抑制酪氨酸酶的抗-酪氨酸酶抗体及其用途的制作方法

本发明涉及抑制酪氨酸酶(tyrosinase)的抗-酪氨酸酶抗体及其用途。

背景技术

人的皮肤颜色根据多种因素，尤其根据季节、人种及性别而不同，并且主要由黑色素(melanin)、胡萝卜素以及血红蛋白的量来决定，其中，黑色素作为最具决定性的因素。黑色素在存在于皮肤基层的黑素细胞(melanocyte)中合成，并转移到周边角质形成细胞而呈现人的皮肤颜色。已知当黑色素异常少时，会诱发诸如白癜风之类的皮肤病变，相反，当黑色素过量产生时，会形成斑点、瑕疵。黑色素是通过酪氨酸酶(tyrosinase)作用于作为一种氨基酸的酪氨酸(tyrosine)而生成的，酪氨酸酶更多地被紫外线激活，因此，若暴露于大量阳光，则皮肤会变黑。因此，用于开发预防色素沉着的美白化妆品的药剂的基本机理可以包括抑制酪氨酸酶的活性、抑制酪氨酸酶的生成、抑制促进黑色素生成的中间因子(mediator)、抑制生成的黑色素的还原及光氧化、促进黑色素的排泄及阻断紫外线等。其中，通过抑制酪氨酸酶活性的方法可以说是能够获得最简单且有效的皮肤美白效果的方法之一。

尽管通过抑制所述酪氨酸酶活性而进行皮肤美白的研究正在积极地进行，但是对抑制酪氨酸酶的抗体的研究仍然不足。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的是提供一种抑制酪氨酸酶的抗-酪氨酸酶抗体或该抗体的抗原结合片段。

本发明的另一目的是提供一种融合的抗-酪氨酸酶抗体或该抗体的抗原结合片段，其中TAT肽进一步与所述抗-酪氨酸酶抗体或该抗体的抗原结合片段结合。

本发明的又一目的是提供一种对所述抗体或该抗体的抗原结合片段进行编码的核酸分子、包含所述核酸分子的重组表达载体以及用所述重组表达载体转化性状的细胞。

本发明的又一目的是提供一种用于检测酪氨酸酶抗原的组合物，其包含作为活性成分的所述抗体或该抗体的抗原结合片段。

本发明的又一目的是提供一种包含所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分的用于皮肤美白的化妆品组合物或保健功能食品组合物。

本发明的又一目的是提供一种包含所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分的用于预防或治疗皮肤色素沉着疾病的药物组合物或用于诊断皮肤色素沉着疾病的组合物或诊断皮肤色素沉着疾病所需的信息的方法。

技术方案

为了实现所述目的，本发明提供一种抗-酪氨酸酶抗体或该抗体的抗原结合片段，包括：轻链可变区，包含由序列号1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、由序列号2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及由序列号3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包含由序列号4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、由序列号5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及由序列号6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

此外，本发明提供一种融合抗-酪氨酸酶抗体或该抗体的抗原结合片段，其中，在所述抗体或该抗体的抗原结合片段附加地结合有由序列号7表示的TAT肽。

此外，本发明提供编码所述抗体或该抗体的抗原结合片段的核酸分子。

此外，本发明提供包含所述核酸分子的重组表达载体。

此外，本发明提供利用所述重组表达载体转化性状的细胞。

此外，本发明提供一种酪氨酸酶抗原检测用组合物，其包含将所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

此外，本发明提供皮肤美白用化妆品组合物，其包含将所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

此外，本发明提供皮肤美白用保健食品组合物，其包含将所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

此外，本发明提供用于预防或治疗皮肤色素沉着疾病的药物组合物，其包含将所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

此外，本发明还提供皮肤色素沉着疾病诊断用组合物，其包含将所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

此外，本发明提供一种为皮肤色素沉着疾病诊断提供所需信息的方法，包括如下步骤：使所述抗体或该抗体的抗原结合片段与从疑似皮肤色素沉着疾病的个体分离的样品接触；以及通过抗原-抗体反应检测来自所述样品的酪氨酸酶蛋白。

