寡核苷酸合成中使用的多氟嵌段聚体以及使用其的寡核苷酸合成方法与流程

1.本发明涉及寡核苷酸合成中的多氟嵌段聚体(multi-fluorous blockmer)以及使用其的寡核苷酸合成方法。


背景技术：

2.近年来，对于以天然型或修饰寡核苷酸为基础骨架的核酸医药的关注度提高。为了得到按照可以得到目的作用的方式设计的核酸医药，广泛使用化学合成法。
3.作为化学合成法之一，众所周知较短链的寡核苷酸合成中使用的在液相中进行全部反应的液相合成法。最近，正在尝试在该液相合成法中应用氟标记(亲氟碳性的取代基)(专利文献1、专利文献2)。现有技术文献专利文献
4.专利文献1：国际公开第2005/070859号，专利文献2：国际公开第2017/086397号。


技术实现要素：

发明要解决的课题
5.通用的液相合成法中，即使为了合成较短链的寡核苷酸，也需要例如酰胺(amidite)与核苷的偶联反应、为了得到接下来的反应基点的脱保护反应等几十道工序的反应。在如此多的工序中，需要使用柱色谱等进行提纯。提纯在很多情况下繁杂，因此不容易利用通用的液相合成法合成大量寡核苷酸。
6.另外，专利文献1、专利文献2等中使用的氟标记的结构复杂，不容易获得，因此成本也变高。
7.本发明鉴于这样的情况而完成，目的在于提供一种使用容易获得的氟标记、能够减小提纯负荷的、寡核苷酸合成中使用的多氟嵌段聚体以及使用其的寡核苷酸合成方法。解决课题的方法
8.为了解决上述课题，本发明的寡核苷酸合成中使用的多氟嵌段聚体和使用其的寡核苷酸合成方法采用以下的手段。本发明的第1方式是由下述式(i)表示的核苷保护体，【化学式1】
上述式(i)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1、r2独立地为h或在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。
9.本发明的第2方式是由下述式(ii)表示的5
′‑
末端保护核苷亚磷酰胺，【化学式2】上述式(ii)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；r3为磷酸保护基、优选为ch2ch2cn、ch2ch＝ch2、och3、或ch2(ch2)
x
yg，y为nh或s，g为烯丙基或酰基，x为0～3，或者r3与键合于与磷原子键合的氮原子的r4的一个键合而形成环；r4为取代或未取代的脂肪族基、取代或未取代的芳香族基；f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。
10.本发明的第3方式是由下述式(iii)表示的氟嵌段聚体酰胺(fluorous blockmer amidite)。【化学式3】
11.上述式(iii)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；r3为磷酸保护基，优选为ch2ch2cn、ch2ch＝ch2、och3、或ch2(ch2)
t
rg，r为nh或s，g为烯丙基或酰基，t为0～3，或者r3与键合于与形成酰胺部分的磷原子键合的氮原子的r5的一个键合而形成环；r5为取代或未取代的脂肪族基、取代或未取代的芳香族基；pro为无保护、核苷碱基的保护基或f-protector，f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；x为o或s；p为0～27的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。由上述式(iii)表示的氟嵌段聚体酰胺在pro或r1、r3中的任一个中，具有至少一个f-protector。
12.本发明的第4方式是由下述式(iv)表示的多氟嵌段聚体。【化学式4】
13.上述式(iv)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；r3为磷酸的保护基，优选为ch2ch2cn、ch2ch＝ch2、och3、或ch2(ch2)
t
rg，r为nh或s，g为烯丙基或酰基，t为0～3；pro为无保护、核苷碱基的保护基或f-protector，f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；x为o或s；l为0至58的整数；r7为(c＝o)(ch2)2(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3或甲硅烷基类保护基，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。由上述式(iv)表示的多氟嵌段聚体在pro或r1、r3中的任一个中，具有至少一个f-protector。
14.本发明的第5方式是由上述式(iv)表示的多氟嵌段聚体的合成方法，其包括使由上述式(iii)表示的氟嵌段聚体酰胺或由下述式(ii
′
)表示的5
′‑
末端保护核苷h-膦酸酯、与由下述式(v)表示的在3
′‑
末端键合有氟锚的核苷发生偶联反应的工序。下述式(ii
′
)和式(v)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。【化学式5】【化学式6】发明效果
15.根据使用本发明的对碱基部分进行了氟保护的核苷、对碱基部分进行了氟保护的5
′‑
末端保护核苷亚磷酰胺、以及多氟嵌段聚体来合成寡核苷酸的方法，通过调整氟锚的结构与其导入数，能够降低寡核苷酸合成的中间体的溶解性、提纯负荷。由此，能够利用通用性更高的方法合成寡核苷酸。
附图说明
