土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法与流程

1.本发明涉及一种抗生素的检测方法，具体涉及一种土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法，属于环境检测技术领域。


背景技术：

2.抗生素作为一种治疗感染性疾病的药物，被誉为20世纪最重要的发现之一，在人兽疾病治疗和预防以及禽畜饲养添加剂方面广泛使用。近年来，由于抗生素使用日益广泛并不断释放到环境中，抗生素的环境污染问题得到了广泛关注。据报道，抗生素在污水、地表水、饮用水、土壤和沉积物等环境中均有不同程度的检出，对生态环境和人类健康具有潜在的影响。近海沉积物是吸附累积抗生素的重要归趋，但是由于近海沉积物中抗生素的含量水平总体相对较低，且基质复杂，所以抗生素的含量检测难度较高。因此，发展高效、快速、可靠的前处理技术和检测分析方法，是开展环境中抗生素诸多研究课题的关键。目前，针对土壤和沉积物中抗生素的检测分析的样品前处理方法和仪器分析方法适用范围窄，且通常处理程序繁琐耗时，因此，建立一种能够快速且同时检测土壤样品和沉积物样品中多种抗生素的方法尤为重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法。
4.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、标准曲线绘制以甲醇为溶剂，分别配制抗生素单标准溶液和不同质量浓度的抗生素混合标准溶液，以峰面积为纵坐标，以目标物的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线；步骤2、土壤样品和沉积物样品前处理将土壤样品或沉积物样品先冷冻干燥，然后研磨过筛，之后准确称取2g土壤样品或沉积物样品待用；步骤3、萃取向称好的2g土壤样品或沉积物样品中加入20ml cs-乙腈提取液和100μl体积浓度为1%的乙酸溶液，超声萃取30min；步骤4、盐析向超声萃取后的溶液中加入4g无水硫酸镁和1g柠檬酸三钠，进行盐析离心分层，最后取上清液5ml至棕色玻璃瓶中；步骤5、氮吹浓缩定容将上清液氮吹近干后用适量甲醇溶解，经滤膜过滤后转移至进样瓶中，再次氮吹
近干后加甲醇溶解定容至1ml，得到土壤样品溶液或沉积物样品溶液；步骤6、高效液相色谱串联质谱测定利用高效液相色谱串联质谱测定目标物色谱峰面积；步骤7、外标法定量基于高效液相色谱串联质谱检测出的目标物色谱峰面积，通过步骤1绘制出的标准曲线计算土壤样品溶液或沉积物样品溶液中抗生素的浓度。
5.前述的土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法，其特征在于，在步骤1中，前述抗生素包括：金霉素、去甲金霉素、强力霉素、土霉素、四环素、磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、环丙沙星、洛美沙星、诺氟沙星、阿奇霉素、林可霉素、罗红霉素、螺旋霉素、泰乐菌素、阿莫西林、青霉素g、青霉素v和氯霉素，共计25种。
6.前述的土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法，其特征在于，在步骤2中，土壤样品和沉积物样品研磨后过100目筛。
7.前述的土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法，其特征在于，在步骤3中，前述cs-乙腈提取液是采用如下方法配制而成的：（1）配制质量浓度为50%的硝酸镁溶液和体积浓度为2.5%的氨水溶液，将二者按照体积比96:4混合，得到硝酸镁-氨水混合液；（2）取10.56g磷酸二氢钠和0.82ml磷酸加水溶解并稀释至1l，得到磷酸盐溶液；取80.0g乙二胺四乙酸二钠溶解至1l磷酸盐溶液中，得到乙二胺四乙酸二钠-磷酸盐混合液；将乙二胺四乙酸二钠-磷酸盐混合液与乙腈按照体积比1:1混合，得到乙腈混合液；（3）将上述乙腈混合液与硝酸镁-氨水混合液按照体积比3:1混合，得到cs-乙腈提取液。
8.前述的土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法，其特征在于，在步骤4中，盐析离心分层的具体操作如下：向超声萃取后的溶液中加入无水硫酸镁和柠檬酸三钠后，立即强力振摇3min，再超声10min，然后以5000r/min的转速离心10min，最后取上清液。