技术效果

本发明涉及抑制酪氨酸酶的抗-酪氨酸酶抗体及其用途，更具体地，本发明涉及包含特定序列的重链CDR和轻链CDR的抗-酪氨酸酶抗体或该抗体的抗原结合片段。所述抗-酪氨酸酶抗体有望抑制酪氨酸酶的活性，从而能够有效地用于改善皮肤美白或治疗皮肤色素沉着疾病。

附图说明

图1示出了用于筛选α-酪氨酸酶(a-Tyrosinase)单链抗体(scFv)的酶联免疫吸附剂测定(ELISA)分析结果。

图2示出了ELISA分析法的再现性验证结果。

图3示出了纯化细胞渗透性α-酪氨酸酶scFv蛋白后，通过SDS-PAGE呈现尺寸和蛋白质纯度的结果。

图4示出了细胞渗透性α-酪氨酸酶scFv蛋白的酪氨酸酶的酶活性抑制结果。

图5示出了通过DAB染色法呈现细胞渗透性α-酪氨酸酶scFv蛋白的猪皮肤渗透能力的结果。

最优实施方式

本发明提供一种抗-酪氨酸酶抗体或该抗体的抗原结合片段，包括：轻链可变区，包含利用由序列号1表示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、利用由序列号2表示的氨基酸序列组成的轻链CDR2以及利用由序列号3表示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；以及重链可变区，包含利用由序列号4表示的氨基酸序列组成的重链CDR1、利用由序列号5表示的氨基酸序列组成的重链CDR2以及利用由序列号6表示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

此外，本发明提供一种融合抗-酪氨酸酶抗体或该抗体的抗原结合片段，其中，在所述抗体或该抗体的抗原结合片段附加地结合有由序列号7表示的TAT肽。

另外，利用由序列号1至序列号6表示的氨基酸组成的CDR记载于表1中。

此外，用于本发明的TAT肽的氨基酸序列为“YGRKKRRQRRR”(序列号7)，TAT肽的碱基序列为“TAT GGC CGC AAA AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC”(序列号8)。

在本发明中，术语“抗体”是指用作特异性地识别抗原的受体的蛋白质分子，其包含在免疫学上与特定抗原具有反应性的免疫球蛋白分子，并且作为其示例可以包括所有单克隆抗体、多克隆抗体、全长抗体(full-length anti body)以及抗体片段。此外，所述术语“抗体”可以包括二价(bivalent)或双特异性分子(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体或四抗体。

在本发明中，术语“单克隆抗体”是指从实质上相同的抗体群中获得的单分子组成的抗体分子，与多克隆抗体能够结合多个表位这一点不同地，这种单克隆抗体对特定表位表现出单一结合性及亲和性。本发明中的术语“全长抗体”是指具有两条整体长度的轻链以及两条整体长度的重链的结构，其中每条轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)以及伊普西隆(ε)类型，并且具有伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)以及阿尔法2(α2)作为亚类。轻链的恒定区具有卡帕(κ)和兰木达(λ)类型。IgG为亚类(subtype)，包括IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。

本发明中的术语“重链”可以包括所有全长重链及其片段，所述全长重链及其片段包含可变区VH和三个恒定区CH1、CH2和CH3，其中，所述可变区VH包括具有足以用于对抗原赋予特异性的可变区序列的氨基酸序列。并且本发明中的术语“轻链”可以将全长轻链及其片段全部包含，所述全长轻链及其片段可以包括可变区VL和恒定区CL，其中，所述可变区VL包括具有足以用于对抗原赋予特异性的可变区序列的氨基酸序列。

在本发明中的术语“片段”、“抗体片段”以及“抗原结合片段”指代具有抗体的抗原结合功能的本发明的抗体的任意片段，并且能够互换使用。示例性的抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv等，但不限于此。

本发明的抗体或该抗体的抗原结合片段在能够表现出与酪氨酸酶特异性地结合的能力的范围内，不仅可以包含本说明书中记载的抗体的序列，还可以包含其生物学等同物。例如，为了使抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性得到更进一步改善，可以对抗体的氨基酸序列加以额外的改变。这种转化包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或被取代。基于氨基酸侧链取代基的相对相似性(例如疏水性、亲水性、电荷、尺寸等)而实现这样的氨基酸改变。根据对氨基酸侧链取代基的尺寸、形状和种类的分析可以看出，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的尺寸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这一点，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是生物学上的功能等同物。