16.图1为表示通过本发明的实施例得到的化合物6的esi-tof质谱的图。图2为表示通过本发明的实施例得到的化合物8的esi-tof质谱的图。图3为表示通过本发明的实施例得到的化合物15的uplc色谱的图。图4为表示通过本发明的实施例得到的化合物15的esi-tof质谱的图。图5为表示通过本发明的实施例得到的化合物22的uplc色谱的图。图6为表示通过本发明的合成方法合成的20聚物的色谱、和利用以往方法合成的20聚物的色谱的图。
具体实施方式
17.以下，对本发明涉及的寡核苷酸合成中使用的多氟嵌段聚体以及使用其的寡核苷酸合成方法的实施方式进行说明。
18.第1实施方式中的核苷保护体具有由下述式(i)表示的结构。【化学式7】
19.上述式(i)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1、r2独立地为h或在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。作为z-y键的例子，可举出取代或无取代的c2～c6亚烷基、-s-、-co-、-cs-、-coo-、-oconr
6-(r6为h或c1～c6烷基)、-conr
6-、-csnr
6-等。
20.上述式(i)所述的核苷保护体可以通过如下方式合成：(1)在保护了3
′
，5
′‑
羟基的核苷的碱基部分，使市售的氟醇反应来保护碱基，(2)对由(1)得到的化合物的3
′
，5
′‑
羟基的保护基进行脱保护。
21.上述式(i)记载的核苷保护体中，碱基部分的保护可以通过使用市售的氟醇，应用光延反应或使用苯磺酰氯的反应来进行。本实施方式中，可以使用1h，1h，2h，2h-九氟-1-己醇、1h，1h，2h，2h-十三氟-1-辛醇、1h，1h-十五氟-1-辛醇等。由于可以使用市售的氟醇，与以往方法相比，能够更简便且以低成本合成上述式(i)记载的核苷保护体。作为导入了f-protector的核苷衍生物的具体例，可举出以下的化合物。【化学式8】
22.第2实施方式是由下述式(ii)表示的5
′‑
末端保护核苷亚磷酰胺。【化学式9】上述式(ii)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；r3为磷酸保护基，优选为ch2ch2cn、ch2ch＝ch2、och3或ch2(ch2)
x
yg，y为nh或s，g为烯丙基或酰基，x为0～3，或者r3与键合于与磷原子键合的氮原子的r4的一个键合而形成环；r4为取代或未取代的脂肪族基、取代或未取代的芳香族基；f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。z-y键的例子与由上述式(i)表示的化合物同样。
23.上述式(ii)记载的3
′‑
亚磷酰胺可以通过以下方式合成：(1)利用公知的方法选择性地保护由上述式(i)表示的3
′
，5
′‑
无保护核苷的5
′‑
羟基，(2)使ncch2ch2op[n(i-c3h7)2]2、ch2＝chch2op[n(i-c3h7)2]2等3价的磷酸化剂与由(1)得到的5
′‑
保护3
′‑
无保护核苷反应。工序(2)能够利用公知的方法进行。
[0024]
第3实施方式是由下述式(iii)表示的氟嵌段聚体酰胺。【化学式10】
[0025]
上述式(iii)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；r3为磷酸保护基，优选为ch2ch2cn、ch2ch＝ch2、och3、或ch2(ch2)
x
yg，y为nh或s，g为烯丙基或酰基，x为0～3，或者r3与键合于与磷原子键合的氮原子的r5的一个键合而形成环；r5为取代或未取代的脂肪族基、取代或未取代的芳香族基；pro为无保护、核苷碱基的保护基或f-protector，f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；p为0～27的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。z-y键的例子与由上述式(i)表示的化合物同样。由上述式(iii)表示的氟嵌段聚体酰胺在pro或r1、r3中的任一个中，具有至少一个f-protector。本说明书中嵌段聚体(blockmer)是指2聚物以上的核苷酸，是通过与酰胺(amidite)、3
′‑
或5
′‑
羟基无保护的核苷、核苷酸等进行缩合反应从而形成更长链的核苷酸的合成嵌段的核苷酸单元。多氟嵌段聚体是指包含多个氟标记的嵌段聚体。
[0026]
由上述式(iii)表示的氟嵌段聚体酰胺可以通过该以下方式合成：(1)使由上述式(ii)表示的5
′‑
末端保护核苷亚磷酰胺、或下述式(ii
′
)表示的5
′‑
末端保护核苷h-膦酸酯、与由下述式(v)表示的在3
′‑
末端键合有氟锚的核苷反应而合成中间体，(2)将所得到的中间体的键合于3
′‑
末端的氟锚所键合的核苷的氟锚除去而得到3
′‑
无保护体，(3)使无保护的3
′‑
羟基与ncch2ch2op[n(i-c3h7)2]2、ch2＝chch2op[n(i-c3h7)2]2等3价的磷酸化剂反应生成3
′‑
亚磷酰胺，或者在与亚磷酸三苯酯反应后用三乙胺进行水解的条件、使三氯化磷反应后进行水解等的条件下生成3
′‑
h-膦酸酯，(4)反复上述工序(1)至(3)直到得到目标链长的氟嵌段聚体酰胺。下述式(ii
′
)和式(v)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成
z-y键。【化学式11】【化学式12】
[0027]
第4实施方式是由下述式(iv)表示的多氟嵌段聚体。【化学式13】
[0028]
