一株具有耐盐促生功能的栖盐田菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及一株栖盐田菌及其应用，尤其涉及一株具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌jp11及其在缓解盐胁迫对水稻生长抑制作用中的应用，属于农业微生物技术领域。


背景技术：

2.土壤盐渍化已经成为农业生态系统的严重威胁。世界上15％至50％的灌溉土地遭受盐碱化，土壤盐渍化对植物生长的抑制作用严重制约了农作物的生产。盐碱土地治理是全世界亟待攻克的重大难题。除了传统的物理和化学方法外，生物治理已经成为盐碱地改良的新方向。其中，利用功能微生物治理盐碱土可以整合环境、生态和经济的综合效益，有效改良盐碱地，提高农作物产量。因此采集、完善高效实用的土壤功能微生物资源具有重要意义。
3.盐碱地土壤高盐、营养贫瘠的特殊生境，蕴藏着许多丰富的适应这种特殊环境的微生物资源，特别是具有高度耐盐特性的植物促生菌株。通过挖掘盐碱地本土耐盐促生功能微生物，并利用它们的解磷、解钾、溶磷、固氮等促生功能，可有效改善植物菌群环境，增加土壤中速效营养元素，加速盐碱地的改良和修复并促进作物生长，从而提高盐碱地土壤利用率。
4.耐盐促生菌通过与植物的互作，为植物提供营养物质，并可有效缓解环境中盐离子对植物的毒害作用。但目前现有技术对耐盐促生菌株的研究较少，可应用于实际生产的菌种资源依然贫乏。具有解钾、解磷和溶磷等多重促生功能的高耐盐可培养微生物，特别是不仅可以在高盐度环境中生存，而且可以有效提高盐碱地土壤的利用率，促进农作物生长的泽书栖盐田菌及其在缓解盐胁迫对农作物生长抑制作用中的应用还未见报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌及其在缓解盐胁迫对水稻生长抑制作用中的应用。
6.本发明所述一株具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌，其特征在于：所述菌株命名为泽书栖盐田菌(salinicola zeshunii)jp11，该菌株已于2021年9月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.23407。
7.上述的具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌，其生物学特征是：菌体形态呈短杆状，单个，细胞大小为(0.5μm～0.8μm)
×
(1.0μm～1.3μm)，不产生孢子。28℃固体培养时菌落为规则的圆形，较小，乳白色，不透明，表面光滑湿润，易挑取，边缘整齐；其生理生化特征是：革兰氏染色阴性，好氧，最适生长温度为28～34℃，最适生长ph值为6.0～8.0，最适盐浓度为6～14％，耐盐范围为1～18％，具有解钾、解磷和溶磷特性。
8.对本发明所述泽书栖盐田菌jp11测定16s rrna基因序列的结果显示，其基因长度为1385bp，相应的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.通过使用美国生物工程信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)blastn程序比对和系统发育分析确定本发明所述菌株jp11是一株泽书栖盐田菌(salinicola zeshunii)。
10.选取同源性比较高的20条序列的16s rdna序列作为参比对象，采用邻近法(neighbour-joining)运用mega 7软件构建菌株jp11与参比菌株之间的系统进化树。在进化树中，菌株jp11与泽书栖盐田菌模式菌株salinicola zeshunii n4形成单独的簇内进化分支(图7)。生理生化结果与模式菌株salinicola zeshunii n4相比大体一致，详见表1。
11.表1菌株jp11与salinicola zeshunii n4的生理生化特征比较
[0012][0013]
注：“ ”表示菌株阳性；
“‑”
表示菌株阴性。
[0014]
上述用于菌体形态观察的液体培养基组成是：每1000ml蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠80g，调节ph至8.0。
[0015]
上述用于菌体形态观察的固体培养基组成是：每1000ml蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠80g，琼脂粉15g，调节ph至8.0。
[0016]