此外，本发明提供了对所述抗体或该抗体的抗原结合片段进行编码的核酸分子。

在本说明书中使用的术语“核酸分子”具有综合包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子的含义，并且作为核酸分子的基本组成单元的核苷酸不仅包括天然核苷酸，而且还包括糖或碱基部分被修饰的类似物(analogue)。对本发明的重链可变区和轻链可变区进行编码的核酸分子的序列可以被修饰，并且所述修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守性取代或保守性取代。

此外，本发明提供包含所述核酸分子的重组表达载体。

在本发明中的“载体”是指用于运载克隆基因(或克隆DNA的其他片段)的自我复制的DNA分子。

在本发明中的术语“表达载体”是指重组DNA分子，所述重组DNA分子包含目标编码序列和表达以在特定宿主生物中可操作的方式连接的编码序列所必需的合适的核酸序列。优选地，表达载体可以包含一个以上的选择性标记。所述标记通常为具有可通过化学方法选择的特性的核酸序列，并且能够将性状转化的细胞区分于非性状转化的细胞的所有基因对应于此。其示例包括诸如氨苄青霉素、卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素、潮霉素和氯霉素之类的抗生素抗性基因，但不限于此，能够由本领域技术人员适当选择。

为了表达本发明的DNA序列，可以在载体中使用各种各样的表达调控序列中的任何一种。有用的表达调控序列的示例可以包括例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、CMV的启动子和增强子、反转录病毒的LTR、lac系统、trp系统、TAC系统或TRC系统、T3启动子和T7启动子、λ噬菌体的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白的调控区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、所述磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母α-交配系统的启动子以及已知调控原核细胞或真核细胞或者它们的病毒的基因表达的结构和衍生的其他序列以及它们的各种组合。

在一个载体中同时表达轻链和重链的载体系统或使轻链和重链分别在单独的载体上表达的系统都可以是表达本发明的抗体的载体。在后者的情况下，两个载体通过共转化(co-transfomation)和靶向转化(targeted transformation)导入至宿主细胞。共转化是一种将对轻链和重链进行编码的各个载体DNA同时导入宿主细胞中，然后筛选将轻链和重链全部表达的细胞的方法。靶向转化是筛选利用包含轻链(或重链)的载体转化性状的细胞，然后用包含重链(或轻链)的载体再次转化所筛选的表达轻链的细胞，从而最终筛选将轻链和重链全部表达的细胞的方法。

此外，本发明提供了用重组表达载体转化性状的细胞。

能够稳定并连续克隆及表达本发明的载体的细胞可以为相关技术领域中公知的任意宿主细胞，例如包括大肠杆菌(Escherichia coli)、诸如枯草芽孢杆菌及苏云金芽孢杆菌之类的芽孢杆菌属菌株、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，肉糖葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))之类的原核宿主细胞，但不限于此。

在所述抗体或该抗体的抗原结合片段的制备方法中，可以根据相关技术领域公知的合适的培养基和培养条件进行性状转化的细胞的培养。本领域普通的技术人员可以根据所选择的菌株容易地调整并使用这样的培养过程。细胞培养根据细胞的生长方式分为悬浮培养和贴壁培养，根据培养方法分为分批式、补料分批式及连续培养式。用于培养的培养基必须适当地满足特定菌株的所需条件。

此外，本发明提供了一种用于检测酪氨酸酶抗原的组合物，其包含所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

此外，本发明提供了用于皮肤美白的化妆品组合物，其包含所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

除了活性成分之外，所述化妆品组合物还可以包含诸如稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料之类的常规佐剂，以及载体。

所述化妆品组合物的剂型可以制备为本领域通常制备的任何剂型，可以具有选自由皮肤外用软膏、霜、柔软化妆水、营养化妆水、面膜、精华素、生发水、洗发水、润发素、护发素、头发护理剂、啫喱、润肤乳、柔肤乳、爽肤水、紧肤水、护肤水、乳液、保湿水、营养水、按摩霜、营养霜、眼霜、保湿霜、手霜、粉底、营养精华素、防晒、肥皂、洁面泡沫、洁面洗剂、洁面霜、润肤露及沐浴露组成的组中的剂型，但不限于此。这些各种剂型的组合物可以含有对该剂型进行制剂化所需要的适当的各种基础原料和添加物，本领域技术人员可以容易地选择这些成分的种类和量。