上述式(iv)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；r3为磷酸保护基，优选为ch2ch2cn、ch2ch＝ch2、och3、或ch2(ch2)
x
yg，y为nh或s，g为烯丙基或酰基，x为0～3；pro为无保护、核苷碱基的保护基或f-protector，f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；x为o或s；l为0～58的整数；r7为(c＝o)(ch2)2(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3或甲硅烷基类保护基，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷
基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。z-y键的例子与上述式(i)表示的化合物同样。由上述式(iv)表示的多氟嵌段聚体在pro或r1、r3中的任一个中，具有至少一个f-protector。
[0029]
第5实施方式是由上述式(iv)表示的多氟嵌段聚体的合成方法，其包括使由上述式(iii)表示的氟嵌段聚体酰胺或由下述式(ii
′
)表示的5
′‑
末端保护核苷h-膦酸酯、与由下述式(v)表示的在3
′‑
末端键合有氟锚的核苷发生偶联反应的工序。下述式(ii
′
)和式(v)中，b为天然型或修饰核苷碱基；r1是在酸性、碱性或中性条件下能够脱保护的保护基；f-protector在核苷碱基b的被保护部为o的情况下是o(ch2)n(cf2)mcf3，在核苷碱基b的被保护部为n的情况下是nh(c＝o)(ch2)n(cf2)mcf3，n为1或2，m为1～20的整数；y为h、oh、卤素、och3、甲氧基乙基、cn、cf3、或被酰基类保护基、醚类保护基、甲硅烷基类保护基保护的羟基；z为h、烷基、o-烷基、n-烷基、卤素、或与上述y之间形成z-y键。【化学式14】【化学式15】
[0030]
本实施方式中的多氟嵌段聚体可以通过以下方式合成：(1)使由上述式(ii)表示的5
′‑
末端保护核苷亚磷酰胺、或由上述式(ii
′
)表示的5
′‑
末端保护核苷h-膦酸酯、与由上述式(v)表示的在3
′‑
末端键合有氟锚的核苷反应生成中间体，(2)将得到的中间体的键合于3
′‑
末端的氟锚所键合的核苷的氟锚除去而得到3
′‑
无保护体，(3)使无保护的3
′‑
羟基与ncch2ch2op[n(i-c3h7)2]2、ch2＝chch2op[n(i-c3h7)2]2等3价的磷酸化剂反应生成3
′‑
亚磷酰胺，或与亚磷酸三苯酯、亚磷酸二苯酯、三氯化磷、2-氯-4h-1，3，2-二氧磷-4-酮等磷酸化剂反应后进行水解生成3
′‑
h-膦酸酯，(4)反复上述工序(1)至(3)直到得到目标链长的氟嵌段聚体酰胺。
[0031]
上述实施方式中的多氟嵌段聚体还可以通过以下记载的其它方法合成。可以通过使由上述式(iii)表示的氟嵌段聚体酰胺、由下述式(vi)表示的5
′‑
末端无保护、3
′‑
末端具有h-膦酸酯的氟嵌段聚体h-膦酸酯、和由上述式(iv)表示的多氟嵌段聚体的5
′‑
末端脱保护了的物质，利用所谓的一锅法(one pot)进行偶联，由此能够得到具有目标链长的多氟嵌段聚体。可以根据目标物的链长，对由5
′‑
保护氟嵌段聚体酰胺与氟嵌段聚体h-膦酸酯的偶
联得到的化合物的5
′‑
末端进行脱保护，再次与氟嵌段聚体酰胺反应，合成链长伸长的氟嵌段聚体h-膦酸酯后对5
′‑
末端进行脱保护，供上述的一锅偶联反应。进一步作为其它方法，通过使用将多氟嵌段聚体的3
′‑
末端替换成氟锚键合于固相载体的物质进行上述反应，也能合成键合于固相载体的多氟嵌段聚体。此外，对于在3
′‑
末端具有氟锚的多氟嵌段聚体、3
′‑
末端键合于固相载体的多氟嵌段聚体中的任一个，通过进行各部位的脱保护反应，都可以得到寡核苷酸。通过选择脱保护条件，还能合成仅在必要的部分残留保护基的修饰寡核苷酸。由上述式(iv)表示的多氟嵌段聚体在pro或r1、r3中的任一个中，具有至少一个f-protector。由此，利用多氟嵌段聚体所具有的亲和性，与使用通用的保护基的情况相比，能够简便地进行中间体、生成物的分离提纯。【化学式16】【化学式17】【化学式18】
[0032]
上述实施方式中的核苷碱基包括腺苷基、鸟苷基、胞嘧啶基、胸苷基、尿嘧啶基等天然型碱基、5-甲基胞嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、7-甲基鸟苷基、7-去氮杂腺苷基等修饰碱基。本说明书中的“修饰核苷碱基”中，包括具有氨基、羰基、羟基、巯基等反应性官能团的碱基。对于上述那样的反应性官能团，导入来自氟醇的氟保护基。作为保护核苷碱基的保护基，可举出酰基、苯甲酰基、烯丙氧基羰基等。
[0033]
上述实施方式中的脂肪族基包括饱和或不饱和的、直链状或支链的c
1-c
18
烃、饱和或不饱和的环状c
3-c
18
烃。优选为饱和或不饱和的c
1-c8烃或c
3-c8环状烃。本实施方式中的芳香族基包括苯基等碳环式芳香环、萘基等碳环式芳香环或与非碳式芳香环稠和的碳环式芳香环。本实施方式中的脂肪族基、芳香族基与被饱和或不饱和的c
1-c8烃或c
3-c8环状烃、卤素、氰基、硝基、芳香环等取代基取代。键合于与磷原子键合的氮原子的基团优选为直链状或支链的烷基、四氢吡咯、二乙胺、吗啉基等仲氨基，进一步优选为异丙基。另外，可以是键合于与磷原子键合的氮原子的烷基的一端部与邻接的氮原子键合而形成的环。
[0034]