本发明优化出一种适于所述泽书栖盐田菌jp11发酵的液体培养基，其特征在于：所述发酵培养基组成为：每1000ml自来水中含有葡萄糖40g，酵母粉10g，蛋白胨20g，氯化钠80g，硫酸钾2g，氯化钙0.01g，钾长石1g，卵磷脂2g，ph调节至7.5～8.0。
[0017]
本发明所述具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌jp11菌种选育的基本方法是：
[0018]
从黄河三角洲自然保护区盐碱地采集盐地碱蓬根部土壤，振荡混匀制成土壤悬液，梯度稀释涂布于含有8％nacl的lb平板上，28～30℃条件下静置培养，挑取单菌落于相同盐浓度的lb培养平板上，经两次纯化后获得菌种，甘油冻藏保菌。
[0019]
本发明所述具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌在缓解盐胁迫对水稻生长抑制作用中的应用。
[0020]
其中：所述盐胁迫是指土壤中盐浓度质量比不低于3
‰
的农田土壤条件。
[0021]
上述应用涉及的方法是：
[0022]
(1)将活化后的菌株jp11种子液按照体积比2-5％的接种量接种至所述的泽书栖盐田菌发酵液体培养基中，在28～30℃、180rpm条件下培养48-60h，获得含泽书栖盐田菌的菌悬液；
[0023]
(2)水稻种子先用自来水浸泡24
±
2h，取大小一致且饱满的种子，均匀排列在装有等量的浇灌有7
‰
nacl溶液的灭菌营养土的花盆中；将发酵制得的泽书栖盐田菌菌悬液进行不同梯度稀释，分别获得1～5
×
107cfu/ml、1～5
×
108cfu/ml和1～5
×
109cfu/ml三种浓度的泽书栖盐田菌jp11菌悬液；向花盆中分别浇灌等量的三种不同浓度的菌液，同时以灭活菌液为对照；并向所有花盆中浇灌7
‰
nacl溶液；隔天进行一次7
‰
nacl溶液浇灌处理；十天后观察水稻苗期生长情况，并检测水稻根周土壤可溶性钾和可溶性磷的含量。
[0024]
结果表明：施用jp11菌液的水稻幼苗长势明显优于对照组，证明菌株jp11可以明
显缓解盐胁迫对水稻生长抑制作用，同时土壤中可溶性钾含量增加达25.4％，土壤中可溶性磷含量增加达45.9％。
[0025]
进一步的，本发明所述具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌在增加土壤中可溶性钾含量中的应用，其中土壤中可溶性钾含量增加达25.4％。本发明所述具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌在增加土壤中可溶性磷含量中的应用，其中土壤中可溶性磷含量增加达45.9％，其解磷指数和溶磷指数分别为2.4和2.7。
[0026]
本发明公开了一株具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌jp11，所述菌株同时具备高度耐盐及解钾、解磷和溶磷等特性，耐盐范围广泛，在1～18％盐浓度条件下均可保持良好的长势，具有应用于盐碱土壤修复和农业生产中的极大潜力。本发明的创新之处在于，通过多轮筛选，获得一株具有多重促生功能的耐盐菌株，在高盐胁迫下，所述菌株可以缓解盐胁迫对水稻生长的抑制作用，促进水稻生长，同时使土壤中可溶性钾和可溶性磷含量明显增加，分别提高达25.4％和45.9％。本发明在提供所述泽书栖盐田菌jp11的同时还提供了一种适于所述泽书栖盐田菌菌株jp11发酵的液体培养基，利用该培养基可以快速大量的获得具有耐盐促生功能的泽书栖盐田菌jp11，该耐盐促生菌株为盐碱农田土壤修复提供了优良的菌株资源，该菌株及其菌液具有较高的农业应用前景和经济价值。
附图说明
[0027]
本发明所述泽书栖盐田菌(salinicola zeshunii)jp11已于2021年9月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmcc no.23407。
[0028]
图1为泽书栖盐田菌jp11在显微镜下的细胞形态。
[0029]
图2为泽书栖盐田菌jp11在lb固体培养基上的菌落形态。
[0030]
图3为泽书栖盐田菌jp11在不同盐浓度条件下的生长曲线。
[0031]
图4为泽书栖盐田菌jp11的解钾效果图。
[0032]
图5为泽书栖盐田菌jp11的解磷(有机磷)效果图。
[0033]
图6为泽书栖盐田菌jp11的溶磷(无机磷)效果图。
[0034]
图7为泽书栖盐田菌jp11与参比菌株之间的系统进化树。
[0035]
图8为泽书栖盐田菌jp11对水稻苗期促生效果示意图。
[0036]
图9水稻幼苗生长高度统计图。