在剂型是糊剂、霜剂或凝胶的情况下，动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等可以用作载体组分。

在所述剂型为粉末剂或喷雾剂的情况下，可以利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸三钙或聚酰胺粉末作为载体组分，尤其，当剂型为喷雾剂时，可以附加地包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚之类的推进物。

在所述剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体组分，例如有，水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇酐的脂肪酸酯。

在所述剂型为悬浮液的情况下，可以利用诸如水、乙醇或丙二醇之类的液态稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯之类的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等作为载体组分。

此外，本发明提供了用于皮肤美白的保健食品组合物，其包含所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

所述保健食品组合物可以以粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆、饮料或丸剂的形态提供，所述保健食品组合物除了作为有效成分的根据本发明的组合物之外，可以与其他食品或食品添加物一同使用，并且可以根据通常的方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(例如根据对预防、保健或治疗的处理)而适当地确定。

所述保健食品组合物中含有的抗体或该抗体的抗原结合片段的有效剂量可以根据所述药学组合物的有效剂量来使用，但在以健康及卫生为目的或以健康调理为目的而长期摄取的情况下，可以按上述范围以下的量使用，但由于有效成分在安全性方面没有任何问题，确实也可以以上述范围以上的量使用。

所述保健食品的类型没有特别限制，其示例可以为肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食类、饼干类、比萨、拉面、其他面条类、口香糖类、乳制品(包括冰淇淋)、各种汤、饮料、茶、功能饮料、酒精饮料以及维生素复合剂等。

此外，本发明提供了用于预防或治疗皮肤色素沉着疾病的药物组合物，其包含所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

具体地，所述皮肤色素沉着疾病可以是黄褐斑、雀斑、黑斑、胎记、药物引起的色素沉着、炎症后的色素沉着或由皮炎引起的过度色素沉着，但不限于此。

本发明的药物组合物可以附加地包含药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体作为制剂时通常使用的载体，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限于此。除了上述成分之外，本发明的药物组合物还可以追加地包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

本发明的药物组合物可以口服给药或非口服给药，在非口服给药的情况下，药物组合物可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻腔内给药、肺内给药以及直肠内给药等进行给药。在口服给药的情况下，由于蛋白质或肽被消化，因此口服用组合物可以以涂敷活性药剂或防止在胃中分解的方式进行剂型化，本发明的组合物可以通过能够使活性物质向靶细胞移动的任意装置来给药。

本发明的药物组合物的合适剂量根据诸如制剂方法、给药方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度和反应敏感性之类的因素而不同，并且普通熟练的医生可以容易地确定和开出对期望的治疗或预防有效的剂量。

本发明的药学组合物可以根据本发明所属技术领域中具备普通知识的技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而制备成单位容量形态或制备成装入多容量容器内。此时，剂型可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浓缩剂、散剂、栓剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可以追加包含分散剂或稳定剂。

本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，并且可以与现有治疗剂一起按序地或同时施用。

此外，本发明还提供了用于诊断皮肤色素沉着疾病的组合物，其包含将所述抗体或该抗体的抗原结合片段作为活性成分。

具体地，所述皮肤色素沉着疾病可以是黄褐斑、雀斑、黑斑、胎记、药物引起的色素沉着、炎症后的色素沉着或由皮炎引起的过度色素沉着，但不限于此。

此外，本发明提供了一种提供诊断皮肤色素沉着疾病所需信息的方法，所述方法包括如下步骤：使所述抗体或该抗体的抗原结合片段与从疑似患有皮肤色素沉着疾病的个体分离的样品接触；以及通过抗原-抗体反应而从所述样品中检测酪氨酸酶蛋白。

具体地，所述皮肤色素沉着疾病可以是黄褐斑、雀斑、黑斑、胎记、药物引起的色素沉着、炎症后的色素沉着或由皮炎引起的过度色素沉着，但不限于此。

只要是通过测量抗原与抗体之间的结合而能够检测酪氨酸酶蛋白的方法，则均可以包括于上述通过抗原-抗体反应检测酪氨酸酶蛋白的方法。这些方法在本领域中是公知的，其示例有蛋白免疫印迹(Western blot)、ELISA、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、荧光免疫分析法、免疫印迹、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、免疫色谱分析法、FACS、蛋白质芯片等，并且不限于此。

