
[0061]
如本文所用，术语“结合亲和力”可使用以下等式计算：结合亲和力＝结合至一种或多种细菌物种的量/与该一种或多种细菌物种一起温育的适配体总量。
[0062]
如本文所用，术语“基序”是指存在于具有与特定靶标的结合亲和力的适配体库中的连续的或一系列连续的核苷酸序列，并且与随机寡核苷酸库相比表现出比预期的统计学显著更高的发生概率。基序序列通常是适配体选择过程的结果或驱动因素。
[0063]
如本文所用，术语“96孔测定”是指在实验室中常规运行以分析多于一种样品的测定。该测定本质上是定性和定量的。通常，在测定中包括标准曲线或者阳性对照或阴性对照。该测定可在6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板中进行。
[0064]
如本文所用，术语“即时测试或测定”包括可在商店、牙医诊所、消费者家中或标准实验室以外的任何地方进行的任何测定。即时测定可为侧向流测定，可为夹心测定，可为竞争性测定，或可为比色测定，或可为荧光测定。
[0065]
如本文所用，卟啉单胞菌属细菌包括在口腔中该属中的任何细菌。
[0066]
如本文所用，普雷沃菌属细菌包括在口腔中该属的任何细菌。
[0067]
如本文所用，革兰氏阴性细菌包括在口腔中的任何革兰氏阴性细菌。
[0068]
如本文所用，术语“外膜囊泡”意指来源于外膜或包含外膜的任何结构。
[0069]
如本文所用，术语“内毒素”是指细菌外膜囊泡上的脂多糖或在环境中自由漂浮的与细菌分离的脂多糖。
[0070]
如本文所用，术语“口腔样品”包括口腔灌洗液、唾液、齿龈刷样品、龈上菌斑或龈
下菌斑。
[0071]
如本文所用，术语“捕获探针”意指可与另一dna序列杂交的dna序列。例如，可将捕获探针锚定到96孔板中的孔的底部。该捕获探针可与适配体杂交，从而将适配体保留在孔中。
[0072]
如本文所用，术语“报告探针”是共价或非共价地连接到分子或纳米粒子的dna序列。该分子例如可为颜料、荧光染料、酶或荧光蛋白。报告探针可具有与另一dna序列互补的dna序列。
[0073]
如本文所用，词语“或”当用作两个或更多个元素的连词时，是指包括单独的所述元素或所述元素的组合；例如x或y，是指x或y或两者。
[0074]
如本文所用，冠词“一个”和“一种”被理解为意指受权利要求书保护的或描述的一种或多种材料，例如“适配体”或“包含适配体的组合物”[0075]
除非另外指明，否则本文提及的所有测量均在约23℃(即室温)处进行。
[0076]
ii.适配体组合物
[0077]
适配体是结合靶标分子的特异性且复杂的三维形状的单链寡核苷酸。适配体的分子识别基于结构相容性和分子间相互作用，包括静电力、范德华相互作用、氢键以及芳环与靶材料的π-π堆叠相互作用。适配体的靶标包括但不限于肽、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗生素、低分子量有机或无机化合物、甚至全细胞。适配体复合物的解离常数和对应的靶材料通常在微摩尔水平和皮摩尔水平之间变化，这相当于抗体对它们的抗原的亲和力。适配体也可被设计成具有高特异性，从而能够区分靶分子与密切相关的衍生物。
[0078]
适配体通常通过指数富集的配体系统进化(selex)从大型随机核酸库中体外设计。当针对低分子量染料选择单链rna时，在1990年首次引入了selex方法(ellington,a.d.,szostak,j.w.,1990.nature 346:818-822)。几年后，还描述了单链dna适配体和包含化学修饰的核苷酸的适配体(ellington,a.d.,szostak,j.w.,1992.nature 355:850-852；green,l.s.等人，1995.chem.biol.2:683
–
695)。自那时起，已选择用于数百个微观靶标诸如阳离子、小分子、蛋白质、细胞或组织的适配体。来自文献的实例汇编包括在以下网站的数据库中：http://www.aptagen.com/aptamer-index/aptamer-list.aspx。
[0079]
核酸适配体为具有特定二级和三级结构的单链寡核苷酸，这些单链寡核苷酸能够以高亲和力和特异性结合到靶标。在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸由以下项组成：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物以及它们的混合物，其中该适配体组合物对来自卟啉单胞菌属、普雷沃菌属和任何其他革兰氏阴性细菌属的一种或多种细菌物种具有结合亲和力。在本发明中，所述一个或多个卟啉单胞菌属和普雷沃菌属可选自：不解糖卟啉单胞菌(porphyromonas asaccharolytica)、卡托氏卟啉单胞菌(porphyromonas catoniae)、牙髓卟啉单胞菌(porphyromonas endodontalis)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)、卟啉单胞菌属_口腔分类群_278(porphyromonas_sp_oral_taxon_278)、卟啉单胞菌属_口腔分类群_279、上野卟啉单胞菌(porphyromonas_uenonis)、保氏普雷沃菌(prevotella baroniae)、二路普雷沃菌(prevotella bivia)、颊普雷沃菌(prevotella buccae)、牙普雷沃菌(prevotella dentalis)、栖牙普雷沃菌(prevotella denticola)、解糖胨普雷沃菌(prevotella disiens)、栖组织普雷沃菌(prevotella histicola)、间型普
雷沃菌(prevotella intermedia)、洛氏普雷沃菌(prevotella loescheii)、斑状普雷沃菌(prevotella maculosa)、马氏普雷沃菌(prevotella marshii)、产黑色素普雷沃菌(prevotella melaninogenica)、彩虹普雷沃菌(prevotella micans)、多形普雷沃菌(prevotella multiformis)、食多糖普雷沃菌(prevotella multisaccharivorax)、南锡普雷沃菌(prevotella nanceiensis)、变黑普雷沃菌(prevotella nigrescens)、口腔普雷沃菌(prevotella oralis)、口普雷沃菌(prevotella oris)、龈炎普雷沃菌(prevotella oulorum)、苍白普雷沃菌、胸膜炎普雷沃菌(prevotella pleuritidis)、解糖普雷沃菌(prevotella saccharolytica)、唾液普雷沃菌(prevotella salivae)、普雷沃菌属_c561、普雷沃菌属_口腔分类群_306、普雷沃菌属_口腔分类群_317、普雷沃菌属_口腔分类群_473、蒂莫普雷沃菌(prevotella timonensis)、真口普雷沃菌(prevotella_veroralis)和其他革兰氏阴性细菌、以及它们的混合物。
[0080]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸与选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列具有至少85％核苷酸序列同一性。