具体实施方式
[0037]
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
[0038]
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
[0039]
实施例1耐盐泽书栖盐田菌的筛选
[0040]
(1)从黄河三角洲自然保护区盐碱地中采集盐地碱蓬、芦苇等耐盐碱植物的根部土壤样品，装入干净的采样袋，做好标记置于冰盒中带回实验室，并于-20℃保存备用。在无菌超净台中分别称取1g土样置于含有玻璃珠及20ml无菌水的100ml的三角瓶中，于28℃、
180rpm振荡培养箱中培养1小时，使土样充分打散混匀。在无菌条件下，分别吸取0.5ml土壤悬浊液于4.5ml无菌水中充分混匀，然后依次梯度稀释，制成10-1
、10-2
、10-3
不同稀释度的样品溶液，分别吸取0.2ml样品溶液并涂布于耐盐筛选固体培养基平板上，于28℃恒温培养箱中倒置培养2～4天，至有明显的单菌落产生。分别挑取单菌落转接至相同的固体培养基平板上并依次进行编号后培养，转接划线两次后，分别相应获得纯培养菌株单菌落。
[0041]
(2)用接种环挑取单菌落，转接到装有5ml耐盐筛选液体培养基的试管中，在28℃、180rpm条件下振荡培养24h，分别进行菌株保藏和生理生化分析。菌株保藏方法采用甘油管冷冻保藏法，向冻藏管中分别加入200μl甘油和800μl的菌液，混合均匀后放置-80℃超低温冰箱中保存。
[0042]
在筛选菌株中，有一株菌体形态呈短杆状，细胞大小为(0.5μm～0.8μm)
×
(1.0μm～1.3μm)，不产生孢子。28℃固体培养时菌落为规则的圆形，较小，乳白色，不透明，表面光滑湿润，易挑取，边缘整齐；革兰氏染色阴性，好氧，最适生长温度为28～34℃，最适生长ph值为6.0～8.0，最适盐浓度为6～14％，耐盐范围为1～18％，具有解钾、解磷和溶磷特性。该菌株编号为jp11，初步确定为本发明选定菌株。
[0043]
上述耐盐筛选固体培养基组成是：每1000ml蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠80g，琼脂粉15g，调节ph至7.5～8.0。
[0044]
上述耐盐筛选液体培养基组成是：每1000ml蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠80g，调节ph至7.5～8.0。
[0045]
实施例2菌株jp11形态观察及生理生化特征鉴定
[0046]
采用尼康倒置显微镜的油镜对菌株jp11的形态进行观察。
[0047]
菌株jp11生理生化特征鉴定试验培养温度均设为28℃。同时分析菌株jp11在lb固体培养基上生长时的最适温度、最适生长ph值及最适盐浓度。
[0048]
菌株jp11的生物学特征是：呈杆状，单个，细胞大小为(0.5μm～0.8μm)
×
(1.0μm～1.3μm)，不产生孢子(图1)。28℃固体培养时菌落为规则的圆形，突起，乳白色，不透明，表面光滑湿润，易挑取，边缘整齐(图2)。
[0049]
菌株jp11的生理生化特征是：革兰氏染色阴性，好氧，过氧化氢酶、脲酶、苯丙氨酸脱氨酶、甲基红试验和尿素水解试验呈现阳性，淀粉水解、明胶水解、几丁质水解试验呈现阴性。最适生长温度为28～34℃，最适生长ph值为6.0～8.0，最适盐浓度为6～14％，耐盐范围为1～18％(图3)。
[0050]
对本发明所述菌株jp11测定16s rrna基因序列的结果显示，其基因长度为1385bp，相应的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0051]
通过使用美国生物工程信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)blastn程序比对和系统发育分析确定本发明所述菌株jp11是一株泽书栖盐田菌(salinicola zeshunii)。
[0052]
选取同源性比较高的20条序列的16s rdna序列作为参比对象，采用邻近法(neighbour-joining)运用mega 7软件构建菌株jp11与参比菌株之间的系统进化树。在进化树中，菌株jp11与泽书栖盐田菌的模式菌株salinicola zeshunii n4形成单独的簇内进化分支(图7)。生理生化结果与模式菌株salinicola zeshunii n4相比大体一致，详见表1。
[0053]
表1菌株jp11与salinicola zeshunii n4的生理生化特征比较
[0054][0055]