9.前述的土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法，其特征在于，在步骤6中，高效液相色谱是在如下条件下进行的：色谱柱为waters-acquity uplc beh c18，规格为100*2.1mm、1.7μm；柱温为35℃；流动相a为含有0.01%甲酸的水溶液，流动相b为100%乙腈溶液；进样体积为5μl，流动相流速为0.5ml/min；每个样品检测时间为15min，流动相洗脱程序见下表：
前述的土壤样品和沉积物样品中抗生素的快速高通量检测方法，其特征在于，在步骤6中，串联质谱是在如下条件下进行的：选择电喷雾离子源，同时进行正离子模式和负离子模式扫描检测；离子喷雾电压：正离子模式5500v，负离子模式-4500v；气帘气压力为40psi；喷雾气压力为55psi；辅助加热气压力为55psi，25种抗生素的质谱检测参数见下表：
本发明的有益之处在于：本发明提供的检测方法，通过优化quechers前处理方法，使用能够提高目标抗生素的溶解度的提取液和盐析剂，并结合高效液相色谱串联质谱检测，可同时提取和检测土壤样品和沉积物样品中25种抗生素，并且操作简单、快速，检出限低，稳定性好，检测效率高，基本能够满足土壤和沉积物中多种抗生素同时检测的需求。
附图说明
10.图1是表1所示的25种抗生素的混合标准溶液（100μg/l）的总离子色谱图；图2是表1所示的25种抗生素在不同提取条件下的回收率计算结果图；图3是表1所示的25种抗生素在不同盐析条件下的回收率计算结果图。
具体实施方式
11.本发明提供的检测方法，可以同时并且快速的检测土壤样品和沉积物样品中25种抗生素（25种抗生素的信息见表1），具体包括以下步骤：标准曲线绘制、土壤样品和沉积物样品前处理、萃取、盐析、氮吹浓缩定容、高效液相色谱串联质谱测定、外标法定量。
12.表1 25种抗生素的信息
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
13.一、检测辽东湾近海表层沉积物样品中25种抗生素的浓度步骤1、标准曲线绘制以甲醇为溶剂，分别配制质量浓度为1000mg/l的抗生素单标准溶液，于-20℃储
存。
14.以甲醇为溶剂，配制质量浓度为1mg/l的抗生素混合标准溶液，于-20℃储存。
15.将上述质量浓度为1mg/l的抗生素混合标准溶液用甲醇稀释，配成质量浓度分别为0.1μg/l、0.5μg/l、1μg/l、2μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l、40μg/l、100μg/l的抗生素混合标准溶液。
16.以峰面积为纵坐标（y），以目标物的质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线。
17.步骤2、沉积物样品前处理2018年8月29日，于辽东湾近海采集表层沉积物样品，沉积物样品采集后于-20℃冷冻避光保存。
18.将冷冻避光保存的沉积物样品先冷冻干燥，然后研磨过100目筛，之后准确称取2g沉积物样品待用。
19.步骤3、萃取1、优化提取液选取cs和edta-mcilvaine两种缓冲液以及乙腈和乙腈：甲醇/3:1两种萃取剂，将缓冲液与萃取剂两两组合，得到4种组合方案：（1）cs缓冲液-乙腈组合方案；（2）cs缓冲液-乙腈：甲醇/3:1组合方案；（3）edta-mcilvaine缓冲液-乙腈组合方案；（4）edta-mcilvaine缓冲液-乙腈：甲醇/3:1组合方案。
20.对于cs缓冲液-乙腈组合方案：先配制cs-乙腈提取液，然后向称好的2g沉积物样品中加入20ml cs-乙腈提取液和100μl体积浓度为1%的乙酸溶液，超声萃取30min。
21.对于cs缓冲液-乙腈：甲醇/3:1组合方案：先配制cs-乙腈/甲醇提取液，然后向称好的2g沉积物样品中加入20ml cs-乙腈/甲醇提取液和100μl体积浓度为1%的乙酸溶液，超声萃取30min。
22.对于edta-mcilvaine缓冲液-乙腈组合方案：先配制edta-mcilvaine缓冲液，然后向称好的2g沉积物样品中加入10ml edta-mcilvaine缓冲液，涡旋1min，之后加入10ml乙腈，涡旋1min，最后加入100μl体积浓度为1%的乙酸溶液，超声萃取30min。
