一种生物样品的预处理方法与流程

1.本发明涉及医学检验分析技术领域，具体是指一种生物样品的预处理方法。


背景技术：

2.近年来，农药中毒、药物中毒、食物中毒的事件屡有发生，危害广大人民群众的生命健康。当有人出现中毒送医时，通常需要采集患者的血样、呕吐物、尿液、粪便等生物样品，并对生物样品进行预处理后再对中毒物质进行定性定量分析。现有的生物样品的预处理方法主要有：萃取法、蛋白沉淀法和固相萃取小柱法。上述方法在对生物样品进行预处理时会存在一些问题：
3.萃取法采用在血浆或尿液中直接加入与之不相溶的有机溶剂，如乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等，利用样品在有机溶剂中溶解度更大的原理，将待检测样品从血浆或尿液中萃取到有机溶剂中，再挥发有机溶剂，达到去除杂质富集样品的目的。萃取法虽然操作简单，适用于极性较小的化合物，但对易溶于水的化合物不太适用。
4.蛋白沉淀法是在血浆样品中加入一定量的与水能互溶的有机溶剂，使血浆中的蛋白质沉淀，通过离心除去蛋白，待检测化合物溶解于有机溶剂中，再进行检测。加入的有机溶剂通常是乙腈、甲醇等。影响蛋白沉淀法效果的因素主要有两个：待测物质与血浆蛋白结合的紧密程度和待测物质在使用的有机溶剂中的溶解度。当待测物质与血浆蛋白结合较紧密时，或当待测物质的溶解度较低时，样品预处理会造成待测物质的损失。
5.固相萃取小柱是近年来应用较广的一种样品预处理方法，其本质是利用各种不同性质的固体填料，将待测化合物吸附，使之与蛋白等杂质分离，从而达到富集化合物，除去影响检测的杂质的目的。但是，固相萃取小柱的填料类型较多，需要根据目标化合物的性质进行筛选，不适合广谱的筛查。
6.逆流色谱是一种基于液-液连续萃取的分离技术，利用样品在两相溶剂体系中的分配系数不同而达到分离效果。现阶段逆流色谱主要应用于天然产物或者合成化合物的分离纯化。由于逆流色谱法避免了可能有死吸附的固体填料，所以具有回收率高的特点，这一特点适合天然生物样品的预处理，目前还未看到有将血样、呕吐物、尿液采用逆流色谱法进行预处理的相关报道，因此本发明提供一种基于逆流色谱法来对血样、呕吐物、尿液进行预处理的方法来解决上述萃取法、蛋白沉淀法和固相萃取小柱法所存在的问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于解决上述问题，提供一种够适用于大范围检测，并且毒物回收效率高的生物样品预处理方法。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种生物样品的预处理方法，包括以下步骤：
9.步骤1：配制洗脱溶剂体系，并将上相和下相分装待用；其中任意一相作为流动相，另一相作为固定相；所述洗脱溶剂体系包括至少2种组合后能形成互不相溶的两相溶液的
溶剂；
10.步骤2：采集血液、尿液或呕吐物；
11.步骤3：将固定相、流动相以及步骤2中的采集物通入逆流色谱仪进行洗脱，收集洗脱液。
12.进一步的，步骤2中还包括对采集物进行离心，提取上层液体；步骤3则将固定相、流动相以及上层液体通入逆流色谱仪进行洗脱，收集洗脱液。
13.步骤3之后还包括以下步骤：将洗脱液浓缩至干，得到供试样品。
14.步骤1中所述的溶剂包括正己烷、正庚烷、正戊烷、环己烷、氯仿、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、甲苯、苯甲醇、甲醇、正丁醇、异丁醇、正丙醇、四氢呋喃、乙醇、乙二醇、乙酸、甲酸、水。
15.所述步骤3中的洗脱包括以下步骤：
16.a、将固定相注满逆流色谱仪的管路，并启动逆流色谱仪；
17.b、向逆流色谱仪的管路中注入流动相，直至固定相和流动相达到两相平衡；
18.c、保持通入流动相，并向逆流色谱仪的管路中注入待处理样品，收集洗脱液。
19.所述步骤3中的洗脱包括以下步骤：
20.a、将固定相注满逆流色谱仪的管路，并启动逆流色谱仪；
21.b、将流动相和待处理样品同时注入逆流色谱仪的管路，收集洗脱液。
22.所述逆流色谱仪的转速为200～5000r/min；所述流动相和待测样品的流速为0.1～10ml/min。
23.所述洗脱溶剂体系中的溶剂为正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水。
24.所述洗脱溶剂体系中的溶剂为正己烷、甲基叔丁基醚、甲醇以及水。
25.所述洗脱溶剂体系中的溶剂为二氯甲烷、甲醇、水。
26.本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：本发明可以适用于更多种类的毒物，扩大应用场景；另外，采用本发明的预处理方法，可能提高样品中毒物的回收率，利于后续对有毒物质的定性定量分析。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
28.实施例1
29.本实施例公开一种生物样品的预处理方法，包括以下步骤：
30.首先配制预处理用的洗脱溶剂体系，本实施例的洗脱溶剂体系选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为5:2:5:2。配制时，将上述试剂按体积比例配制成1l溶剂体系溶液，并采用超声波去除溶剂体系溶液里的气泡，反复摇振，直至溶剂体系充分均匀混合，并分层，静置后将上相和下相分装待用。本实施例中将上相作为流动相，下相作为固定相；当然，实际操作时也可将上相作为固定相，下相作为流动相。
31.采集血液、尿液或呕吐物，本实施例中采集的是血液样品。采集到血液样品后，需要对血液样品进行初步的提取，具体是，将血液样品做离心处理，提取上层液体作为待处理样品；其中，离心处理的转速为3500rpm，时间为10分钟。当然，也可以采集患者的尿液或呕吐物，如果采集的是血液或呕吐物，则需要对采集物进行离心处理，提取上层液体；如果采
集的是尿液，则无需对尿液进行离心处理，可直接进样。
32.洗脱溶剂体系和待处理样品都准备好后，将固定相以流速为10ml/min恒定注入逆流色谱仪管路中，直至固定相注满管路。启动逆流色谱仪，调整逆流色谱仪的转速为200～5000r/min，具体转速可设置为1000r/min或2000r/min或1450r/min，本实施例设置为1450r/min。
33.接下来，将流动相注入逆流色谱仪的管路中，直至流出液中没有固定相被挤出，此时固定相和流动相达到两相平衡。其中，流动相的流速为0.1～10ml/min，具体可设置为0.1ml/min、2ml/min或10ml/min，本实施例流动相注入的流速设置为2ml/min。
34.达到两相平衡后，继续通入流动相，同时将待处理样品注入逆流色谱仪的管路中，收集洗脱液。该待测样品的注入流速为0.1～10ml/min，具体可设置为0.1ml/min、2ml/min或10ml/min，本实施例设置为2ml/min。
35.后续可采用液相色谱-串联质谱检验方法来分析洗脱液中所含的毒物。当然，为了提高分析准确度，还可对洗脱液浓缩至干后再进行分析。
36.以下采用本实施例的预处理方法来处理含有溴敌隆和毒鼠强的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0037][0038]
实施例2
