一种反应性罗丹明B衍生物荧光探针及其制备方法和应用与流程

一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明具体涉及一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针及其制备方法和应用，属于细胞检测分析技术领域。


背景技术：

2.活性氧参与多种生理和病理过程，过氧化氢(h2o2)与次氯酸(clo-)是生物体内两种重要的活性氧，广泛存在于各种生物体内。在正常生理环境条件下，h2o2和clo-通过各自的调控，始终保持在一个相对温馨的浓度状态。
3.核因子κb(nuclear factor kappa-b，nf-κb)蛋白家族可以选择性的结合在 b细胞κ-轻链增强子上调控许多基因的表达。在几乎所有的动物细胞中都能发现nf-κb，它们参与细胞对外界刺激的响应，如细胞因子、辐射、重金属、病毒等。在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中nf-κb起到关键性作用，在此过程中，细胞会分泌大量活性氧物种，如在h2o2，clo-和onoo-等。然而，当 nf-κb通路受到刺激，细胞产生炎症反应，造成氧化应激，就会导致h2o2和 clo-异常表达，对细胞造成损伤，并引发各种常见的临床疾病。因此，为了预防疾病的产生，对细胞内ros的检测就显得至关重要。
4.近十年来，荧光法因其灵敏度高、响应时间快、选择性高、成本低、操作简便等优点而备受关注，更重要的是，使用荧光探针可以可视化体外和体内的检测过程。申请号为cn201611141760.x的专利公开了一种用于检测活性氧化物的纳米荧光探针的制备方法及荧光探针，具体公开了以2,2
’‑
二硫代水杨酸为配体，以1,10-菲啰啉为辅助配体，加入罗丹明6g，以镉离子为中心金属离子进行聚合反应，得到了纳米级的棒状二硫醚配位聚合物作为检测活性氧化物的纳米荧光探针，但是该荧光探针仅用于检测h2o2。目前，h2o2和clo-各自领域的探针研制均取得了显著进展，然而，并没有能够同时针对h2o2和clo-作出不同相应的反应性探针，因此，需要一种具有特定亚细胞细胞器标记能力的近红外 h2o2和clo-探针。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针及其制备方法和应用，通过对罗丹明b衍生物进行改造，合成了一种能够同时针对h2o2和 clo-发生反应的近红外光的荧光分子探针，能够针对两种活性氧产生不同的光学效应，更好地识别出h2o2和clo-。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明的目的在于一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针，其化学结构式如下：
[0008][0009]
本发明的另一目的在于一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
(1)将15.6～20.6mmol 2-(4-二丁基氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与 15.6～20.6mmol 1,6-二羟基萘溶于甲基磺酸与三氟乙酸的混合溶液中，在80～85℃条件下充分反应24～30h后，放置至常温，加入100～120ml去离子水混合；
[0011]
(2)将混合液过滤后用去离子水洗涤多次得到粗产物，将粗产物经硅胶柱层析纯化得到复合物a；
[0012]
其中，复合物a的反应式如下所示：
[0013][0014]
(3)将1～1.2mmol复合物a与1.2～1.5mmol 4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于 10～12ml干燥乙腈中，加入0.5～0.7mmol碳酸铯，在90～95℃避光回流反应3～4h，反应结束后经硅胶柱层析纯化，得到产物荧光探针；
[0015]
其中，产物荧光探针反应式如下：
[0016][0017]
进一步的，所述1,6-二羟基萘溶于甲基磺酸与三氟乙酸的混合溶液为 40～60ml，其中，甲基磺酸与三氟乙酸的体积比为1:1。
[0018]
本发明的另一目的在于提供一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针在炎症细胞过氧化氢和次氯酸盐检测中的应用。
[0019]
本发明的另一目的在于提供一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针在细胞活性、细胞毒性、细胞凋亡的指标检测或特定亚细胞细胞器标记中的应用。
[0020]
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的反应性罗丹明b 衍生物荧光探针能够同时与h2o2和clo-发生反应，并针对两种活性氧产生不同的光学效应，本发明的荧光探针能够与clo-迅速发生反应，产生强烈的荧光，但在短时间内荧光逐渐消失；与
h2o2反应速度相对缓慢，荧光逐渐增强，因此，利用本发明的探针能够较好第识别出h2o2和clo-，能够较好的检测细胞内的活性氧。
[0021]
附图标记
[0022]
图1为根据本发明实施例1制备的荧光探针p1与不同浓度h2o2反应的光学性质分析图；
[0023]
图2为根据本发明实施例1制备的荧光探针p1与1.2mm的h2o2反应不同时间的光学性质分析图；
[0024]