作为上述实施方式中的键合邻接的核苷的磷酸的保护基，可以使用寡核苷酸合成中通用的磷酸保护基。优选可以为-ch2ch2cn、-ch2ch＝ch2、-och3、2-氯苯基、苯基、或者r
′
与键合于与磷原子键合的氮原子的r
″
的一个可以键合而形成环。作为上述以外的保护基，可举出在碱性条件下能够脱保护的-ch2ch2e(e为求电子性基团)、含氟保护基。
[0035]
本实施方式中的5
′‑
羟基的保护基包括在酸性条件、碱性条件或中性条件下能够除去的保护基。在酸性条件下能够除去的保护基包括包含取代或未取代的三苯甲基的醚类保护基、9-苯基氧杂蒽(
ピキシル
基)、取代或未取代的四氢吡喃基(thp)基，作为代表性保护基有4，4
′‑
二甲氧基三苯甲基。作为在中性条件下能够除去的保护基的例子，有甲硅烷基类保护基，具体来说，包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基。作为在碱性条件下能够除去的保护基的例子，有fmoc基、特戊酰基。作为上述以外的保护基，可举出烷基、酰基、乙酰基、苯甲酰基、苄基、烷氧基烷基、氨基甲酰基等。
[0036]
上述实施方式中，将3
′‑
无保护羟基酰胺化的工序中，向3
′‑
无保护核苷的溶液(0.1～0.4m)加入3价的磷酸化剂(3
′‑
无保护核苷的1.05～2.0当量)和活性化剂(3
′‑
无保护核苷的0.4～0.8当量)，在室温下搅拌10～20小时。用硅胶提纯得到的3
′‑
亚磷酰胺。
[0037]
上述实施方式中，相对于由式(ii)或式(iii)表示的3
′‑
亚磷酰胺，添加将酰胺部分活性化的活性化剂后，使由上述式(v)表示的在3
′‑
末端键合有氟锚的核苷发生偶联，由
此得到由式(iv)表示的多氟嵌段聚体。作为活性化剂的代表性例子，有1h-四唑、s-乙基巯基四唑、二氰基咪唑、二氯咪唑、磺酸与唑或叔胺的盐，但不限于这些。反应在使二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、dmf、甲苯等溶剂干燥了的容器中进行。
[0038]
在合成上述实施方式中的嵌段聚体酰胺、多氟嵌段聚体的情况下，作为一个一个碱基延伸的方法的其它方法，通过使已经成为2聚物以上的嵌段聚体酰胺与在3
′‑
末端键合有氟锚的核苷缩合，还可以使2个以上的碱基一次性伸长。
[0039]
使用由上述式(iii)表示的嵌段聚体酰胺进行的多氟嵌段聚体的合成可以在溶液中进行(以下，称为“液相合成法”)。利用上述的方法合成多氟嵌段聚体后，能够通过使用市售的硅胶、用十八烷基、二醇等修饰的硅胶、氟固相抽提用的硅胶的柱色谱简便地进行提纯。作为市售的氟固相抽提用的硅胶，可以举出能够由aldrich公司购入的fluoroflash silica gel 40μm作为一例。液相合成法与在固相树脂上进行偶联反应的固相合成法相比，能够以大量规模(10倍～100倍以上)合成。因此，能够以更低成本合成寡核苷酸合成用的多氟嵌段聚体。基于有机溶剂与水或氟溶剂与有机溶剂、氟溶剂与水的分液操作、这两相系的逆流色谱、基于晶析粉体化的简易提纯等也能适用。
[0040]
另外，对作为保护基导入多氟嵌段聚体的核苷碱基部分的本发明的f-锚数进行调整，换言之，在一部分核苷碱基部分导入本发明的f-锚，在剩余的核苷碱基部分使用通用的保护基，从而能够改变与氟固相抽提用的硅胶的亲和性。由此，使多氟嵌段聚体残留于氟固相抽提用的硅胶侧，能够更简便地进行与反应的副产物、过剩的试剂的分离。另外在多氟嵌段聚体合成的中间体的阶段，通过改变向溶剂的溶解性，不仅能够进行基于硅胶色谱的提纯，而且能够进行基于亲和色谱的提纯、基于在氟溶剂-烃系有机溶剂中的分配的提纯。像这样，本发明的多氟嵌段聚体根据合成的量和其链长，能够适当选择提纯方法。
[0041]
使用由上述式(iv)表示的多氟嵌段聚体的寡核苷酸的合成中，例如，在多氟嵌段聚体合成的阶段，使3价的磷酸与硫化剂而非氧化剂反应，能够使5价的磷酸的一部分成为硫代磷酸酯。因此，通过在嵌段聚体合成的中途阶段事先合成成为硫代磷酸酯的多氟嵌段聚体，能够合成在目标位置确实地导入硫代磷酸酯的寡核苷酸。
[0042]
以下的实施例对本发明的实施方式进行说明，是例示性的。按照实施例1所示的顺序，制造由上述式(ii)表示的化合物的一例即碱基部氟保护亚磷酰胺。另外，按照实施例2所示的顺序，制造由上述式(iv)表示的化合物的一例即多氟嵌段聚体。进一步按照实施例3所示的顺序，使用由上述式(iii)表示的化合物之一即嵌段聚体亚磷酰胺6聚物亚磷酰胺、与由上述式(iv)表示的化合物的一例即多氟嵌段聚体进行寡核苷酸19聚物的合成。
[0043]
(实施例1)核苷碱基部氟保护亚磷酰胺的合成步骤1：3
′
，5
′‑
保护核苷的碱基部的氟保护【化学式19】
[0044]
将能够利用公知的方法合成的3
′
，5
′‑
双-o-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷1(2.4g，5.0mmol)溶于四氢呋喃(25ml)，设为0℃。向其中加入三苯基膦(1.4g，5.5mmol)、40％偶氮二羧酸二乙酯/甲苯溶液(2.5ml，5.5mmol)、进一步加入1h，1h，2h，2h-十三氟-1-辛醇2(2.0g，1.2ml，5.5mmol)，搅拌12小时。将反应溶液直接浓缩，将析出的固体滤出，用己烷：乙酸乙酯＝1：1溶液清洗后，将得到的溶液再次浓缩，作为粗生成物。将其供于硅胶柱色谱。将在己烷：乙酸乙酯＝4：1中洗脱的部分回收，以3.3g(4.1mmol)、81％收率得到目标3
′
，5
′‑
双-o-叔丁基二甲基甲硅烷基-4-o-1h，1h，2h，2h-十三氟-1h-辛基胸苷3。esi-tof mass：840.3[m na