[0081]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸与选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列具有至少70％核苷酸序列同一性。
[0082]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸与选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列具有至少90％核苷酸序列同一性。
[0083]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199。
[0084]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸含有来自选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列的至少10个连续核苷酸。
[0085]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸含有来自选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列的至少20个连续核苷酸。
[0086]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸含有来自选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列的至少40个连续核苷酸。
[0087]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸含有来自选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列的至少60个连续核苷酸。
[0088]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸含有来自选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列的至少70个连续核苷酸。
[0089]
在本发明中，适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸含有来自选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的序列
的至少80个连续核苷酸。
[0090]
化学改性可将新特征引入到适配体中，诸如与靶标的不同分子相互作用、改善的结合能力、增强的寡核苷酸构象稳定性或增加的核酸酶抗性。在本发明中，所述适配体组合物的所述至少一种寡核苷酸可包含天然或非天然核碱基。天然的核酸碱基为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。非天然核碱基的非限制性示例为次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、硫尿嘧啶、1-甲基次黄嘌呤、6-甲基异喹啉-1-硫酮-2-基、3-甲氧基-2-萘基、5-丙炔基尿嘧啶-1-基、5-甲基胞嘧啶-1-基、2-氨基腺嘌呤-9-基、7-去氮-7-碘腺嘌呤-9-基、7-去氮-7-丙炔基-2-氨基腺嘌呤-9-基、吩噁嗪基、吩噁嗪基-g-clam、溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶以及它们的混合物。
[0091]
寡核苷酸的磷酸酯主链的修饰也可增加对核酸酶消化的抗性。在本发明中，所述寡核苷酸的核苷可通过选自下列的化学基序连接：天然磷酸二酯、手性硫代磷酸酯、手性膦酸甲酯、手性氨基磷酸酯、手性磷酸酯手性三酯、手性硼磷酸酯、手性硒代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、亚甲基甲基亚氨基、3
’‑
酰胺、3’非手性氨基磷酸酯、3’非手性亚甲基膦酸酯、硫甲醛、乙硫醚、氟磷酸酯以及它们的混合物。在本发明中，所述寡核苷酸的核苷可通过天然磷酸二酯连接。
[0092]
在本发明中，所述寡核苷酸的核苷的糖部分可选自：核糖、脱氧核糖、2
’‑
氟脱氧核糖、2
’‑
o-甲基核糖、2
’‑
o-(3-氨基)丙基核糖、2
’‑
o-(2-甲氧基)乙基核糖、2
’‑
o-2-(n,n-二甲基氨基氧)乙基核糖、2
’‑
o-2-[2-(n,n-二甲基氨基)乙氧基]乙基核糖、2
’‑
o-n,n-二甲基乙酰胺基核糖、n-吗啉基膦酰二胺、α-脱氧呋喃核糖基、其他戊糖、己糖以及它们的混合物。
[0093]
在本发明中，所述核糖核苷酸的衍生物或所述脱氧核糖核苷酸的衍生物可选自：锁寡核苷酸、肽寡核苷酸、二醇寡核苷酸、苏阿糖寡核苷酸、己糖醇寡核苷酸、阿卓糖醇寡核苷酸、丁基寡核苷酸、l-核糖核苷酸、阿拉伯糖寡核苷酸、2
’‑
氟阿拉伯糖寡核苷酸、环己烯寡核苷酸、二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸以及它们的混合物。
[0094]
在本发明中，所述至少一种寡核苷酸的5'-端和3'-端的核苷酸可为反向的。在本发明中，所述至少一种寡核苷酸的至少一个核苷酸在戊糖基团的2'位置上被氟化。在本发明中，所述至少一种寡核苷酸的嘧啶核苷酸在所述戊糖基团的所述2'位置上被氟化。在本发明中，所述适配体组合物可包含至少一种聚合物材料，其中所述至少一种聚合物材料共价地连接到所述至少一种寡核苷酸。在本发明中，所述至少一种聚合材料可为聚乙二醇。
[0095]
在本发明中，所述至少一种寡核苷酸的长度可介于约10个核苷酸和约200个核苷酸之间。在本发明中，所述至少一种寡核苷酸的长度可小于约100个核苷酸。在本发明中，所述至少一种寡核苷酸的长度可小于约50个核苷酸。
[0096]
在本发明中，所述至少一种寡核苷酸可共价或非共价地附接到一种或多种治疗和个人护理成分。在本发明中，所述一种或多种治疗和个人护理成分可包括抗真菌剂、抗微生物剂、抗菌剂、凉爽剂、天然提取物、肽、酶、以及它们的混合物中的一种或多种。合适的治疗和个人护理活性成分可包括通常被认为是安全的并且向皮肤、头皮、毛发、口腔粘膜、牙齿或牙龈提供有益效果的任何材料。
[0097]
iii.适配体测定
[0098]
在本发明中，测定可包括使用选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的至少一个序列。
[0099]
在本发明中，在实施方案中，所述测定可为利用选自seq id no 1001至seq id no 1250和seq id no 2001至seq id no 2199的两个或更多个序列的夹心测定。一个序列用作捕获适配体。其他序列用作报告适配体。
[0100]
在一个方面，捕获适配体可锚定到固体表面，例如96孔板或硝酸纤维素膜的表面。在实施方案中，报告适配体可包含适配体和酶、有色分子或生物试剂。所述酶可为辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、酪氨酸酶或激酶。所述有色分子可为颜料、金纳米粒子、荧光化合物或荧光蛋白。报告适配体也可为酶和有色分子的组合，诸如附接到金纳米粒子的酶。
[0101]
