一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法与流程

1.本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法。


背景技术：

2.人参皂苷(ginsenoside)是一类固醇类化合物，又称三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是人参中的活性成分，具有抗血栓、抗疲劳、抗衰老、控制肿瘤、增强免疫力等诸多作用，其中的人参皂苷rg1具有快速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用等作用，人参皂苷rf则可使乙酰胆碱引起的肠管收缩减弱，并具有溶血活性等作用。而人参皂苷多天然存在五加科植物中的根、花蕾、茎中，例如人参、三七、西洋参等，但是这些植物中的人参皂苷的含量较低，其提取成本较高，难以满足日益增长的医药需求。


技术实现要素：

3.因此，基于以上背景，本发明提供一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，通过富含氨基酸残基，酰胺，辅酶和乳酸，亚油酸等活性基团的复合生物酶制剂制备出富皂苷制剂和富皂苷糖浆等人参皂苷制剂。
4.本发明提供的技术方案为：
5.一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，其包括如下步骤：
6.(1)选取复合生物酶制剂，所述生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌发酵制成；
7.(2)将步骤(1)的生物酶制剂直接加热；或加入糖浆后搅拌均匀后进行加热浓缩，即可制备得到人参皂苷制剂。
8.进一步地，所述人参皂苷制剂包括富皂苷制剂、富皂苷糖浆的至少其中一种；
9.其制备包括如下步骤：
10.(1)选取复合生物酶制剂，所述生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌发酵制成；
11.(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照0
‑
100％的体积比加入糖浆并搅拌均匀；
12.(3)将步骤(2)的混合料进行加热浓缩；
13.(4)当步骤(2)的混合料中的蒸发后量达到原混合料体积的1/3
‑
2/5时，则可制备得到富皂苷制剂；
14.(5)对步骤(4)的富皂苷制剂继续加热，直至蒸发后体积至步骤(2)的糖浆的所加入量时，将料进行冷却后，则可制得富皂苷糖浆。
15.进一步地，所述复合生物酶制剂的制备步骤如下：
16.(1)选用酵母、乳酸菌联合菌作菌种；
17.(2)菌种活化：将无菌水按照重量比1:1濡湿土豆泥雪花粉，再按照1:2的重量比将菌种与濡湿后的土豆泥雪花粉混合后，在无菌环境下进行有氧活化；
18.(3)培养基的制备和接种：所述培养基以土豆泥雪花粉、小麦胚芽、糯米为主料配
制而成，将培养基加水后搅拌均匀后，蒸熟，然后无菌环境下晾至摄氏45度以下即培养基制备完成；
19.将制备的培养基与步骤(2)活化后的菌种按照重量比10：1的比例进行混合均匀；
20.(4)对步骤(3)接种后的培养基的湿度进行调节，保证握团有水渍出，培养基整体保持湿润透气；
21.(5)将步骤(4)的培养基进行有氧发酵48小时以上；当培养基出现均匀肉眼可见的白色、乳白色菌斑时，将培养基转入发酵罐中；固态发酵物占据发酵罐的三分之一即可，并封闭发酵罐的所有通道，以使得入罐的培养基发酵物在罐体中继续有氧培养，直至耗尽罐体中的氧气，自行进入无氧发酵状态；
22.(6)当发酵罐内压力无变化时，固态发酵物进入饱和发酵，开罐有浓郁的酵香味溢出，肉眼观察有丰茂的菌丝体覆盖在固态培养基表面，取发酵产物进行检测，酵母菌活菌总数6.4
×
104‑
5.9
×
105cfu/ml；乳酸菌总数4
×
108‑
5.1
×
109cfu/ml，此时固态发酵过程已经达到饱和，可以进入液态发酵阶段；
23.(7)将步骤(6)的固态发酵物按照质量比1:3的比例加入无菌水，并充分搅拌，以稀释固态发酵过程中的代谢底物，并确保发酵罐体至少有1/5的空间，进行有氧活化培养72小时以上，直至液态发酵物表面密布白色或乳白色菌斑时，即可封闭发酵罐所有通道，再次让发酵物逐渐耗尽氧气进入无氧发酵过程；