图3为根据本发明实施例1制备的荧光探针p1与1.2mm的clo-反应不同时间的光学性质分析图；
[0025]
图4为根据本发明实施例1制备的荧光探针p1的选择性变化的荧光吸收对比图；
[0026]
图5为根据本发明实施例1制备的不同浓度的荧光探针p1对细胞毒性的分析示意图；
[0027]
图6在根据本发明实施例1制备的荧光探针p1在正常raw264.7细胞中的活细胞成像照片；
[0028]
图7为根据本发明实施例1制备的荧光探针p1在1mg/l lps处理后 raw264.7细胞中的活细胞成像照片。
具体实施方式
[0029]
下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0030]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到且所有商用试剂均为进行进一步纯化；
[0031]
反应中所使用的干燥溶剂均使用分子筛4a型(钠-a型分子筛)或分子筛 3a型(钾-a型分子筛)进行干燥；
[0032]
惰性气氛均使用氩气作为保护气体；
[0033]1h谱在jeol ecz600s(600mhz)光谱仪上记录，使用cdcl3或cd3od作为溶剂；
[0034]
根据内部tms(三甲基硅烷)参考数据，报告了前场化学位移的百万分之一；
[0035]
耦合常数(j)以赫兹(hz)表示，自旋重态用s(单线态)、d(双线态)、t(三重态) 和m(多重态)表示；
[0036]
柱层析采用厚壁玻璃柱和硅胶(300-400目)；采用市售0.25mm硅胶板进行薄层色谱(tlc)，紫外灯显示；
[0037]
使用岛津uv-1900紫外-可见-近红外分光光度计获得溶液中的紫外吸收光谱；荧光光谱采用spectrofluorometer fs5荧光光谱仪测定；质谱在thermofisher 高效液相色谱-质谱联用仪上记录；
[0038]
利用zeiss激光共聚焦显微镜进行细胞荧光成像。
[0039]
实施例1
[0040]
一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0041]
(1)将15.6mmol 2-(4-二丁基氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与15.6mmol 1,6-二羟基萘溶于40ml的甲基磺酸与三氟乙酸的混合溶液中，在80℃条件下充分反应24h后，放置
至常温，加入100ml去离子水混合；其中，混合溶液由甲基磺酸20ml和三氟乙酸20ml构成；
[0042]
(2)将混合液过滤后并用去离子水洗涤多次得到粗产物，将粗产物经硅胶柱层析纯化得到复合物a；
[0043]
(3)将1mmol复合物a与1.2mmol 4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于10ml 干燥乙腈中，加入0.5mmol碳酸铯，在90℃避光回流反应3h，反应结束后经硅胶柱层析纯化，得到产物荧光探针p1。
[0044]
实施例2
[0045]
一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0046]
(1)将20.6mmol 2-(4-二丁基氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与20.6mmol 1,6
‑ꢀ
二羟基萘溶于60ml的甲基磺酸与三氟乙酸混合溶液中，在85℃条件下充分反应30h后，放置至常温，加入120ml去离子水混合，其中，混合溶液由甲基磺酸30ml和三氟乙酸30ml构成；
[0047]
(2)将混合液过滤后并用去离子水洗涤多次得到粗产物，将粗产物经硅胶柱层析纯化得到复合物a；
[0048]
(3)将1.2mmol复合物a与1.5mmol 4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于12ml 干燥乙腈中，加入0.7mmol碳酸铯，在95℃避光回流反应4h，反应结束后经硅胶柱层析纯化，得到产物荧光探针p2。
[0049]
实施例3
[0050]
一种反应性罗丹明b衍生物荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0051]
(1)将18.6mmol 2-(4-二丁基氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸与18.6mmol 1,6
‑ꢀ
二羟基萘溶于50ml的甲基磺酸与三氟乙酸的混合溶液中，在82℃条件下充分反应26h后，放置至常温，加入110ml去离子水混合，其中，混合溶液由甲基磺酸25ml和三氟乙酸25ml构成；
[0052]
(2)将混合液过滤后并用去离子水洗涤多次得到粗产物，将粗产物经硅胶柱层析纯化得到复合物a；
[0053]
(3)将1.1mmol复合物a与1.4mmol 4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于10ml 干燥乙腈中，加入0.6mmol碳酸铯，在92℃避光回流反应3h，反应结束后经硅胶柱层析纯化，得到产物荧光探针p3。
[0054]
实施例4依据实施例1制得的荧光探针p1的光谱测定
[0055]
将p1溶于dmso中，配置10mm的工作母液备用，向3.5ml比色皿中加入3mlpbs和乙腈混合液，pbs:乙腈＝7:3，将3ul p1(10mm)与3ul 10％ pluronic混匀，加入比色皿中，分别测定p1的紫外光谱和荧光光谱；再向比色皿中加入不同浓度梯度的ross(h2o2、clo-、onoo-)、生物体内常见的离子 (k