本发明还描述了96孔板格式的测定。在该测定中，可使用两个96孔板，一个为结合板，另一个为读数板。将适配体捕获探针锚定到结合96孔板中的孔的底部。该捕获探针可与另一适配体序列杂交，从而通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合将适配体保留在孔的底部。96孔板中的孔的底部表面用链霉抗生物素蛋白官能化。捕获探针用生物素官能化。生物素对链霉抗生物素蛋白具有高亲和力，解离常数为约10
14
摩尔/升。报告分子(诸如辣根过氧化物酶或金纳米粒子)将连接到称为报告探针的另一dna序列。报告探针为共价或非共价地连接到分子或纳米粒子并且与适配体序列互补的dna序列。报告分子可为颜料、荧光染料、酶或荧光蛋白。报告探针可具有与适配体序列互补的dna序列。在96孔板中，捕获探针通过互补碱基配对将适配体保持在96孔板的5'端。捕获探针通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合被栓系到96孔板中的孔的底部。报告探针通过互补碱基配对在其3'端杂交到适配体上。然后在结合缓冲液中制备靶标分子并将其添加到含有捕获探针-适配体-报告探针的复合物的孔中。该靶标分子可为内毒素、外膜囊泡或整个细菌。当靶标分子与适配体结合时，该结合将改变适配体的3-d结构，从而导致报告探针从缔合的适配体解离。解离的报告探针将游离在结合缓冲液中并转移到读数96孔板的孔中。将另一dna序列即报告物-探针-捕获探针或报告捕获探针通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合固定到读数板的底部。报告捕获探针能够通过互补碱基配对退火成报告探针。由于报告探针含有颜料、荧光染料、酶或荧光蛋白，因此可通过读取吸光度或荧光直接进行测量。如果报告物为酶，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶，则添加相对的底物，并进行测量。
[0102]
在实施方案中，本发明还包括侧向流测定。侧向流测定为即时测定的最简单且最常见的格式。典型的侧向流快速测试纤维素条包括简单垫、缀合物释放垫、测试线、对照线和吸收垫。样品垫为其上施加了测试样品的吸收垫。缀合释放垫为其中储存靶标结合适配体、报告探针和对照报告探针的吸收垫。报告探针与靶标结合适配体杂交。当样品中的靶标与靶标结合适配体结合时，报告探针将从靶标结合适配体解离，并且随后附接到测试纤维素条上的测试线。对照报告探针将结合至测试纤维素条上的对照线。样品将迁移到硝酸纤维素膜上，在该膜上固定有捕获探针，该探针以穿过膜的线的形式用作样品中靶标分子的捕获区测试线。
[0103]
如本文所用，术语“捕获探针”意指dna序列、或蛋白质、或可与另一dna序列结合的任何化学物质。例如，捕获探针可与适配体杂交，从而将适配体保留在膜中。
[0104]
如本文所用，术语“报告探针”为共价或非共价地连接到报告物(诸如分子或纳米粒子)的dna序列。该分子例如可为颜料、荧光染料、酶或荧光蛋白。报告探针的dna序列与靶标结合适配体的dna序列互补。报告探针通常在施加样品之前与靶标结合适配体杂交。
[0105]
如本文所用，术语“报告适配体”为共价或非共价地连接到报告物(诸如分子或纳米粒子)的寡核苷酸。该分子例如可为颜料、荧光染料、酶或荧光蛋白。报告适配体的dna序列不同于靶标结合适配体。报告适配体可独立地结合样品中的靶标，诸如内毒素。
[0106]
如本文所用，术语“对照报告探针”为共价或非共价地连接到报告物的dna序列或蛋白质、或任何化学物质。对照报告探针可结合蛋白质、寡核苷酸或任何化学物质。报告物为分子或纳米粒子。该分子例如可为颜料、荧光染料、酶或荧光蛋白。对照报告探针可具有连接到金纳米粒子的dna序列或蛋白质。
[0107]
侧向流测定包括将捕获探针通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合锚定到硝酸纤维素膜的测试线(报告探针或报告适配体将被保持在其上的位置)上，该捕获探针将结合报告探针或报告适配体。报告探针或报告适配体将含有有色分子，诸如金纳米粒子。如果样品中存在靶标分子，诸如内毒素，则报告探针或报告适配体将通过与测试线上的捕获探针结合而被保留。测试线将显示红色，这是样品中存在靶标分子诸如内毒素的指示标识。捕获探针为能够与报告探针或报告适配体结合的寡核苷酸、或蛋白质、或任何化学物质。寡核苷酸捕获探针可与报告探针或报告适配体序列杂交。报告探针是与特定适配体互补的dna序列，该特定适配体可结合靶标分子，诸如内毒素。捕获探针通过互补碱基配对在其5'端结合特定适配体。报告探针通过互补碱基配对在其3'端杂交到适配体上。报告探针-适配体的复合物被容纳在样品垫上，该样品垫为其上施加有测试样品的吸收垫。然后使用一次性带刻度的移液管(vwr international llc,radnor,pa.，目录号16001-192)将100μl至900μl的样品诸如灌洗液或唾液施加到样品垫上。样品含有靶标分子。靶标分子可为内毒素、外膜囊泡或整个细菌。当靶标分子与对靶标分子具有高亲和力的靶标结合适配体结合时，该结合将改变靶标结合适配体的3-d结构，从而导致报告探针从靶标结合适配体解离。解离的报告探针将脱离靶标结合适配体并流向测试线，并与捕获探针结合，该捕获探针通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合而被固定到测试线。捕获探针通过互补碱基配对与报告探针结合。如上所述，报告探针含有染料分子或纳米粒子，可直接使用肉眼或智能电话中的相机进行测量。例如，金纳米粒子在颜色上出现红色-在测试线上将出现可见的红色带。
[0108]
如果样品中不存在靶标，则报告探针将继续与靶标结合适配体缔合并且不能与固定在硝化纤维素条上的测试线中的报告捕获探针结合-在测试线中将不出现红色线。
[0109]
侧向流测定条还包含纤维素膜上的对照线。对照捕获探针固定在纤维素膜上。对照捕获探针为能够与对照报告探针结合的蛋白质、寡核苷酸、或任何化学物质。如本文所用，术语“对照报告探针”为共价或非共价地连接到报告物的dna序列或蛋白质、或任何化学物质。对照报告探针可结合蛋白质、寡核苷酸或任何化学物质。报告物为分子或纳米粒子。该分子例如可为颜料、荧光染料、酶或荧光蛋白。纳米粒子可以是颜色为红色的金纳米粒子。对照报告探针可包括与另一dna序列互补的dna序列以及为金纳米粒子的报告物。对照报告探针可在侧向流测试条的纤维素膜中的对照线处与对照捕获探针结合。
[0110]
在该测定中，对照报告探针也嵌入在缀合释放垫中，该缀合释放垫为其中嵌入靶标结合适配体、报告探针和对照报告物的吸收垫。当样品迁移通过侧向流测试条时，具有金纳米粒子的对照报告探针将在对照线处形成红色带。对照线中红色带的出现表明测定如所设计的那样工作。
[0111]
实施例1-通过对龈上菌斑样品的dna进行元测序来鉴定作为齿龈炎相关细菌的苍
白普雷沃菌
[0112]
为了鉴定与齿龈炎相关的细菌，进行元测序实验。对69名受试者进行随机、平行组临床研究(阴性对照组35名，并且测试方案组34名)。受试者平均年龄为39岁，在20岁至69岁的范围内，并且46％的受试者为女性。处理组平衡良好，因为以下的差异统计学上不显著(p≥0.395)：人口统计学特征(年龄、种族、性别)或齿龈出血指数(gbi)的开始测量值；平均值＝29.957，其中至少有20个出血部位和改良齿龈指数(mgi)；平均值＝2.086。所有六十九名受试者参加了每次访视并完成了研究。在6周的时间内对以下处理组进行比较：测试方案：pro-health clinical plaque control(0.454％氟化亚锡)洁齿剂、具有精密清洁刷头的professional care 1000、和pro-health clean mint(0.07％cpc)漱口水。对照方案：cavity protection(0.243％氟化钠)洁齿剂和indicator soft manual toothbrush。