23.对于edta-mcilvaine缓冲液-乙腈：甲醇/3:1组合方案：先配制edta-mcilvaine缓冲液，然后向称好的2g沉积物样品中加入10ml edta-mcilvaine缓冲液，涡旋1min，之后加入10ml乙腈：甲醇/3:1，涡旋1min，最后加入100μl体积浓度为1%的乙酸溶液，超声萃取30min。
24.其中，cs-乙腈提取液是采用如下方法配制而成的：（i）配制质量浓度为50%的硝酸镁溶液和体积浓度为2.5%的氨水溶液，将质量浓度为50%的硝酸镁溶液与体积浓度为2.5%的氨水溶液按照体积比96:4混合，得到硝酸镁-氨水混合液；（ii）取10.56g磷酸二氢钠和0.82ml磷酸加水溶解并稀释至1l，得到磷酸盐溶液（spb）；取80.0g乙二胺四乙酸二钠溶解至1l spb中，得到乙二胺四乙酸二钠-磷酸盐混合液；将乙二胺四乙酸二钠-磷酸盐混合液与乙腈按照体积比1:1混合，得到乙腈混合液；（iii）将上述乙腈混合液与硝酸镁-氨水混合液按照体积比3:1混合，得到cs-乙腈
提取液。
25.cs-乙腈/甲醇提取液是采用如下方法配制而成的：（i）配制质量浓度为50%的硝酸镁溶液和体积浓度为2.5%的氨水溶液，将质量浓度为50%的硝酸镁溶液与体积浓度为2.5%的氨水溶液按照体积比96:4混合，得到硝酸镁-氨水混合液；（ii）取10.56g磷酸二氢钠和0.82ml磷酸加水溶解并稀释至1l，得到磷酸盐溶液（spb）；取80.0g乙二胺四乙酸二钠溶解至1l spb中，得到乙二胺四乙酸二钠-磷酸盐混合液；将乙腈与甲醇按照体积比3:1混合后再与乙二胺四乙酸二钠-磷酸盐混合液按照体积比1:1混合，得到乙腈/甲醇混合液；（iii）将上述乙腈/甲醇混合液与硝酸镁-氨水混合液按照体积比3:1混合，得到cs-乙腈/甲醇提取液。
26.edta-mcilvaine缓冲液是采用如下方法配制而成的：将12.9g柠檬酸、27.5g磷酸氢二钠和37.2g乙二胺四乙酸二钠加水溶解并定容至1l，得到edta-mcilvaine缓冲液（ph=4.0）。
27.4种组合方案对应的25种抗生素的加标回收率计算结果见图2。
28.由图2可知，对于大部分抗生素而言，以乙腈作萃取剂的组合方案比以乙腈：甲醇/3:1作萃取剂的组合方案对抗生素具有更好的回收率。提取液的ph值与抗生素的pka相近时，抗生素处于等电状态，在提取液中的溶解度高，与edta-mcilvaine缓冲液相比，cs缓冲液的ph相对较低，与大部分抗生素的pka相近，cs缓冲液不仅可以提高抗生素的溶解度，还可以防止抗生素发生水解，大环内酯类抗生素相较于其他种类抗生素pka高，因此，除大环内酯类抗生素，其他种类的大部分抗生素在cs缓冲液中的回收率都较高。
29.综合各抗生素的回收率，最终确定cs缓冲液-乙腈组合方案是本发明最优选的提取方案。
30.2、用cs-乙腈提取液萃取抗生素（cs缓冲液-乙腈组合方案）向称好的2g沉积物样品中加入20ml cs-乙腈提取液和100μl体积浓度为1%的乙酸溶液，超声萃取30min。
31.步骤4、盐析1、优化盐析剂通过加入吸水剂和盐析剂进行盐析离心分层，可促使水相和有机相分离，同时还可调节缓冲体系的酸碱度，以获得更好的回收率。
32.选取无水硫酸镁作吸水剂，选取分别可使缓冲体系ph相对较低、相对较高和相对适中的氯化钠、乙酸钠和柠檬酸三钠三种盐作盐析剂，将吸水剂与盐析剂按照质量比4:1组合对超声萃取后的溶液进行盐析离心分层，三种盐析剂对25种抗生素的回收率的影响结果见图3。
33.由图3可知，相较而言，选择柠檬酸三钠作为盐析剂时，25种抗生素的回收率普遍较为理想。
34.2、用柠檬酸三钠对溶液进行盐析向超声萃取后的溶液中加入4g无水硫酸镁和1g柠檬酸三钠，立即强力振摇3min，再超声10min，然后以5000r/min的转速离心10min，最后取上清液5ml至棕色玻璃瓶中。
35.步骤5、氮吹浓缩定容将上清液氮吹近干后用适量甲醇溶解，经0.22μm滤膜过滤后转移至1.5ml进样瓶中，再次氮吹近干后加甲醇溶解定容至1ml，得到样品溶液，将样品溶液保存于-20℃等待检测。
36.步骤6、高效液相色谱串联质谱测定高效液相色谱串联质谱测定是在如下条件下进行的：（1）色谱柱为waters-acquity uplc beh c18（100*2.1mm，1.7μm）；柱温为35℃；流动相a为含有0.01%甲酸的水溶液，流动相b为100%乙腈溶液；进样体积为5μl，流动相流速为0.5ml/min；每个样品检测时间为15min，流动相洗脱程序见表2；（2）串联质谱选择电喷雾离子（esi）源，同时进行正离子模式和负离子模式扫描检测；离子喷雾电压：5500v（正离子模式），-4500v（负离子模式）；气帘气（curtain gas，cur）压力为40psi；喷雾气（ion source gas 1，gs1）压力为55psi；辅助加热气（ion source gas 2，gs2）压力为55psi。25种抗生素的质谱检测参数见表3。