、ca
2
、mg
2
、cl-、br-、i-、no
2-、hco
3-、co
32-、h2po
4-、po
43-)以及生物硫醇(tbhp、cys、gsh)，测定p1与这些物质反应后的紫外光谱特性以及荧光光谱特性；实验中使用的荧光激发和发射的狭缝均为2nm，扫描2次。
[0056]
参见图1，其中，图1(a)为荧光探针p1与h2o2(0-1.6mm)反应30min的紫外吸收的变化图，由图可知，随着h2o2浓度的升高，荧光探针p1在549nm 处的紫外吸收逐渐增强，当h2o2含量达到荧光探针p1浓度的120倍后，继续加入h2o2，荧光探针p1在549nm处的的紫外吸收不会继续增强；图1(b)为荧光探针p1与h2o2(0-1.6mm)反应30min的荧光吸收变化图，由图可知，随着 h2o2浓度的升高，荧光探针p1在642nm处的荧光逐渐增强，当h2o2含量达到荧光探针p1浓度的120倍后，继续加入h2o2，荧光探针p1在642nm处的荧光不会继续增强；结果证明，
荧光探针p1能够与h2o2发生反应，反应上限为p1 的120倍；
[0057]
参见图2，其中，图2(a)为荧光探针p1与1.2mm h2o2反应30min内的紫外吸收的变化图，由图可知，随着加入h2o2的时间逐渐增加，荧光探针p1在 549nm处的紫外吸收逐渐增强，24min后紫外吸收不再继续升高；图2(b)为荧光探针p1与1.2mm h2o2反应30min内的荧光吸收的变换图，随着加入h2o2的时间逐渐增加，荧光探针p1在642nm处的荧光逐渐增强，24min后荧光不再继续增强；结果证明，荧光探针p1与h2o2的反应需要24min才能达到最理想的发光状态；
[0058]
参见图3，其中，图3(a)为为荧光探针p1与1.2mm clo-反应60min内的紫外吸收的变化图，由图可知，荧光探针p1在加入clo-后，292nm和586nm出的紫外吸收瞬间升高，随着时间的变化，紫外吸收开始逐渐减弱；图3(b)为荧光探针p1与1.2mm clo-反应60min内的荧光吸收的变换图，由图可知，荧光探针p1在加入clo-后，640-660nm出的荧光强度瞬间升高，随着时间的变化，荧光强度开始逐渐减弱；结果证明，荧光探针p1与clo-的反应瞬时即可完成，并伴随时间的延长，光吸收强度逐渐下降。
[0059]
参见图4，图4(a)为荧光探针p1的选择性变化的荧光吸收的对比图(刚加入药品)，图4(b)为荧光探针p1的选择性变化的荧光吸收的对比图；由图可知，荧光探针p1在加入药品后，对clo-有良好的选择性，荧光探针p1在加入药品 30min后，反而对h2o2具有良好的选择性。
[0060]
综上所述，荧光分子探针p1具有同时检测h2o2和clo-的能力，伴随不同的化学效应及不同光学效应，可以较好地识别出h2o2和clo-。
[0061]
实施例5依据实施例1制得的荧光探针p1的cck-8毒性测试
[0062]
将贴壁的raw264.7细胞用培养基把细胞轻轻吹下，低速离心(900rpm/min， 25℃，5min)，除去旧培养基，加入新培养基，吹匀制成细胞悬液后把细胞铺至96孔板中；实验共分成三组，空白组、对照组和实验组；其中，空白组中有培养基、有cck-8溶液、无细胞、无探针；对照组中有细胞、有cck-8溶液、无探针；实验组有细胞、有cck-8溶液、有探针；每孔铺板的细胞量为5
×
103 个，每孔加入培养基200μl，培养24h待细胞贴壁稳固后，向每孔中加入不同浓度的荧光探针(2μm、5μm、8μm、10μm、15μm和20μm)；孵育20min，加入20μl cck-8试剂，置于37℃反应3h后在振荡器上轻轻混匀，放入酶标仪后测定450nm波长吸光度，每一个条件均设置4个重复对照；
[0063]
细胞存活率计算：细胞存活率(％)＝[a(实验组)-a(空白组)]/[a(对照组)
‑ꢀ
a(空白组)]
×
100％。
[0064]
参见图5为不同浓度的荧光探针p1对细胞的毒性大小分析，由图可知，细胞在加入不同浓度的p1刺激24h后，细胞的存活率呈现出显著的差异性，0-8μm 的荧光探针p1对细胞基本不显示毒性，超过10μm后，对细胞产生微弱的毒性。
[0065]
实施例6依据实施例1制得的荧光探针p1的细胞成像
[0066]
将raw264.7细胞铺板至激光共聚焦皿中(5
×
103个细胞)，培养18h后，除去培养基，hbss清洗两遍，除去残余培养基，向激光共聚焦皿中加入10μm 荧光探针p1，避光孵育染色20min；染色结束后，用hbss清洗，除去残留染液，加入hbss后进行成像采集，拍照后向皿中加入不同浓度的h2o2后进行图像采集。
[0067]
参见图6荧光探针p1在正常raw264.7细胞中的活细胞成像照片，由图可知，荧光探
针p1加入后，细胞呈现出红色的荧光，且伴随时间的增加，荧光逐渐增强，加入外缘h2o2后，细胞荧光进一步加强；结果证明，荧光探针p1能够检测到活细胞中的h2o2；
[0068]
参见图7为荧光探针p1在1mg/l lps处理后raw264.7细胞中的活细胞成像照片，由图可知，荧光探针p1加入后，细胞呈现出较强的红色荧光，且伴随时间的增加，荧光逐渐增强，加入外缘h2o2后，细胞荧光进一步加强；结果证明，荧光探针p1能够检测到炎症诱导的活细胞中的h2o2。
[0069]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。