]

.
[0045]
步骤2：3
′
，5
′‑
保护-碱基部氟保护核苷的3
′
，5
′
脱保护【化学式20】
[0046]
将化合物3(1.6g，2.0mmol)溶于四氢呋喃(32ml)，设为0℃。向其中加入乙酸(120mg，0.11ml，2.0mol)，进一步加入1.0m四丁基氟化铵/四氢呋喃溶液(8.0ml，8.0mmol)，搅拌12小时。将反应溶液一部分浓缩成5ml左右的容积，将得到的反应混合物供于硅胶柱色谱。回收在乙酸乙酯中洗脱的部分，以1.2g(2.0mmol)、98％收率得到目标4-o-1h，1h，2h，2h-十三氟-1h-辛基胸苷4。esi-tof mass：612.0[m na

]

.
[0047]
步骤3：3
′
，5
′‑
无保护-碱基部氟保护核苷的5
′‑
保护【化学式21】
[0048]
将化合物4(1.2g，2.0mmol)溶于二甲基甲酰胺：吡啶＝1：1溶液(10ml)，向其中加入4，4-二甲基氨基吡啶(24mg，0.20mmol)、和二甲氧基三苯甲基氯化物(810mg，2.4mmol)，搅拌90分钟。向反应溶液加入乙酸乙酯(100ml)，用0.2n盐酸水溶液清洗3次有机层。使有机层通过硫酸钠干燥，将过滤后溶剂馏去，得到粗生成物。将其供于硅胶柱色谱，回收在己烷：乙酸乙酯＝7：3中洗脱的部分，以1.5g(1.7mmol)、83％收率得到目标5
′‑
二甲氧基三苯甲基-4-o-1h，1h，2h，2h-十三氟-1h-辛基胸苷5。esi-tof mass：914.7[m na

]

.
[0049]
步骤4：5
′‑
保护-3
′‑
无保护-碱基部氟保护核苷的酰胺化【化学式22】
[0050]
将化合物5(1.4g，1.6mmol)溶于二氯甲烷：乙腈＝1：1溶液(16ml)，向其中加入1h-四唑(80mg，1.1mmol)，以0℃搅拌15分钟。向其中加入烯丙基四异丙基亚磷酰胺(710mg，0.74ml，2.4mmol)，开始反应。15小时后，将该反应混合物直接供于硅胶柱色谱，回收在己烷：乙酸乙酯＝9：1中洗脱的部分，以1.6g(1.4mmol)、89％收率得到目标烯丙基5
’‑
二甲氧基三苯甲基-4-o-1h，1h，2h，2h-十三氟-1h-辛基胸苷-3
’‑
亚磷酰胺6。通过uplc测定显示为97％纯度。esi-tof mass：1079.2[m h

]