[0113]
如图1所示，测试方案组在第1、3和6周相对于阴性对照组显示出显著(p《0.0001)更低的平均出血(gbi)和炎症(mgi)。
[0114]
在临床研究的测试方案中，从相同的受试者收集牙菌斑。从牙齿/牙龈界面处用无菌刮匙从每个受试者取出龈上样品，小心避免与口腔软组织接触。从所有可用的天然牙齿(仅上部牙弓)取样菌斑，直至看不到菌斑。取样后，将菌斑置于预先标记(受试者id、样品首字母、访视和日期)的eppendorf管中，该管具有1ml磷酸盐缓冲盐水(sigma,st.louis,mo)和5000个无菌1mm玻璃珠(sigma,st.louis,mo)，并储存在冰上直至收集所有样品。然后将样品转移到-70℃冰箱以用于储存直至进一步处理。使用基因组dna试剂盒(qiagen,germany)按照制造商的说明书从龈上菌斑样品分离基因组dna。在bgi americas corporation(cambridge,ma)处进行元测序。
[0115]
细菌的相对丰度在处理期间发生显著变化(表1)。细菌物种苍白普雷沃菌是丰富的，占基线处总微生物序列的2.79％。其在第1、3和6周因prohealth处理方案而降低。
[0116]
表1：在用prohealth方案处理六周期间龈上菌斑中以百分比计的细菌变化
[0117]
device,downingtown,pa)中在260nm和280nm处读取吸光度。如图2j所示，以od260测量的dna和rna分子漂浮在梯度的顶部。通过od280估计的蛋白质位于dna和rna分子的正下方。几乎所有的内毒素活性都与黄色带即omv相关。对于苍白普雷沃菌和牙龈卟啉单胞菌，omv的尺寸分别在27.9纳米至127纳米和29.5纳米至83.5纳米范围内(图2d)。
[0131]
实施例3-来自牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的分泌型和细菌结合型脂多糖的分离。
[0132]
lps提取：使用程序提取和纯化来自细菌沉淀物和标准外膜囊泡(omv)的脂多糖(lps)，如westphal和jann(bacterial lipopolysaccharides extraction with phenol-water and further applications of the procedure.1965；methods in carbohydrate chemistry,5,83-91)以及darveau和hancock(j bacteriol.1983年8月；155(2):831-8.procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough pseudomonas aeruginosa and salmonella typhimurium strains)所述。简而言之，将细菌沉淀物和omv溶解于300ml缓冲液中，该缓冲液含有10mm tris-cl缓冲液(ph8)、2％十二烷基硫酸钠、2mm mgcl2和40mg蛋白酶k(所有化学品和蛋白酶k均购自sigma,st.louis mo)。
[0133]
将混合物涡旋并置于68℃的培养箱中24小时。添加六十ml的3m乙酸钠(ph5.2)和800ml 100％乙醇，并保持在-20℃处。在beckman coulter(indianapolis,in)的avanti j-26xpi高效离心机中，使用ja-10转子在13000rpm、4℃处沉淀粗制脂多糖60分钟。离心后，将沉淀物悬浮于200ml的20mm三乙胺(2.8ml tea/1000ml)和0.5％脱氧胆酸盐中。添加蛋白酶k(20mg)，并将溶液在65℃处温育24小时。将苯酚-200ml(bioreagent，用10mm tris hcl(ph8.0)、1mm edta平衡，用于分子生物学，购自sigma,st.louis mo)添加到粗制脂多糖溶液中。摇动苯酚和lps溶液以混合水相和苯酚相，并在65℃处加热过夜。然后将混合溶液在冰水中冷却60分钟，并在avanti j-26xpi高效离心机中，使用ja-10转子在13000rpm、4℃处离心60分钟，以分离苯酚和水相。收集水相。添加六十ml的3m乙酸钠(ph5.2)和800ml 100％乙醇，并保持在-20℃处。在avanti j-26xpi高效离心机中，使用ja-10转子在13,000rpm、4℃处沉淀粗制脂多糖60分钟。然后将沉淀的lps重悬于400ml的100mm乙酸钠(ph5.2)中。
[0134]
色谱法纯化：使用疏水相互作用色谱法(sigma,st.louis mo)按照fischer(eur j biochem.，1990年12月12日；194(2):655-61.purification and fractionation of lipopolysaccharide from gram-negative bacteria by hydrophobic interaction chromatography)和muck等人(journal of chromatography b:biomedical sciences and applications，第732卷，第1期，1999年9月10日，第39-46页：biomedical sciences and applications efficient method for preparation of highly purified lipopolysaccharides by hydrophobic interaction chromatography)所述的程序以及使用亲和色谱法(m.sakata,m.todokoro,c.hirayama,american biotechnol.2002；lab.,20:36.m.todokoro,m.sakata,s.matama,m.kunitake,j.ohkuma,c.hirayama,2002；j.liq.chrom.&rel.technol.,25:601)纯化分泌型和细菌结合型lps两者。还按照制造商的说明书(thermofisher scientific,waltham,ma,usa)，使用pierce
tm
lal生色内毒素定量试剂盒分析级分中的内毒素活性。
[0135]
结果：完整的细菌脂多糖为异质的，分子量范围为10kda至20kda，由三种结构组分
组成：a)疏水性脂质部分，脂质a，其负责分子的毒性特性；b)亲水性芯多糖链；以及c)对细菌血清型具有特异性的重复亲水性o-抗原低聚糖侧链。使用如haught、xie、circello、tansky、khambe、sun、lin、sreekrishna、klukowska、huggins和white(am j dent.，2016年12月；29(6):328-332)所述的光谱方法，分离纯化的牙龈卟啉单胞菌脂多糖。
[0136]
用于口腔护理制剂的由抗微生物剂结合的脂多糖和脂磷壁酸：如图3a所示，牙龈卟啉单胞菌的超纯lps制备物(invivogen目录代码tlrl-ppglps，san diego,ca)，显示两个峰。lps制备物在18.67min洗脱时还含有小的峰，其可能是一些无机盐。以一分钟的间隔收集洗脱液，在注入样品后10分钟开始，以考虑从检测器到样品收集出口的流动时间。在每个级分中测量内毒素活性。大部分内毒素活性在级分8至11中，如图3a所示。在我们的实验室中纯化的牙龈卟啉单胞菌的细菌结合型lps显示在光谱分析方面非常类似的图案(图3b和图3d)。主要内毒素活性在级分9至13中。这些结果表明牙龈卟啉单胞菌脂多糖为高度异质的。