24.(8)当步骤(7)的液态发酵物表面菌斑折叠态，中上层清液呈现金黄色，清澈透明，底层固态发酵物和中层液体层次分明不粘连时，即固态发酵
–
液态发酵过程全部完成；所得发酵产物即可为制得的生物酶制剂。
25.进一步地，所述生物酶制剂的制备步骤还包括：
26.(9)将步骤(8)设置在逐步升温至78
‑
88℃之间，2个小时后，进行冷却后，提取发酵物的上清液，即制得灭活的生物酶制剂。
27.进一步地，生物制剂的制备步骤1)中的酵母、发酵联合菌包括酵母菌和乳酸菌，所述酵母菌包括嗜酒假丝酵母菌b
‑
jj1，所述乳酸菌包括布氏乳酸菌b
‑
jr1、类干酪乳杆菌b
‑
jr2、玉米乳杆菌b
‑
jr4、植物乳杆菌b
‑
jr5、乳酸菌b
‑
jr6的至少一种；所述嗜酒假丝酵母菌b
‑
jj1的保藏编号为cctcc no:m2020136；所述布氏乳酸菌b
‑
jr1的保藏编号为cctcc no:m2021132；所述类干酪乳杆菌b
‑
jr2的保藏编号为cctccno:2021133；所述玉米乳杆菌b
‑
jr4的保藏编号为cctcc no:2021135；所述植物乳杆菌b
‑
jr5的保藏编号为cctcc no:2021501；所述乳酸菌b
‑
jr6的保存编号为cctcc no:m20211502。
28.进一步地，所述糖浆为单糖制成的糖浆。
29.进一步地，人参皂苷制剂的步骤2)中所述糖浆为果葡糖浆。
30.或进一步地，所述糖浆为包括但不限于由葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、麦芽二糖，麦芽三糖至少一种配制而成的糖浆。
31.本发明还提供了上述的人参皂苷制剂在制备具有保健功能饮品中的应用。
32.本发明所述嗜酒假丝酵母菌b
‑
jj1的保藏编号为cctcc no:m2020136；保藏日期为2021年01月21日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
33.所述布氏乳酸菌b
‑
jr1的保藏编号为cctcc no:m2021132；保藏日期为2021年01月21日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
34.所述类干酪乳杆菌b
‑
jr2的保藏编号为cctcc no:2021133；保藏日期为2021年01月21日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
35.所述玉米乳杆菌b
‑
jr4的保藏编号为cctcc no:2021135；保藏日期为2021年01月21日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
36.所述植物乳杆菌b
‑
jr5的保藏编号为cctcc no:2021501；保藏日期为2021年05月07日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
37.所述乳酸菌b
‑
jr6的保存编号为cctcc no:m20211502；保藏日期为2021年05月07日；保藏机构为中国典型培养物保藏中心；保藏地点为中国武汉大学。
38.采取上述技术方案，具有的有益效果如下：
39.本发明通过富含氨基酸残基，酰胺，辅酶和乳酸，亚油酸等活性基团的复合生物酶制剂，通过添加并利用单糖分子中的半缩醛、羟基的活泼性，经过复杂的醛缩反应、加热脱水缩合制备出富皂苷制剂和富皂苷糖浆等人参皂苷制剂，为人参皂苷及其制品的获得提供新的方向与思路。
具体实施方式
40.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.下面结合实施例对本发明做进一步说明。
42.实施例1：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷制剂；
43.其包括如下步骤：
44.(1)选取复合生物酶制剂，所述生物酶制剂由酵母、乳酸联合菌发酵制成；
45.(2)将步骤(1)的复合生物酶制剂升温至160℃进行加热，直至其蒸发后体积到原料体积的1/3后，即可制备得到富皂苷制剂。
46.对本实施例的步骤(2)富皂苷制剂的总人参皂苷进行检测，检测结果为总皂苷含量为3700mg/l。
47.此检测是由广东省微生物分析检测中心根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中保健食品功效成分及卫生指标检验规范第二部分(二十三、保健食品中总皂甙的测定)p306