注：“ ”表示菌株阳性；
“‑”
表示菌株阴性。
[0056]
上述用于菌体形态观察的液体培养基组成是：每1000ml蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠80g，调节ph至8.0。
[0057]
上述用于菌体形态观察的固体培养基组成是：每1000ml蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠80g，琼脂粉15g，调节ph至8.0。
[0058]
实施例3菌株jp11解钾、解磷和溶磷等促生效果分析
[0059]
将分离获得的菌株jp11单菌落转接到装有5ml液体培养基的试管中，在28℃、180rpm条件下振荡培养24h，取5μl种子液点接于硅酸盐细菌培养基平板上，于28℃恒温培养箱中培养3天，观察硅酸盐细菌培养基平板上是否有透明油滴状菌落出现。结果表明，菌株jp11在硅酸盐细菌固体培养基培养2天后，平板上长出透明油滴状菌落，表明菌株jp11能够溶解钾长石，具有解钾特性(图4)。
[0060]
将分离获得的菌株jp11单菌落转接到装有5ml液体培养基的试管中，在28℃、180rpm条件下振荡培养24h，取5μl种子液点接于蒙金娜有机磷固体培养平板上，于28℃恒温培养箱中培养，观察菌落周围是否有降解透明圈。结果显示，菌株jp11在蒙金娜有机磷固体培养基培养2天后，菌落周围出现明显的降解透明圈，继续培养，降解圈显著增大，表明菌株jp11能够快速溶解有机磷，具有较强的解磷特性(表2和图5)。
[0061]
将分离获得的菌株jp11单菌落转接到装有5ml液体培养基的试管中，在28℃、180rpm条件下振荡培养24h，取5μl种子液点接于蒙金娜无机磷固体培养平板上，于28℃恒温培养箱中培养。培养6天后，菌落周围产生较清晰的透明降解圈，表明菌株jp11可溶解无机磷，具有溶磷特性(图6和表3)。
[0062]
表2菌株jp11的解磷性分析
[0063]
菌株解磷圈直径(d)/mm菌落直径(d)/mm解磷指数(d/d)jp1124102.4
[0064]
表3菌株jp11的溶磷性分析
[0065]
菌株溶磷圈直径(d)/mm菌落直径(d)/mm溶磷指数(d/d)jp11832.7
[0066]
上述硅酸盐细菌培养基的组分及浓度是：5g l-1
蔗糖、0.5g l-1
(nh4)2so4、0.5g l-1
酵母提取物、0.3g l-1
mgso4.7h2o、2g l-1
na2hpo4、0.03g l-1
feso4.7h2o、0.03g l-1
mnso4.h2o、2g l-1
钾长石、15g l-1
琼脂。
[0067]
上述蒙金娜有机磷培养基的组分及浓度是：10g l-1
葡萄糖、0.5g l-1
(nh4)2so4、0.3g l-1
nacl、0.3g l-1
mgso4.7h2o、0.03g l-1
mnso4.h2o、0.3g l-1
kcl、0.03g l-1
feso4.7h2o、2.0g l-1
卵磷脂、15g l-1
琼脂。
[0068]
上述蒙金娜无机磷培养基的组分及浓度是：10g l-1
葡萄糖、0.5g l-1
(nh4)2so4、
0.3g l-1
nacl、0.3g l-1
mgso4.7h2o、0.03g l-1
mnso4.h2o、0.3g l-1
kcl、0.03g l-1
feso4.7h2o、5.0g l-1
ca3(po4)2、15g l-1
琼脂。
[0069]
实施例4菌株jp11的16s rrna基因鉴定方法
[0070]
根据bioteke细菌基因组提取试剂盒的操作说明，提取分离纯化的菌株jp11的总基因组dna。提取的总基因组dna采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳电压175v，电泳时间20分钟。选用上游引物27f(5
’‑3’
：agagtttgatcctggctcag)和下游引物1492r(5
’‑3’
：ggttaccttgttacgactt)扩增分离菌株的16s rrna基因，pcr反应体系和条件如表4和表5所示：
[0071]
表4纯化的菌株jp11的16s rrna基因pcr反应体系
[0072]
试剂体积10
×
ex taq buffer5μldntp(10mm)1μl27f primer(25μm)1μl1492r primer(25μm)1μlextaq dna polymerase0.5μltemplate dna0.5μldh2o41μl
[0073]
表5pcr反应程序设置
[0074]