[0137]
从培养基中分离的lps(这里称为来自牙龈卟啉单胞菌的分泌型lps)与细菌结合型lps稍有不同，因为从培养基中分离的lps显示出宽的一个峰(图3c和图3e)。纯化的苍白普雷沃菌lps(图3f)和超纯大肠杆菌lps(图3g)(大肠杆菌055:b5，invivogen company,san diego,ca)也含有多个种类。
[0138]
实施例4—开发牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的外膜囊泡和脂多糖的适配体。
[0139]
按照tuerk和gold(science.，1990年8月3日；249(4968):505-10.systematic evolution of ligands by exponential enrichment:rna ligands to bacteriophage t4 dna polymerase)、martin等人(anal.bioanal.chem.，2014年7月；406(19):4637-47.doi:10.1007/s00216-014-7883-8.，电子版2014年6月1日，tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol)以及bharat n.gawande等人(selection of dna aptamers with two modified bases,pnas，2017年3月14日，114(11)2898-2903；2017年3月6日首次公布，https://doi.org/10.1073/pnas.1615475114)所述的程序开发适配体。
[0140]
文库和引物设计和合成：所有引物和核苷酸寡聚物(如下所示)由integrated dna technologies,inc.(skokie,illinois)合成。
[0141]
lps正向引物：gaagtggcttgtgctcctcg
[0142]
lps反向引物：tttacactgcccgtgccagg
[0143]
磷酸化反向引物，5'-(磷酸酯)-tttacactgcccgtgccagg-3'，捕获探针17：5'-生物素-tttacactgcccgtgcc-3’[0144]
捕获探针20：5'-生物素-tttacactgcccgtgccagg-3’[0145]
捕获探针25：5'-生物素-acgaatttacactgcccgtgccagg-3’[0146]
捕获探针30：5'-生物素-actctaagcatttacactgcccgtgccagg-3’[0147]
磷酸化反向引物20：5
′‑
(磷酸酯)-tttacactgcccgtgccagg-3’[0148]
磷酸化反向引物25：5
′‑
(磷酸酯)-acgaatttacactgcccgtgccagg-3’[0149]
磷酸化反向引物30：5
′‑
(磷酸酯)-actctaagcatttacactgcccgtgccagg-3’[0150]
具有40个随机核苷酸gaagtggcttgtgctcctcg-n40-cctggc acgggcagtg taaa的ssdna文库。
[0151]
具有60个随机核苷酸的ssdna文库：gaagtggcttgtgctcctcg-n60-cctggc acgggcagtg taaa-3
′
。
[0152]
从随机寡核苷酸文库中选择适配体：所有程序均在室温处进行。常用的化学品和试剂购自sigma(st.louis mo)。
[0153]
1.捕获探针和ssdna文库的杂交：将ssdna文库与捕获探针17聚体以1:1.5的摩尔比(25nmol ssdna文库:35.5nmol捕获探针)在结合缓冲液(30mm tris(ph7.5)与150mm nacl、1mm mgcl2、1mm cacl2)中混合，在95℃处变性5分钟，然后缓慢冷却至室温(rt)。
[0154]
2.珠粒制备：将珠粒(高效链霉抗生物素蛋白磁性琼脂糖，其具有对生物素》300nmol/ml的结合能力-sigma,st.louis mo)浸泡并在结合缓冲液中洗涤三次，每次5分钟。
[0155]
3.将ssdna文库固定到珠粒：将杂交的ssdna文库和捕获探针转移至50nmol结合容量(120μl)的珠粒(在620μl结合缓冲液中60分钟)。珠粒与ssdna文库的比率为1:2(ssdna文库的摩尔比:珠粒的结合能力＝1:2)。
[0156]
4.去除上清液，然后用1ml结合缓冲液(ph7.5的30mm tris与150mm nacl、1mm mgcl2、1mm cacl2)洗涤5次。
[0157]
5.将lps溶解于1x结合缓冲液中。
[0158]
6.将1:10(文库:lps)lps添加到适配体文库中，然后在结合缓冲液(300μl)中轻轻振荡温育30-60分钟。
[0159]
7.使用磁性板去除磁性琼脂糖珠粒。
[0160]
8.将剩余的溶液用作模板，用于使用taq聚合酶系统(2
×
pcr主混合物，第1碱基)针对dna适配体[95℃5分钟，10至15个循环(94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒)]使用lps正向引物和磷酸化反向引物进行pcr扩增。
[0161]
9.按照制造商的说明书(thermofisher)，使用10单位的λ核酸外切酶进行λ核酸外切酶消化以生成单链dna。
[0162]
10.单链dna适配体库用于下一轮dna selex。
[0163]
在与靶标分子结合时发生构象变化的ssdna的选择：ssdna通过碱基对互补相互作用与捕获探针杂交。相互作用的强度与碱基对的数量成比例。当结合靶标分子时，ssdna发生构象变化，这解开了捕获探针与ssdna之间的碱基对，从而导致ssdna从捕获探针解离，如图4a所示。
[0164]
首先仅用靶标分子选择ssdna，称为阳性选择。如图4b所示，ssdna带逐渐富集。在selex的每一轮中，使用pcr程序扩增所选择的ssdna，并且在琼脂糖凝胶上观察部分pcr产物。ssdna的带在selex 6处为微弱的，但通过四轮selex逐渐增加，并且通过selex 10，带变得清晰可见。
[0165]
使用来自不同物种的细菌材料进行阴性选择。如图4c所示，ssdna带为强的。在selex 22处，首先使来自枯草芽孢杆菌(b.subtilis)的脂磷壁酸(lta)和来自不同细菌物种的lps与ssdna库反应。如果它们与lta lps反应，ssdna将从捕获探针解离，该捕获探针通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合而锚定到磁珠。捕获探针可通过核苷酸互补与ssdna结合。然后用结合缓冲液洗涤通过捕获探针结合ssdna的磁珠，以去除可能对来自不同细菌物种的脂多糖和脂磷壁酸都具有高亲和力的ssdna。然后将剩余的ssdna库再次与1ng至100ng
特定脂多糖一起温育。在图4c中的selex 22处，ssdna带为强的，而lps带为相对弱的。这些结果表明许多ssdna结合lps和lta两者。在四轮阴性选择之后，lps特异性ssdna在selex 25处富集。
[0166]