.将化合物6的esi-tof色谱示于图1。
[0051]
(实施例2)多氟嵌段聚体的合成步骤5：碱基部氟保护核苷的2聚物合成【化学式23】
[0052]
将化合物6(520mg，0.48mmol)与能够通过文献记载的方法合成的化合物7(280mg，0.40mmol)混合后，使其真空干燥，向其中填充氩气流设为常压。向其中加入分子筛3a(800mg)，接着加入二氯甲烷：乙腈＝1：1溶液(8ml)，搅拌2小时。向其中加入1h-四唑(110mg，1.6mmol)，在室温下搅拌30分钟。确认反应的进行后，加入31wt％2-过氧化丁酮/二异丁酸-2，2，4-三甲基-1，3-戊烷溶液(0.39ml，0.6mmol)，继续反应。30分钟后，对该反应混合物进行硅藻土过滤，浓缩到溶液量成为8ml后，供于硅胶柱色谱。回收在己烷：乙酸乙酯＝2：3中洗脱的部分，以640mg(0.38mmol)、94％收率得到目标双氟tt嵌段聚体8。通过uplc测定显示为98％纯度。esi-tof mass：1680.6[m-h

]-.将化合物8的esi-tof色谱示于图2。
[0053]
(实施例3)使用6聚物亚磷酰胺的寡核苷酸19聚物的液相合成步骤6：6聚物亚磷酰胺与5
′‑
保护-3
′‑
氟锚键合核苷的缩合反应【化学式24】
[0054]
将化合物9(400mg，0.17mmol)与能够通过公知的方法合成的化合物7(100mg，0.15mmol)混合后，使其真空干燥，向其中填充氩气流设为常压。向其中加入分子筛3a(600mg)，接着加入二氯甲烷：乙腈＝1：1溶液(6ml)，搅拌2小时。向其中加入5-乙基-1h-四唑(78mg，0.60mmol)，在室温下搅拌30分钟。确认反应的进行后，加入31wt％2-过氧化丁酮/二异丁酸-2，2，4-三甲基-1，3-戊烷溶液(0.15ml，0.30mmol)，继续反应。30分钟后，对该反应混合物进行硅藻土过滤，浓缩到溶液量成为5ml后，供于硅胶柱色谱。回收在二氯甲烷：甲醇＝20：1中洗脱的部分，以260mg(0.084mmol)、56％收率得到目标t7聚物10。esi-tof mass：1552.2[m 2na

]

.
[0055]
步骤7：5
′‑
保护-3
′‑
氟锚键合核苷酸7聚物的5
′‑
脱保护【化学式25】
[0056]
将化合物10(230mg，0.076mmol)加入二氯甲烷：乙腈＝4：1溶液(4ml)，使其溶解后，浸渍于冰浴中成为0℃。向其中加入二氯乙酸(200mg，0.13ml，1.5mmol)，搅拌30分钟。确认反应的进行后，将该反应混合物直接供于硅胶柱色谱。回收在二氯甲烷：甲醇＝13：1中洗脱的部分，以180mg(0.065mmol)、86％收率得到目标脱三苯甲基的t7聚物11。
[0057]
步骤8：基于5
′‑
保护6聚物嵌段聚体酰胺与5
′‑
无保护-3
′‑
氟锚键合核苷酸7聚物的缩合的5
′‑
保护核苷酸13聚物合成【化学式26】
[0058]
将化合物9(240mg，0.10mmol)与化合物11(210mg，0.076mmol)混合后，使其真空干燥，向其中填充氩气流设为常压。向其中加入分子筛3a(500mg)，接着加入二氯甲烷：乙腈＝1：1溶液(5ml)，搅拌2小时。向其中加入5-乙基-1h-四唑(40mg，0.30mmol)，在室温下搅拌30分钟。确认反应的进行后，加入31wt％2-过氧化丁酮/二异丁酸-2，2，4-三甲基-1，3-戊烷溶液(0.073ml，0.11mmol)，继续反应。30分钟后，对该反应混合物进行硅藻土过滤，浓缩到溶液量成为5ml后，供于硅胶柱色谱。回收在二氯甲烷：甲醇＝9：1中洗脱的部分，以260mg(0.051mmol)、73％收率得到目标t13聚物12。
[0059]
步骤9：5
′‑
保护核苷酸13聚物的5
′‑
脱保护【化学式27】
[0060]
将化合物12(480mg，0.093mmol)加入二氯甲烷：乙腈＝4：1溶液(4.5ml)，使其溶解后，浸渍于冰浴中成为0℃。向其中加入二氯乙酸(240mg，0.15ml，1.9mmol)，搅拌30分钟。确认反应的进行后，将该反应混合物直接供于硅胶柱色谱。回收在二氯甲烷：甲醇＝9：1中洗脱的部分，以240mg(0.050mmol)、52％收率得到目标脱三苯甲基的t13聚物13。得到的化合物是目标13聚物通过如下方式确认：将得到的化合物的一部分供于氨水解，观测显示t13聚物的分子离子峰[m-h