另外，用于所述抗原-抗体反应的免疫学分析的工具或试剂可以包括合适的载体或支撑体、可以产生可检测的信号的标记、增溶剂、清洁剂以及稳定剂等。对于合适的载体而言，虽然不限于此，但是在标记物质是酶的情况下还可以包括可测量酶活性的基质、合适的缓冲溶液、用显色酶或荧光物质标记的二抗、显色基质以及反应终止剂等。

具体实施方式

以下将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

<实施例1>α-酪氨酸酶(α-Tyrosinase)scFv抗体的筛选

1.执行生物淘选

利用具有7.6×10⁹的多样性的OPAL数据库进行了生物淘选。将5μg酪氨酸酶抗原固定于环氧基磁珠上，并与输入噬菌体(input phage)进行了反应。洗脱(elution)与抗原反应的噬菌体(phage)，并测量了输出滴度(outputtiter)。每次测量输入(input)和输出滴度(output titer)以获得生物淘选的信息，并确认了生物淘选是否正常进行。每次使用2×10¹²菌落数/ml≥的噬菌体(phage)作为输入噬菌体(input phage)。可知，输出(output)随着生物淘选(bio-panning)的进行以第1次1.7×10⁶菌落数/ml、第2次3.65×10⁶菌落数/ml、第3次4.68×10⁸菌落数/ml的状态扩增。因此，可以确认生物淘选(bio-panning)正常进行。

2.ELISA分析

为了筛选高敏感度、高特异性抗体而进行了ELISA分析法。利用获得的噬菌体(phage)感染大肠杆菌，并涂抹在了添加有抗生素的LB板上。在30℃的培养箱中培养16小时后，随机采集生成的菌落(colony)。将各菌落(colony)放入LB培养基进行培养后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)处理来表达scFv，并溶解(lysis)大肠杆菌来提取水溶性组分(soluble fraction)，并执行了ELISA。首先，将30ng酪氨酸酶抗原固定在96孔ELISA板上，并用含有3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)封闭。1小时后，用上面获得的细胞裂解产物(cell lysate)进行处理，并在37℃下反应了2小时。用含有0.1％吐温20的PBS洗涤板3次后，在封闭溶液(blocking solution)中以1:1000的比例稀释HRP缀合的抗HA(HRP conjugated anti-HA)抗体，并在37℃下反应了1小时。将板用含有0.1％吐温20的PBS洗涤5次，然后用TMB底物显色，并使用ELISA读取器测量了与抗原结合的scFv抗体。分析了96种抗体，并任意选择光密度值(OD)0.4作为阳性参考线(positive guideline)，光密度值(OD)0.1作为阴性参考线(negative guideline)而筛选了11种抗体(图1)。

<实施例2>α-酪氨酸酶scFv抗体的测序

对于通过ELISA分析筛选的11种酪氨酸酶scFv阳性克隆(positive clone)，通过测序(sequencing)筛选了单独的克隆(clone)。由于在先筛选的阳性克隆(positive clone)中有可能存在重复的克隆(clone)，因此需要进行序列分析。根据序列分析结果，在11种阳性克隆(positive clone)中，确认了2种为单独的克隆(clone)。

<实施例3>所筛选的α-酪氨酸酶抗体的纯化和灵敏度分析

1.α-酪氨酸酶scFv抗体的纯化

纯化了在先筛选的一种α-酪氨酸酶scFv抗体(表1)。将一种克隆(clone)转化性状(transformation)的ER2738大肠杆菌细胞(ER2738 E.coli cell)培养在500ml的SB培养基中，然后利用1X TES缓冲液(1X TES buffer)溶解(lysis)细胞。使细胞溶解产物(cell lysate)与0.5ml镍珠(Ni bead)反应，并利用咪唑(imidazole)进行洗脱(elution)。

[表1]

2.纯化的α-酪氨酸酶scFv抗体的灵敏度分析

使用纯化的α-酪氨酸酶scFv抗体进行了灵敏度分析。灵敏度分析利用了ELISA分析法。首先，将各种浓度的酪氨酸酶抗原固定于ELISA板，然后对10μg/ml的α-酪氨酸酶scFv抗体进行了处理。并且通过利用以1:1000的比例稀释的HRP标记的抗HA抗体进行了分析。分析结果为EC50-1368ng/ml、LOD-12.5ng/ml(图2)。