总共进行36轮selex(表2)。在selex 32处，将omv用作与ssdna反应的靶标。将ssdna与牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌omv一起温育。如果ssdna对omv具有高亲和力，则它们将从捕获探针解离，该捕获探针通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合而锚定到磁珠。从selex17和selex 18中拉出的交叉反应性lps适配体用作可结合来自牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和大肠杆菌的lps的适配体的来源。例如，将来自大肠杆菌lps选择的ssdna与牙龈卟啉单胞菌lps一起温育。如果来自大肠杆菌lps选择的ssdna与牙龈卟啉单胞菌lps结合，则它们将从捕获探针解离，该捕获探针通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合而锚定到磁珠。通过再四轮selex进一步选择selex 17和18交叉反应性适配体库以获得与牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和大肠杆菌内毒素结合的适配体。
[0167]
表2：selex条件和参数。
[0168]
[0169][0170]
实施例5—牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的外膜囊泡和脂多糖的序列和聚类适配体。
[0171]
将适配体样品送至bgi序列服务(cambridge,ma)。对序列进行内部分析。将成对末端读取序列用flash(v1.2.11；flash:fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.，t.magoc和s.salzberg.，bioinformatics 27:21(2011),2957-63)合并。使用fastx_toolkit(v0.0.13；fastx_toolkit：http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html)过滤合并的序列以去除质量评分小于30的任何碱基的序列，接着用cutadapt(v1.16；marcel martin.cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.embnet.journal,17(1):10-12，2011年5月)去除任何长于125个碱基或短于85个碱基的序列。使用fastx toolkit生
成过滤序列的反向互补序列。使用定制的脚本，以5'到3'的方向用正向引物“gtgctcctcg”和反向引物“cacgggcagt”并去除这两个引物之前或之后的任何接头序列来鉴定该序列。用fastaptamer对这些经修剪的序列进行计数和聚类(汉明编辑距离《＝15)，以鉴定富集的适配体。使用muscle(v3.8.31；alam kk,chang jl,burke dh.fastaptamer:a bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections.mol.ther.nucleic acids.，2015年3月3日；4:e230.doi:10.1038/mtna.2015.4；edgar,r.c.muscle:multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.nucleic acids res 32(5),1792-97)生成比对。
[0172]
对十八个适配体样品进行测序，并产生总共256662255个读数(表3)。对样品中具有最少五个读数的适配体进行分析和聚类。每个聚类与聚类中心序列共享85％的序列同一性，这些聚类中心序列在表4、表5、表6、表7、表8和表9中列出。
[0173]
表3：适配体样品中的dna读数。
[0174][0175][0176]
cellufine
tm
etclean-l,jnc corporation,japan.
[0177]
在表4中，250个适配体序列选自250个聚类。每个序列代表聚类中心序列。聚类中心序列来源于样品中特定聚类中具有最高拷贝数的适配体。例如，具有seq id no 1032的
序列来源于在相同样品中测序的具有7个独特适配体的聚类。具有seq id no 1032的序列是聚类中心序列，占百万个序列中69.24个读数。如果任何适配体的序列与聚类中心序列共享85％的核苷酸同一性，则其将属于同一聚类。
[0178]
表4列出了1001至1250的靶向外膜囊泡和lps的适配体。如实施例2中所述，几乎所有分泌的内毒素活性都与苍白普雷沃菌中的外膜囊泡相关。直接检测外膜囊泡是有利的。首先，选择靶向苍白普雷沃菌内毒素的适配体。然后，将外膜囊泡施加到针对苍白普雷沃菌内毒素选择的适配体的混合物。适配体富集以对抗外膜囊泡。因此，这类适配体靶向仅存在于外膜表面上的内毒素。
[0179]
表4列出了靶向大肠杆菌、牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的内毒素和外膜囊泡的1001至1250的适配体。
[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191][0192]
表5列出了被选择为靶向大肠杆菌、牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的外膜囊泡和内毒素的2001至2199的适配体。
[0193]
表5：靶向大肠杆菌、牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的外膜囊泡和内毒素的交叉反应性适配体
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202]
[0203][0204]
实施例6—适配体2d结构预测
[0205]
使用rna结构版本6.0.1网络服务以默认参数预测适配体二级结构(https://rna.urmc.rochester.edu/rnastructureweb/servers/predict1/predict1.html,reuter,j.s.,&mathews,d.h.rna structure:software for rna secondary structure prediction and analysis.bmc bioinformatics.2010；11:129)。rna结构折叠结果预测最低自由能结构。rna结构maxexpect结果生成由高度可能的碱基对组成的结构。这是可在结构预测中具有更高保真度的用于结构预测的另选方法。rna结构probknot结果预测可能碱基对的二级结构，其可包括假结。预测的2d结果示于图5a至图5j中。
[0206]
实施例7.实验室测试以测量口腔样品中牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的外膜囊泡和脂多糖的丰度。
[0207]
将适配体缀合至功能分子以开发灵敏测定。如图6a所示，适配体与淬灭剂连接，如果将淬灭剂和荧光分子两者邻近放置，则淬灭剂可降低荧光分子的强度。在该测定中，荧光分子缀合至报告探针(荧光报告探针，5'-荧光团-gaaccactctaagcatttacactgcccgtgccagg-3'；或5’cgaggagcacaagccacttctttttt-3