步骤温度时间循环数denature95℃5min1denature95℃30s30anneal55℃30s30elongate72℃90s30elongate72℃10min1halt reaction4℃
ꢀꢀ
[0075]
pcr产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳电压175v，电泳时间20分钟。使用凝胶成像仪观察，16s rrna基因的pcr在1.5kbp marker条带位置附近，切下所需条带后，根据琼脂糖凝胶回收试剂盒的操作说明，对pcr产物进行纯化回收。纯化回收后的pcr产物送往测序公司进行测序。
[0076]
对菌株jp11测定16s rrna基因序列的结果显示，其基因长度为1385bp，相应的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0077]
将测序所得的16s rrna基因序列递交到ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行blastn比对，结果显示该菌株的16s rrna与泽书栖盐田菌salinicola zeshunii n4相似性为99％。选取同源性比较高的20条序列的16s rdna序列作为参比对象，采用邻近法(neighbour-joining)运用mega 7软件构建菌株jp11与参比菌株之间的系统进化树。在进化树中，菌株jp11与泽书栖盐田菌模式菌株salinicola zeshunii n4形成单独的簇内进化分支(图7)，确定本发明所述菌株jp11是一株泽书栖盐田菌(salinicola zeshunii)，因此，将其命名为泽书栖盐田菌jp11。
[0078]
实施例5菌株jp11在缓解盐胁迫对水稻生长抑制作用中的应用方法
[0079]
(1)菌种选择：泽书栖盐田菌菌株jp11。
[0080]
(2)菌种活化：将菌种接种于固体平板培养基，28～30℃条件下静置培养24～48h，备用。
[0081]
(3)种子培养：挑取步骤(2)中的菌落接种于含有5ml液体种子培养基中，于28～30℃180rpm条件下培养24～30h。
[0082]
(4)发酵培养：以2％接种量将种子液接种至含有100ml发酵培养基的三角瓶(500ml)中，于28～30℃、180rpm条件下培养48h，获得含泽书栖盐田菌的菌悬液，备用。
[0083]
(5)缓解盐胁迫对水稻生长抑制作用及对土壤中可溶性钾和磷的检测：水稻种子先用自来水浸泡24
±
2h，取大小一致且饱满的种子，均匀排列在装有等量的浇灌有7
‰
nacl溶液的灭菌营养土的花盆(30cm
×
24cm
×
9cm)中；将发酵制得的泽书栖盐田菌菌悬液进行不同梯度稀释，分别获得1～5
×
107cfu/ml、1～5
×
108cfu/ml和1～5
×
109cfu/ml三种浓度的泽书栖盐田菌jp11菌悬液；向花盆中分别浇灌等量的三种不同浓度的菌液，同时以灭活菌液为对照；并向所有花盆中浇灌7
‰
nacl溶液；隔天进行一次7
‰
nacl溶液浇灌处理；十天后观察水稻苗期生长情况，并检测水稻根周土壤可溶性钾和可溶性磷的含量。每个处理三个重复，每个重复放置40粒水稻种子。
[0084]
结果显示，水稻在持续浇灌7
‰
nacl溶液的盐胁迫条件下，实验组水稻苗期长势明显优于对照组，证明菌株jp11可以明显缓解盐胁迫对水稻生长抑制作用，其中施用菌液浓度为1～5
×
108cfu/ml的水稻幼苗长势最佳(图8)。生长15天时，对照组仅有20％幼苗高度大于20cm，而实验组(1～5
×
108cfu/ml)中50％的水稻幼苗高度大于20cm(图9)。通过测定水稻根周土壤理化指标发现(表6)，添加jp11菌液的水稻根周土壤中可溶性钾和可溶性磷含量与对照组相比均有显著增加，土壤中可溶性钾含量增加最高达25.4％，土壤中可溶性磷含量增加最高达45.9％。
[0085]
表6水稻根周土壤中可溶性磷和可溶性钾检测结果
[0086][0087]
上述菌种活化固体培养基组成为：每1000ml蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠80g，琼脂粉15g，调节ph至8.0；
[0088]
上述液体种子培养基组成为：每1000ml蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠80g，调节ph至8.0；
[0089]
上述泽书栖盐田菌菌株jp11的最适发酵培养基组成为：每1000ml自来水中含有葡萄糖40g，酵母粉10g，蛋白胨20g，氯化钠80g，硫酸钾2g，氯化钙0.01g，钾长石1g，卵磷脂2g，调节ph至7.5～8.0。