‑
307完成，接下来有关总皂苷含量的检测均是由此完成。
48.本实施例的生物酶制剂的制备步骤如下：
49.(1)选用酵母、乳酸菌联合菌作菌种；
50.本实施例中所用的酵母、乳酸菌联合菌包括酵母菌和乳酸菌，所述酵母菌包括嗜酒假丝酵母菌b
‑
jj1，所述乳酸菌包括布氏乳酸菌b
‑
jr1、类干酪乳杆菌b
‑
jr2、玉米乳杆菌b
‑
jr4、植物乳杆菌b
‑
jr5、乳酸菌 b
‑
jr6；所述嗜酒假丝酵母菌b
‑
jj1的保藏编号为cctcc no:m2020136；所述布氏乳酸菌b
‑
jr1的保藏编号为cctcc no:m2021132；所述类干酪乳杆菌b
‑
jr2的保藏编号为cctcc no:2021133；所述玉米乳杆菌b
‑
jr4 的保藏编号为cctcc no:2021135；所述植物乳杆菌b
‑
jr5的保藏编号为cctcc no:2021501；所述乳酸菌 b
‑
jr6的保
存编号为cctcc no:m20211502。
51.本发明所用的酵母、乳酸菌联合菌的培育的具体过程可参考专利号为202111198135x的发明专利。
52.(2)菌种活化：将无菌水按照重量比1:1濡湿土豆泥雪花粉，再按照1:2的重量比将菌种与濡湿后的土豆泥雪花粉混合后，在无菌环境下进行有氧活化；
53.(3)培养基的制备和接种：所述培养基以土豆泥雪花粉、小麦胚芽、糯米为主料配制而成，将培养基加水后搅拌均匀后，蒸熟，然后无菌环境下晾至摄氏45度以下即培养基制备完成；
54.将制备的培养基与步骤(2)活化后的菌种按照重量比10：1的比例进行混合均匀；
55.本步骤中的培养基的制备过程为：
56.将高粱米、荞麦、糯米按50：10：20比例清洗后，再与10％小麦胚芽、10％土豆泥雪花粉混合均匀，1： 1加水搅拌均匀后，入柜蒸熟，然后无菌环境下晾至摄氏45度即培养基制备完成。
57.(4)对步骤(3)接种后的培养基的湿度进行调节，保证握团有水渍出，培养基整体保持湿润透气；
58.(5)将步骤(4)的培养基进行有氧发酵48小时以上；当培养基出现均匀肉眼可见的白色、乳白色菌斑时，将培养基转入发酵罐中；固态发酵物占据发酵罐的三分之一即可，并封闭发酵罐的所有通道，以使得入罐的培养基发酵物在罐体中继续有氧培养，直至耗尽罐体中的氧气，自行进入无氧发酵状态；
59.(6)当发酵罐内压力无变化时，固态发酵物进入饱和发酵，开罐有浓郁的酵香味溢出，肉眼观察有丰茂的菌丝体覆盖在固态培养基表面，取发酵产物进行检测，酵母菌活菌总数6.4
×
104‑
5.9
×
105cfu/ml；乳酸菌总数4
×
108‑
5.1
×
109cfu/ml，此时固态发酵过程已经达到饱和，可以进入液态发酵阶段；
60.(7)将步骤(6)的固态发酵物按照质量比1:3的比例加入无菌水，并充分搅拌，以稀释固态发酵过程中的代谢底物，并确保发酵罐体至少有1/5的空间，进行有氧活化培养72小时以上，直至液态发酵物表面密布白色或乳白色菌斑时，即可封闭发酵罐所有通道，再次让发酵物逐渐耗尽氧气进入无氧发酵过程；
61.(8)当步骤(7)的液态发酵物表面菌斑折叠态，中上层清液呈现金黄色，清澈透明，底层固态发酵物和中层液体层次分明不粘连时，即固态发酵
–
液态发酵过程全部完成；所得发酵产物即可为制得的生物酶制剂。
62.(9)将步骤(8)设置在逐步升温至78
‑
88℃之间，2个小时后，进行冷却后，提取发酵物的上清液，即制得复合酶制剂。
63.本步骤为生物酶制剂的灭活过程，其灭活的具体操作为：
64.将步骤(8)设置在逐步升温至78
‑
88℃(升温后的一个小时保持55摄氏度，之后缓慢升温至78
–
88 摄氏度之间，共计两个小时后，罐体夹层通入冷水冷却至常温，提取发酵物的上清液，即制得复合酶制剂。
65.并且本实施例中对步骤(9)所制备得到的生物酶制剂的总皂苷含量进行检测，检测结果为本发明所用的生物酶制剂中的中总皂苷含量为1260mg/l。
66.实施例2：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为
富皂苷制剂。
67.其包括如下步骤：
68.(1)选取复合生物酶制剂，所述生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌发酵制成；
69.(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照4％的体积比加入型号为f55的果葡糖浆，并搅拌均匀；