’‑
荧光团)，其具有与靶标结合适配体的3'-端或靶标结合适配体的5'端互补的序列。荧光报告探针或荧光适配体探针包括寡核苷酸和荧光染料或荧光团分子。
[0208]
在不存在靶向的内毒素的情况下，荧光报告探针与含有淬灭由荧光报告探针释放的荧光的官能团的靶标结合适配体的3'-端杂交。因此，未检测到荧光。在与靶向的内毒素结合时，靶标结合适配体发生构象变化，从而导致与荧光报告探针解离，由此增加靶标结合适配体中的淬灭基团与报告探针中的荧光分子之间的距离。在没有淬灭基团干扰的情况下，在吸收特定波长的电磁辐射时可检测到荧光。
[0209]
如本文所用，淬灭剂包括但不限于black hole 1、black hole 2、iowa fq、iowa rq-sp、dabcyl、以及它们的混合物。
[0210]
如本文所用，荧光分子或荧光团包括但不限于6-fam
tm
、alexa 488、alexa 532、alexa 594、alexa 647、alexa 660、alexa 750、alexa 546、atto
tm
488、atto
tm
532、atto
tm
550、以及它们的混合物。荧光团通常含有若干组合的芳族基团，或具有若干π键的平面分子或环状分子。它们在吸收特定波长的光或电
磁辐射之后发出光或荧光。荧光团可直接缀合至适配体或其他寡核苷酸。
[0211]
如本文所用，术语“荧光报告探针”或“荧光报告适配体”为共价或非共价地连接到荧光团的寡核苷酸分子或蛋白质或任何化学物质。
[0212]
如本文所用，术语“酶报告探针”或“酶报告适配体”为共价或非共价地连接到酶的寡核苷酸分子或蛋白质或任何化学物质。
[0213]
还采用酶来测定口腔样品中内毒素的丰度(图6b)。酶缀合至寡核苷酸(酶报告探针)。在该测定系统中，首先使靶标结合适配体与酶报告探针在其3'端杂交，并与捕获探针在其5'端杂交，从而形成含有捕获探针、靶标结合适配体和酶报告探针的复合物。通过捕获探针将复合物通过生物素和链霉抗生物素蛋白结合锚定到96孔板的底部。酶报告探针在与内毒素结合时由于构象变化而从靶标结合适配体解离。随后，酶报告探针从捕获探针、适配体和酶报告探针的复合物释放到96孔板的孔中的溶液中。将该溶液转移到新鲜的96孔板中。添加酶底物，并且生成酶产物，并在spectramax id3光谱仪读取器(molecular device,downingtown,pa)的光谱仪中定量。
[0214]
如本文所用，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、以及它们的混合物。
[0215]
如本文所用，酶底物包括但不限于比色底物、荧光底物或化学发光底物。
[0216]
实施例8—半定量口腔样品中牙龈卟啉单胞菌和苍白普雷沃菌的外膜泡囊和脂多糖丰度的即时测试
[0217]
正在开发多种测试以检测和半定量口腔样品中牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和其他革兰氏阴性细菌的外膜囊泡和脂多糖的量。侧向流测定为简单的纸质装置，其可测量液体样品中靶标分析物的存在(或不存在)而无需专门的和昂贵的设备，并且可由消费者直接使用。侧向流测定通常由硝酸纤维素膜、样品垫、缀合物垫、芯吸或吸收垫和背衬垫组成(图7a)。
[0218]
1.样品垫：样品垫充当海绵并保持过量的样品流体。一旦施加，流体就迁移到缀合物垫。其由纤维素和/或玻璃纤维(纤维素纤维样品垫条，millipore-sigma,st.louis,mo)组成。
[0219]
2.缀合物垫：该垫储存反应试剂。缀合物垫的纤维在重悬于移动液体样品中时释放标记的缀合物。使用玻璃纤维、纤维素、聚酯和一些其他材料制备用于侧向流测定的缀合物垫。例如，玻璃纤维缀合物垫条(millipore sigma,st.louis,mo)用于侧向流测定。该垫含有至少两种试剂：a)一种针对牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌或任何革兰氏阴性细菌的内毒素的适配体，其已缀合至信号分子或报告物诸如有色材料或荧光分子或酶，b)反应缓冲液组分，其含有保证适配体与内毒素之间最佳化学反应的一切物质，诸如20mm tris-hcl ph 7.4、140mm nacl、5mm kcl、1mm mgcl2和1mm cacl2、1％胎儿护理血清。有色材料可为金纳米粒子或用于信号增强的金纳米粒子改性的纳米材料、碳纳米粒子或胶态硒纳米粒子。在另一个实施方案中，缀合垫中包含一种或多种dna寡核苷酸。该dna寡核苷酸具有与适配体序列的部分互补的序列，诸如5'-acgaatttacactgcccgtgccagg-3'，其缀合至报告分子，包括但不限于有色材料或荧光分子或酶。此外，该dna寡核苷酸还缀合至接头分子，包括但不限于生物素、蛋白a、蛋白g、抗体、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。在一个另外的实施方案中，适配体缀合至报告分子和接头分子。接头分子包括但不限于生物素、蛋白a、蛋白g、
抗体、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。报告分子为有色材料或荧光分子或酶。
[0220]
3.硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜可购自不同的供应商。在该膜片上绘制测试和对照线；因此，理想的膜应提供对捕获分子的支持和良好结合，该捕获分子包括但不限于适配体、抗体、生物素、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白a或蛋白g。ge healthcare life sciences发布了一种新型的whatman快速流动、高性能(ff hp)硝化纤维背衬膜，其用于许多侧向流装置中。millipore-sigma也销售hi-flow
tm
plus侧向流膜卡。在纤维素膜中，制备了两条或更多条捕获分子或吸收分子。纸质装置具有其中固定捕获分子的一个或多个区域或线。根据测定格式(夹心测定或竞争性测定)，施加不同的捕获分子。在夹心测定格式的一个实施方案中，固定在测试线中的是另一种适配体(捕获适配体)，其在一个位点结合靶标内毒素、靶标外膜囊泡或靶标细菌。与报告分子缀合并储存在装置中的缀合物垫中的报告适配体结合靶标内毒素、靶标外膜囊泡和靶标细菌的另一侧。如果样品中存在靶标内毒素、靶标外膜囊泡或靶标细菌，则报告适配体将与这些靶标结合。当靶标-报告物-适配体复合物从缀合垫迁移至测试线时，其结合测试捕获适配体。如果报告分子为金纳米粒子，则在测试线上将出现红线。如果样品中没有靶标内毒素、靶标外膜囊泡或靶标细菌，则报告物-适配体将迁移超过测试线，并结合对照线中的另一捕获分子，称为对照捕获分子。对照捕获分子为dna寡核苷酸、抗体、蛋白a、蛋白g、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。报告适配体含有另一接头分子，诸如抗体或生物素。对照捕获分子可与流过对照线的任何报告适配体结合。在竞争性测定的一个实施方案中，固定在测试线中的为靶标内毒素、靶标内毒素或靶标细菌。如果它们存在于样品中，则靶标内毒素、靶标外膜囊泡将与报告适配体结合。因此，报告适配体在测试时间内不能结合靶标内毒素、靶标外膜囊泡或靶标细菌。如果样品中没有靶标，则报告适配体将结合靶标内毒素、靶标外膜囊泡或靶标细菌。如果报告分子为金纳米粒子，则将出现红线。
[0221]