[0039]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例在洗脱程序中，当固定相注满逆流色谱仪管路后，同时注入流动相和待处理样品，并收集洗脱液。
[0040]
实施例3
[0041]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为正己烷-甲基叔丁基醚-甲醇-水体系，正己烷、甲基叔丁基醚、甲醇、水的体积比为1:5:1:5。
[0042]
采用本实施例的预处理方法来处理含有杀鼠酮的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0043]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率95.2％96.4％98.3％。
[0044]
实施例4
[0045]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为正己烷-甲基叔丁基醚-乙腈-水体系，正己烷-甲基叔丁基醚-乙腈-水的体积比为4:6:4:6。
[0046]
采用本实施例的预处理方法来处理含有厚朴酚的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0047]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率86.2％87.4％87.9％。
[0048]
实施例5
[0049]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为正己烷-甲醇-水体系，正己烷、甲醇、水的体积比为35:30:3。
[0050]
采用本实施例的预处理方法来处理含有克灭鼠的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0051]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率85.2％86.5％84.3％。
[0052]
实施例6
[0053]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为甲基叔丁基醚-乙腈-水体系，甲基叔丁基醚-乙腈-水的体积比为7:3:10。
[0054]
采用本实施例的预处理方法来处理含有华法林的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0055]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率85.3％83.2％86.2％。
[0056]
实施例7
[0057]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水体系，乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比为6:4:10。
[0058]
采用本实施例的预处理方法来处理含有草甘膦的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0059]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率82.3％76.8％80.9％。
[0060]
实施例8
[0061]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为二氯甲烷-甲醇-水体系，二氯甲烷、甲醇、水的体积比为10:2:8。
[0062]
采用本实施例的预处理方法来处理含有百草枯的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0063]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率88.7％85.9％90.4％。
[0064]
实施例9
[0065]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为氯仿-甲醇-水体系，氯仿、甲醇、水的体积比为10:1:9。
[0066]
采用本实施例的预处理方法来处理含有敌敌畏的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0067]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率96.5％89.4％89.5％。
[0068]
实施例10
[0069]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为正丁醇-乙酸-水体系，正丁醇、乙酸、水的体积比为5:1:4。
[0070]
采用本实施例的预处理方法来处理含有毒鼠磷的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0071]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率87.4％82.5％86.5％。
[0072]
实施例11
[0073]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例的洗脱溶剂体系为正己烷-乙腈-水体系，正己烷、乙腈、水的体积比为5:1:4。
[0074]
采用本实施例的预处理方法来处理含有离敌鼠的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0075]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率66.5％68.4％69.5％。
[0076]
实施例12
[0077]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例采集的是呕吐物，本实施例的洗脱溶剂体系为正丁醇-乙酸-水体系，正丁醇、乙酸、水的体积比为5:1:4。
[0078]
采用本实施例的预处理方法来处理含有毒鼠磷的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0079]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率85.3％85.5％83.4％。
[0080]
实施例13
[0081]
本实施例与实施例1基本相同，其不同点在于，本实施例采集的是患者的尿液，本实施例不需要对尿液进行离心，本实施例的洗脱溶剂体系为正丁醇-乙酸-水体系，正丁醇、乙酸、水的体积比为5:1:4。
[0082]
采用本实施例的预处理方法来处理含有毒鼠磷的血液样品，其中，检出限和定量下限分别是1ng/ml和3ng/ml，线性范围3-1000ng/ml。预处理后的毒物回收率数据如下：
[0083]
血液样品中毒物浓度10ng/ml100ng/ml800ng/ml毒物回收率82.6％79.8％80.5％。
[0084]
由上述实施例可看出，本发明采用逆流色谱法结合不同的洗脱溶剂体系能够回收更多种类的毒物，适用性更强，并且毒物的回收率能够达到65％以上。
[0085]
如上所述，便可很好的实现本发明。