<实施例4>细胞渗透α-酪氨酸酶scFv的构建

1.TAT-α-酪氨酸酶scFv构建体的构建

生产了利用引物(primer)对在先筛选的scFv插入限制酶位点(restriction enzymesite)和TAT的聚合酶链式反应(PCR)产物。用4μl缓冲液(buffer)3.1、1μl EcoRI、1μl XhoI、4μl蒸馏水处理30μl的各个PCR产物，并在37℃下反应1小时后，分离DNA，从而确保了要插入载体(vector)的插入物(insert)。对pET28a( )载体(vector)而言，在转化性状(transformation)至DH5α感受态细胞(competent cell)后，涂抹于添加有卡那霉素(kanamycin)的LB板，在37℃下培养16小时，第二天提取菌落(colony)，并接种于添加有卡那霉素(kanamycin)的LB培养基，然后在37℃下培养了16小时。第二天，利用迷你制备试剂盒(mini-prep kit)分离载体(vector)后，用4μl的缓冲液(buffer)3.1、1μl的EcoRI、1μl的XhoI、1μl的CIP、3μl的蒸馏水处理30μl的载体(vector)，并且在37℃下反应1小时后进行了纯化。通过分光光度计(nanodrop)测量纯化的载体(vector)和插入物(insert)的浓度，并使用T4连接酶(T4 ligase)在室温下分别以载体(vector)和插入物(insert)的比例连接了16小时。完成连接(Ligation)后，转化性状(transformation)至DH5α后，涂抹于添加有卡那霉素(kanamycin)的LB板，并在37℃下培养16小时，第二天提取菌落(colony)并接种于添加有卡那霉素(kanamycin)的LB培养基，并在37℃下培养了16小时。第二天，为了确认插入物(insert)是否插入而分离质粒(plasmid)并用EcoRI和XhoI进行了限制(restriction)。在1％琼脂糖凝胶(agarose gel)上进行电泳而确认了条带。

2.TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体的纯化

将克隆的TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体克隆转化性状至BL21(DE3)大肠杆菌宿主，并将转化体进行0.5mM的IPTG诱导(induction)。将scFv抗体悬浮于裂解缓冲液(lysis buffer)(50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，pH 7.5，150mM的NaCl)，使用超声波粉碎机破碎，然后离心分离以获得上清液。并且使用对Ni-NTA具有亲和力的树脂纯化了蛋白质。通过SDS-PAGE分析确认了表达良好。并且确认了蛋白质大小为约30kDa(图3)。

<实施例5>细胞渗透性抗-酪氨酸酶scFv的细胞毒性试验

为了了解TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体的细胞毒性，将源自小鼠的恶性黑素瘤细胞B16F10细胞在37℃下培养在CO2培养箱中。培养后，分别以不同浓度(0.1ppm、1ppm、5ppm、10ppm、50ppm、100ppm)处理TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体，之后在相同的培养条件下进一步进行了培养。培养完成后，加入MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物)溶液进行培养，然后去除培养液，加入二甲基亚砜(DMSO：Dimethyl sulfoxide)，适当摇晃后，利用酶联免疫吸附测定系统(ELISA Reader system)在570nm处测量吸光度，其值示于表2。如表2所示，当分别以0.1ppm、1ppm、5ppm、10ppm、50ppm、100ppm的浓度处理TAT-α-酪氨酸酶scFv时，确认了直到100ppm为止，恶性黑素瘤细胞的细胞形状和细胞生存率几乎没有变化。因此，可以看出TAT-α-酪氨酸酶scFv在直到100ppm的浓度为止是没有细胞毒性的物质。

[表2]

<实施例6>细胞渗透抗酪氨酸酶scFv对酪氨酸酶活性的抑制效果的实验

研究了TAT-α-酪氨酸酶scFv对有关黑色素生成的酪氨酸酶活性的影响。在5μg的TAT-α-酪氨酸酶scFv中加入100μl的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，并加入10μl的300单位/ml的蘑菇酪氨酸酶，之后，添加20μl的1.5mM的L-酪氨酸溶液，在37℃下反应20分钟后，利用酶联免疫吸附测定系统(ELISA Reader system)测量490nm处的吸光度，其值示于图4。如图4所示，确认了TAT-α-酪氨酸酶scFv抑制了酪氨酸酶活性，并表现出与同一浓度的熊果苷相似的效果。