4.芯吸或吸收垫：吸收垫：它用作条的端部处的槽。它还有助于保持膜上的液体的流速，并阻止样品的回流。保持液体的吸收能力可在测定结果中起重要作用。该垫简单地用作废物容器。在通过这些反应区之后，流体进入最终的多孔材料，即芯吸垫。
[0222]
侧向流测定用于检测一个或多个靶标。在图7b中，仅检测到一种类型的来自一种细菌物种的内毒素或外膜囊泡。例如，齿龈卟啉单胞菌内毒素的一种或两种适配体缀合至报告分子诸如金纳米粒子。将牙龈卟啉单胞菌内毒素的另外一种或两种适配体在靶标线处固定到硝酸纤维素膜上。在对照中，将另外的寡核苷酸固定到对照区域上。该寡核苷酸可与报告物缀合的适配体结合。这种类型的装置仅能检测一种生物标志物。
[0223]
测定实施例1：在此给出了以抗体作为捕获分子的夹心测定的示例。
[0224]
在缀合物垫中：将具有5'-actctaagcatttacactgcccgtgccagg-3'序列的dna寡核苷酸与金纳米粒子缀合。金纳米粒子含有可结合抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的生物素分子。报告dna寡核苷酸可在其3'-端处与适配体诸如具有seq no 1201 5
’‑
aataatatatctctagaacattaaatatcattttcatatatttaaagtatatcataataacctggcacgggcagtg-3’的适配体杂交。该适配体缀合至以高亲和力结合蛋白g的兔免疫球蛋白g。
[0225]
在测试线中：细菌蛋白g被固定在测试线上。蛋白g可结合任何免疫球蛋白g。
[0226]
在对照线中：链霉抗生物素蛋白被固定在对照线上。它可结合生物素。
[0227]
在样品施加之前，在测试或对照中不存在红色线，如图7b的b-i所示。当施加样品
生物素复合物中的生物素结合。
[0238]
在样品施加之前，在测试或对照中不存在红线，如图7d的d-i所示。当施加样品时，靶标内毒素将结合缀合物垫中的适配体。适配体中的结合位点被占据。当样品混合物迁移至测试线时，金纳米粒子-适配体-内毒素复合物不能结合固定到检测线的内毒素。如图7d的d-ii所示，在测试线中将不会出现红线。随着金纳米粒子-适配体-内毒素复合物迁移至对照线，金纳米粒子-适配体-内毒素复合物中的生物素将与对照线中的链霉抗生物素蛋白结合。如图7d的d-ii所示，在对照线中出现红线。
[0239]
如果样品中不存在靶标内毒素，则金纳米粒子-适配体-生物素的一些复合物将结合靶标内毒素，在测试线中将出现红线。略微过量的金纳米粒子-适配体-生物素迁移超过测试线并与对照线中的链霉抗生物素蛋白结合。如图7d的d-iii所示，在测试线和对照线两者中出现红线。
[0240]
多路侧向流测定或多路即时监测：在一个装置中，可检测一种、两种或更多种内毒素、外膜囊泡或细菌，如图7e所示。
[0241]
正在创建消费者诊断试剂盒。
[0242]
a.一种消费者诊断试剂盒，所述消费者诊断试剂盒可检测口腔样品中的牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和革兰氏阴性细菌的内毒素。
[0243]
b.一种消费者诊断试剂盒，所述消费者诊断试剂盒可检测口腔样品中的牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和革兰氏阴性细菌的外膜囊泡。
[0244]
c.根据段落a所述的消费者诊断试剂盒，其中所述消费者诊断试剂盒用于测定口腔样品中牙龈卟啉单胞菌、苍白普雷沃菌和革兰氏阴性细菌的丰度。
[0245]
d.根据段落a、b和c所述的消费者诊断试剂盒，其中所述革兰氏阴性细菌包括但不限于革兰氏阴性球菌、肠杆菌(enterobacter)、梭杆菌(fusobacterium)、嗜血杆菌(haemophilus)、钩毛菌(leptotrichia)、奈瑟氏球菌(neisseria)、卟啉单胞菌、普雷沃菌、罗氏菌(rothia)、沙雷氏菌(serratia)、韦荣球菌(vellionella)、大肠杆菌、沙门氏菌(salmonella)和志贺氏菌(shigella)。
[0246]
e.根据段落a、b、c和d所述的消费者诊断试剂盒，其中所述消费者诊断试剂盒为诊断工具或仪器。
[0247]
f.根据段落a至d所述的消费者诊断试剂盒，其中使用基于适配体的侧向流测定来检测内毒素。
[0248]
g.根据段落a至d所述的消费者诊断试剂盒，其中使用基于适配体的侧向流测定来检测外膜囊泡。
[0249]
h.根据段落a至d所述的消费者诊断试剂盒，其中使用基于适配体的侧向流测定来检测革兰氏阴性细菌的丰度。
[0250]
i.根据段落f至h所述的消费者诊断试剂盒，其中所述基于适配体的侧向流测定包括适配体中seq id no 1001至seq id no 1250至seq id no 2001至seq id no 2199中的序列中的一种或多种。
[0251]
j.根据段落f至h所述的消费者诊断试剂盒，其中所述基于适配体的侧向流测定包括与seq id no 1001至seq id no 1250至seq id no 2001至seq id no 2199共享85％或更高序列同一性的序列中的一种或多种。
[0252]
k.根据段落a至j所述的消费者诊断试剂盒，其中所述基于适配体的侧向流测定包括但不限于毛细流动层、硝酸纤维素膜、样品施加垫、缀合物垫、测试线、对照线和吸收垫。
[0253]
l.根据段落a至j所述的消费者诊断试剂盒，其中所述基于适配体的侧向流测定包括但不限于读出报告分子、流动相缓冲液、所述测试线处的生物分子和所述对照线处的另一种生物分子。
[0254]
m.根据段落a至j所述的消费者诊断试剂盒，其中所述基于适配体的侧向流测定包括但不限于适配体官能化金纳米粒子、硫醇化适配体、盐缓冲液和链霉抗生物素蛋白-生物素化试剂。
[0255]
n.根据段落a至j所述的消费者诊断试剂盒，其中所述基于适配体的测定包括侧向流测定、96孔溶液测定和电化学测定。
[0256]
o.根据段落a至j所述的消费者诊断试剂盒，其中所述基于适配体的侧向流测定包括但不限于夹心测定(使用一对适配体的夹心测定、使用适配体和抗体的组合的夹心测定、以及使用分裂适配体的夹心测定)、竞争性测定(溶液中的靶标分析物与固定在膜上的靶标分析物之间的竞争性测定、溶液中的靶标分析物与互补dna探针之间的竞争性测定)和置换测定。
[0257]
p.根据段落l至o所述的消费者诊断试剂盒，其中所述读出报告物包括但不限于官能化金纳米粒子、具有有色分子或荧光分子的官能化硅纳米粒子、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
[0258]
q.根据段落l至o所述的消费者诊断试剂盒，其中通过等温扩增技术来扩增测定信号，所述等温扩增技术包括组合聚合酶扩增、环介导扩增、指数扩增反应、链置换扩增、滚环扩增、基于核酸序列的扩增和解旋酶依赖性扩增。
[0259]
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
[0260]
除非明确排除或以其他方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本技术对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
[0261]
虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其他变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。