37.表2流动相洗脱程序表3 25种抗生素的质谱检测参数
步骤7、外标法定量基于高效液相色谱串联质谱检测出的目标物色谱峰面积，通过步骤1绘制出的标准曲线计算样品溶液中抗生素的浓度。经计算，辽东湾表层沉积物样品中25种抗生素的浓度如表4所示。
38.表4 2018年辽东湾表层沉积物样品中25种抗生素的浓度（μg/kg）
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nd代表未检出。
39.由表4可以看出，14种抗生素（ctc、dmctc、doc、tc、scz、sft、smx、cip、lfx、nof、atm、rxm、amc、cpc）在辽东湾表层沉积物样品中的检出率均超过了30%。
40.由此可见，本发明提供的检测方法能够同时检测辽东湾表层沉积物样品中25种抗
生素，检测效率高，可以用于海洋沉积物中25种抗生素的同时检测。
41.二、方法验证1、检出限和定量限25种抗生素在一定浓度范围内呈良好的线性关系，以信噪比s/n＝3计算仪器检出限（lod），s/n＝10计算仪器定量限（loq），方法的检出限（mdl）由以下公式计算得到：mdl=lod
·
v/（r
·
m）其中，v为样品定容体积；r为回收率；m为萃取的样品质量。
42.辽东湾近海表层沉积物样品中25种抗生素线性范围、相关系数、仪器检出限、仪器定量限和方法检出限的计算结果如表5所示。
43.表5 25种抗生素线性范围、相关系数、仪器检出限、仪器定量限和方法检出限
2、检测方法的准确度和精密度以目标物浓度极低的沉积物作为对照组，且将其浓度作为空白控制的基线值。分别添加5μg/kg（低浓度）和25μg/kg（高浓度）2个不同浓度的目标物，每个浓度设置3个平行样，用上述检测方法检测沉积物中25种抗生素的浓度，并计算25种抗生素的平均加标回收率和相对标准偏差。
44.经计算，25种抗生素的平均加标回收率和相对标准偏差如表6所示。
45.表6 25种抗生素的平均加标回收率和相对标准偏差
由表6可知，除磺胺嘧啶（sdz）、环丙沙星（cip）、诺氟沙星（nof）外，沉积物样品中其他22种抗生素的平均加标回收率为40.35～142.92%，除磺胺间二甲氧嘧啶（sft）、磺胺甲恶唑（smx）、螺旋霉素（sry）外，其他22种抗生素的相对标准偏差均小于20%。
46.也就是说，本发明提供的检测方法检出限低，回收率高，稳定性好，能够同时检测沉积物样品中25种抗生素，操作简单快速，检测效率高，基本能够满足沉积物中多种抗生素同时检测的需求。
47.三、检测河南、湖南、云南、浙江、辽宁、福建六个地方36个采样点的森林和农田土壤样品中25种抗生素的浓度以目标物浓度极低的土壤作为对照组，且将其浓度作为空白控制的基线值。添加25μg/kg的目标物，设置3个平行样，用上述检测辽东湾近海表层沉积物样品中25种抗生素浓度的方法，检测河南、湖南、云南、浙江、辽宁、福建六个地方36个采样点的森林和农田土壤中25种抗生素的浓度，并计算25种抗生素的平均加标回收率和相对标准偏差。
48.方法的检出限（mdl）由以下公式计算得到：mdl=lod
·
v/（r
·
m）其中，v为样品定容体积；r为回收率；m为萃取的样品质量。
49.经计算，土壤样品中25种抗生素的平均加标回收率、相对标准偏差和方法检出限如表7所示。
50.表7 土壤样品中25种抗生素的平均加标回收率（加标浓度25μg/kg）、相对标准偏差和方法检出限
由表7可知，除土霉素（otc）和螺旋霉素（sry）外，土壤样品中其他23种抗生素的平均加标回收率为38.96～118.68%，除螺旋霉素（sry）和泰乐菌素（tyl）外，其他23种抗生素的相对标准偏差均小于20%。
51.利用本发明方法对2020年河南、湖南、云南、浙江、辽宁、福建六个地方36个采样点
的森林和农田土壤样品中25种抗生素进行检测分析，结果如表8所示。
52.表8 2020年中国各地区土壤样品中25种抗生素的浓度（μg/kg）浓度（μg/kg）由表8可知，本发明提供的检测方法既可以用于检测海洋沉积物样品中的25种抗
生素的浓度，也可以用于检测土壤样品中的25种抗生素的浓度。
53.需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。