]-3889.67(计算值3889.64)。
[0061]
步骤10：基于5
′‑
保护6聚物嵌段聚体酰胺与5
′‑
无保护-3
′‑
氟锚键合核苷酸13聚
物的缩合的5
′‑
保护-3
′‑
氟锚键合核苷酸19聚物合成【化学式28】
[0062]
将化合物9(230mg，0.093mmol)与化合物13(300mg，0.062mmol)混合后，使其真空干燥，向其中填充氩气流设为常压。向其中加入分子筛3a(500mg)，接着加入二氯甲烷：乙腈＝1：1溶液(5ml)，搅拌2小时。向其中加入5-乙基-1h-四唑(32mg，0.25mmol)，在室温下搅拌30分钟。确认反应的进行后，加入31wt％2-过氧化丁酮/二异丁酸-2，2，4-三甲基-1，3-戊烷溶液(0.060ml，0.093mmol)，继续反应。30分钟后，对该反应混合物进行硅藻土过滤，浓缩到溶液量成为5ml后，供于硅胶柱色谱。回收在二氯甲烷：甲醇＝6：1中洗脱的部分，以82mg
(0.011mmol)、18％收率得到目标5
′‑
保护-磷酸保护-3
′‑
氟锚键合t19聚物14。
[0063]
步骤11：5
′‑
保护-3
′‑
氟锚键合核苷酸19聚物合成的脱保护【化学式29】
[0064]
使化合物14溶于1％β-巯基乙醇的甲醇：浓氨水＝1：1溶液，以50℃搅拌12小时。将反应生成物供于市售的提纯试剂盒，进行二甲氧基三苯甲基的除去和提纯，从而确认得到目标化合物15。是目标19聚物通过观测到显示t19聚物的分子离子峰[m-h-]-5714.00(分子式c
190h247n38o131
p
18-，计算值5713.91)得到确认。将得到的t19聚物15的uplc色谱示于图3，将esi-tof质谱示于图4。
[0065]
(实施例4)使用碱基部被氟保护的核苷的11聚物的合成步骤12：基于5
′‑
保护-碱基部氟保护核苷-3
′‑
酰胺与5
′‑
无保护-3
′‑
保护-核苷酸3聚物的缩合的、包含碱基部氟保护核苷的5
′
，3
′‑
保护核苷酸4聚物合成【化学式30】
将化合物16(1.05g，1.00mmol)和化合物4(1.34g，1.20mmol)溶于二氯甲烷-乙腈1：1混合物(16ml)，进一步加入1h-四唑(350mg，5.00mmol)进行搅拌。15分钟后，滴加31wt％2-过氧化丁酮(966μl，1.50mmol)搅拌15分钟。通过tlc(乙酸乙酯100％)确认原料基本消失，分液清洗后，供于柱色谱，得到目标5
′
，3
′‑
保护核苷酸4聚物17(1.93g，0.93mmol，93％收率，纯度97％)。结构通过
31
pnmr、esi-ms确认，纯度通过uplc确认)。
[0066]
步骤13：包含碱基部氟保护核苷的5
′
，3
′‑
保护核苷酸4聚物的3
′‑
脱保护【化学式31】向5
′
，3
′‑
保护核苷酸4聚物17(1.87g，0.900mmol)加入乙酸(51.4μl，0.900mmol)冷却至0℃。滴加1.0m tbaf in thf(1.80ml，1.80mmol)搅拌3显示。通过tlc(乙酸乙酯＝
100％)确认原料基本消失，分液清洗后，供于柱色谱，得到目标3
′‑
脱保护4聚物18(1.35g，0.689mmol，76.7％收率，纯度93％)。结构通过
31
pnmr、esi-ms确认，纯度通过uplc确认。
[0067]
步骤14：包含碱基部氟保护核苷的5
′‑
保护核苷酸4聚物的3
′‑
酰胺化【化学式32】将化合物18(1.27g，0.65mmol)溶于二氯甲烷-乙腈1：1混合物(16ml)，进一步加入1h-四唑(59.0mg，0.845mmol)和n-甲基咪唑(21.0μl，0.260mmol)，设为0℃。15分钟后，滴加烯丙基-n，n，n’，n
’‑
四异丙基亚磷酰胺(469μl，1.63mmol)。4天后，通过tlc(己烷：乙酸乙酯＝2：1)确认原料基本消失，将反应混合液直接供于柱色谱，得到目标4聚物酰胺体19(0.873g，0.40mmol，62.6％收率，纯度98.3％)。结构通过esi-ms确认，纯度通过uplc确认。
[0068]
步骤15：基于包含碱基部氟保护核苷的5
′‑
保护核苷酸4聚物3
′‑
酰胺与5
′‑
无保护-3
′‑
保护核苷酸3聚物的缩合的、包含碱基部氟保护核苷的5
′
，3
′‑
保护核苷酸7聚物合成【化学式33】