<实施例7>细胞渗透性抗-酪氨酸酶scFv对黑色素生成量的抑制效果实验

为了确认TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体对细胞中的黑色素产生的阻碍效果，用TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体处理B16F10细胞株，然后测量了细胞中黑色素生成的含量。将恶性黑素瘤细胞B16F10细胞培养在37℃下的CO2培养箱中。之后，处理10ppm的TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体，并作为阳性对照区处理100ppm的熊果苷(arbutin)后，在相同的培养条件下进一步培养。培养后，用PBS洗涤每个孔，向其中加入130μl的1N NaOH溶液，并在60℃下溶解1小时，然后在475nm处用酶联免疫吸附测定系统(ELISA Reader system)测量吸光度，其值示于表3中。如表3所示，确认了TAT-α-酪氨酸酶scFv抑制了黑色素的产生，并表现出与熊果苷相似的效果。

[表3]

<实施例8>细胞渗透性抗-酪氨酸酶scFv的活性氧抑制效果实验

为了确认TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体在细胞内对活性氧的抑制效果，用TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体处理B16F10细胞株，然后使用荧光染色法测量了细胞内活性氧含量。将作为恶性黑素瘤细胞的B16F10细胞培养在了37℃下的CO2培养箱中。之后，处理100ppm的TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体，且作为阳性对照区处理100ppm的熊果苷(arbutin)后，在相同的培养条件下进一步进行了培养。培养后，向每个孔中加入0.2mM过氧化氢，然后进一步培养了2小时。添加羧基-H2DCF-DA并在37℃下反应了30分钟。用PBS洗涤后再添加PBS，在475/535nm下用酶联免疫吸附测定系统(ELISA Reader system)测量了荧光，其值示于表4。如表4所示，确认了TAT-α-酪氨酸酶scFv抑制了ROS的产生，并且比相同浓度的熊果苷表现出优异的效果。

[表4]

<实施例9>细胞渗透性抗酪氨酸酶scFv的皮肤渗透分析

为了确认TAT-α-酪氨酸酶scFv的皮肤渗透，通过使用猪皮进行组织染色而进行了确认。用10μg TAT-α-酪氨酸酶scFv抗体处理猪皮，并在37℃下的CO2培养箱中培养了16小时。用4％甲醛固定猪皮后，制备了石蜡块，利用切片机将组织切除了5μm。之后，将组织装片于载玻片上，去除石蜡并经过水化过程后，将组织切片封闭了30分钟。将封闭后的组织与抗-His HRP抗体(anti-His HRP antibody)在室温下反应了1小时。用PBST洗涤后，与DAB色原体(DAB-chromogen)溶液反应5分钟，然后通过H&E染色法进行染色，用光学显微镜进行了观察。图5示出了α-酪氨酸酶scFv和TAT-α-酪氨酸酶scFv的皮肤渗透性的比较结果。如图5所示，能够确认α-酪氨酸酶scFv完全不递送至猪皮组织中，而TAT-α-酪氨酸酶scFv具有有效的皮肤递送能力。

以上，详细记述了本发明的特定部分，对于本发明所属技术领域的具备普通知识的技术人员来说，这些具体记述仅为优选实现例，本发明的范围并不限于此的这一点是显而易见的。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同物定义。

<110> 哈坞生物科技株式会社

<120> 抑制酪氨酸酶的抗-酪氨酸酶抗体及其用途

<130> OP-2019-0077PCT_CN

<150> KR 10-2019-0096864

<151> 2019-08-08

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR1

<400> 1

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp Val Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR2

<400> 2

Asn Asp Asn Gln

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR3

<400> 3

Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR1

<400> 4

Ser Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR2

<400> 5

Gly Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR3

<400> 6

Arg Asp Ile Ile His Cys Asn Pro Leu Trp Cys Ser Tyr Ala Asp Gly

1 5 10 15

Met Asp Val

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TAT 肽

<400> 7

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAT 肽

<400> 8

tatggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc cgc 33