将化合物16(0.537g，0.25mmol)和4聚物酰胺19(0.288g，0.275mmol)溶于二氯甲烷-乙腈1：1混合物(5ml)，进一步加入5-乙硫基-1h-四唑(70.1mg，1.00mmol)进行搅拌。90分钟后，滴加31wt％2-过氧化丁酮(241μl，0.375mmol)搅拌60分钟。通过tlc(乙酸乙酯：甲醇＝9：1)确认原料基本消失，分液清洗后，供于柱色谱，得到目标7聚物20(0.655g，0.211mmol，84.3％收率，纯度96.7％)。结构通过esi-ms确认，纯度通过uplc确认。
[0069]
步骤16：包含碱基部氟保护核苷的5
′
，3
′‑
保护核苷酸7聚物的5
′‑
脱保护【化学式34】
向化合物20(0.655g，0.211mmol)加入二氯甲烷(4ml)冷却至0℃。滴加二氯乙酸(0.349ml，4.22mmol)搅拌30分钟。通过tlc(乙酸乙酯：甲醇＝9：1)确认原料基本消失，将反应液供于柱色谱，得到目标5
′‑
无保护7聚物21(0.468g，0.689mmol，79.1％收率，纯度92.4％)。纯度通过uplc确认。
[0070]
步骤17：基于包含碱基部氟保护核苷的5
′‑
保护核苷酸4聚物3
′‑
酰胺与包含碱基部氟保护核苷的5
′‑
无保护-3
′‑
保护核苷酸7聚物的缩合的包含碱基部氟保护核苷的5
′
，3
′‑
保护核苷酸11聚物合成【化学式35】
将5
′‑
无保护7聚物21(0.311g，0.100mmol)和4聚物酰胺19(0.236g，0.110mmol)溶于二氯甲烷-乙腈1：1混合物(2ml)，进一步加入1h-四唑(42.0mg，6.00mmol)和n-甲基咪唑(16μl，0.200mmol)进行搅拌。90分钟后，滴加31wt％2-过氧化丁酮(100μl，0.150mmol)搅拌60分钟。通过tlc(乙酸乙酯：甲醇＝9：1)确认原料基本消失，分液清洗后，供于柱色谱，得到目标包含碱基部氟保护核苷的5
′
，3
′‑
保护核苷酸11聚物22(0.450g，0.0920mmol，92％收率，纯度96.7％)。纯度通过uplc确认。将uplc色谱示于图5。对于得到的包含碱基部氟保护核苷的5
′
，3
′‑
保护核苷酸11聚物22利用通用的方法进行脱保护，由此能够得到除去了保护基的核苷酸11聚物。
[0071]
将对利用以往方法合成的具有dta
19
序列的核苷酸20聚物的脱保护后的纯度、与通过使用本发明的氟标记的合成法合成的具有dta
19
序列的核苷酸20聚物的脱保护后的纯度进行比较的uplc色谱示于图6。(a)为利用以往方法合成的dta
19
20聚物的色谱，(b)为在5
′‑
末端t的碱基部分具有本发明的氟标记的dta
19
20聚物的色谱。可知通过按照成为留下氟标记的状态的方式进行脱保护，供提纯，以比利用以往方法合成的20聚物更高的纯度得到了20聚物。由于氟标记所具有的高脂溶性，分离提纯时保留时间大幅改变，从而显示能够比以往方法更简便地进行单离提纯。
[0072]
本实施方式的多氟嵌段聚体可以通过直接使用市售的氟化碳衍生物导入氟锚来合成。另外，可以根据目的容易地改变氟锚中的氟的数量。因此，与为了得到目标氟标记需要复杂的工序的、基于以往方法的向核苷的氟标记导入相比，能够以低成本且容易地得到目标物。
[0073]
另外，因前述那样的问题，基于以往方法的向核苷的氟标记导入对氟标记的导入数有限制，通用性不高。与此相对，本实施方式的多氟嵌段聚体的合成通过调整氟锚的导入数，能够降低寡核苷酸合成的中间体的溶解性、提纯负荷。由此，能够成为通用性更高的合成法。另外，氟标记可以根据合成的嵌段聚体、寡核苷酸的长度、序列向核苷碱基部分导入，或者向核苷的3
′‑
末端的保护基导入。
[0074]
另外，使用本实施方式的多氟嵌段聚体的寡核苷酸合成方法可以在嵌段聚体的阶段事先形成氧化/硫化了的5价的磷酸键合部分。因此，仅使寡核苷酸中的一部分磷酸键成为与其它部分的磷酸键不同的氧化/硫化状态的情况下，也能不改变寡核苷酸合成的顺序，而更简便地合成目标包含经修饰的磷酸键合部分的寡核苷酸。
[0075]
另外，目前使用的导入了氟标记的嵌段聚体由于受到其氟标记的物性影响，寡核苷酸合成中的链长伸长时的提纯方法变得繁杂。与此相对，多氟嵌段聚体的合成方法和使用多氟嵌段聚体的寡核苷酸合成方法根据其链长，硅胶过滤、基于亲和色谱的提纯、在氟溶剂-烃系有机溶剂的分配等，提纯方法的选择的自由度大。因此，与基于以往方法的使用氟标记的寡核苷酸合成方法相比，能够以更简便的提纯得到目标寡核苷酸。
[0076]
另外，根据本实施方式的使用多氟嵌段聚体的寡核苷酸合成方法，在合成相同n聚物的寡核苷酸时，与利用通用的液相合成法一个一个碱基地进行伸长的方法相比，能够减少必要的工序数。因此，能够提高目标长度的寡核苷酸的收率。