70.(3)将步骤(2)的混合料加热至160℃以上；
71.(4)当步骤(2)的混合料中的蒸发后体积达到原混合料的1/3时，则可制备得到富皂苷制剂。
72.对本实施例步骤(4)的富皂苷制剂的总人参皂苷进行检测，检测结果为总皂苷含量为7600mg/l。
73.本实施例中的生物酶制剂及其制备生物酶制剂所用到的酵母、乳酸菌联合菌的培育参考实施例1所述，在此不进行赘述。
74.本实施例中将果葡糖浆加入生物酶制剂制备步骤(8)制备的生物酶制剂后，然后在按照步骤(9)进行加热灭活，在对加入果葡糖浆后的生物酶进行灭活后的总皂苷进行检测，其总皂苷含量为1580mg/l，略高于实施例1中的直接灭活的生物酶制剂的总皂苷含量，推测为可能是由灭活时水分的少量蒸发导致的总皂苷浓度出现少量变化。
75.结合实施例1和实施例2进行比较，实施例2制备的富皂苷制剂的总皂苷含量为实施例1制备的富皂苷制剂的总皂苷的2倍以上，可以充分说明在加入果葡糖浆与生物酶制剂有所反应，在原有的总皂苷的基础上生成了新的皂苷。
76.实施例3：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷制剂。
77.其包括如下步骤：
78.(1)选取复合生物酶制剂，所述生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌发酵制成；
79.(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照15％的体积比加入型号为f55的果葡糖浆并搅拌均匀；
80.(3)将步骤(2)的混合料加热至160℃以上；
81.(4)当步骤(2)的混合料中的蒸发后体积达到原混合料的2/5时，则可制备得到富皂苷制剂。
82.对本实施例步骤(4)的富皂苷制剂的总人参皂苷进行检测，检测结果为总皂苷含量为18000mg/l，由此数据可知步骤(4)所得到的总皂苷检测量的增加是由糖浆与生物酶制剂通过反应生成而非富集。
83.实施例4：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷糖浆。
84.其包括如下步骤：
85.(1)选取复合生物酶制剂，所述生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌发酵制成；
86.(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照100％的体积比加入果葡糖浆并搅拌均匀；
87.(3)将步骤(2)的混合料加热至160℃以上；
88.(4)当步骤(2)的混合料中的蒸发后体积达到所加入果葡糖浆的体积的1/2时，则可制得富皂苷糖浆。
89.对本实施例步骤(4)的富皂苷制剂的总人参皂苷进行检测，检测结果为总皂苷含量为16000mg/l。
90.本发明采用生物酶制剂与糖浆共混加热制备人参皂苷的方法，推测其反应原理为：
91.其主要是利用生物酶制剂中具有的丰富的自由活性基团(氨基酸残基，酰胺，辅酶和乳酸，亚油酸等活性基团)经过一系列的酶解、酸解、水解、加热催化脱水缩合，酰基修饰等，再利用单糖的多羟基醛，多羟基酮特征，和具备的多羟基反应，氧化酯化反应，缩醛反应，醛基、羰基反应等属性，经加热、催化等多重反应，生成主要以皂苷rf,rg1为主的皂苷，由于生物酶制剂中的活性成分较为复杂，具体的有关生物酶制剂加单糖源制备皂苷的机理还需进行试验验证。
92.实施例5：一种采用生物工程技术制备人参皂苷制剂的方法，所述人参皂苷制剂为富皂苷制剂。
93.其包括如下步骤：
94.(1)选取复合生物酶制剂，所述生物酶制剂由酵母、乳酸菌联合菌发酵制成；
95.(2)向步骤(1)中的生物酶制剂中按照25％的重量比加入双糖
‑
冰糖结晶体并搅拌均匀；
96.(3)将步骤(2)的混合料加热至100℃以上，冰糖水解由双糖转化为单糖；
97.(4)将步骤(3)的混合料升温至160℃以上继续加热缩合；
98.(5)当步骤(4)的混合料中的蒸发后体积达到原生物酶制剂体积的2/5时，则可制得富皂苷制剂。
99.对步骤(5)的富皂苷制剂进行检测，检测结果显示其总皂苷含量在66000mg/l。本实施例说明也可采用多糖，例如冰糖、砂糖、红糖等双糖与生物酶制剂反应生成皂苷，推测多糖在加热后会先通过水解生成单糖，例如双糖c
12
h
22
o
11
加热水解成单糖c6h
12
o6，然后单糖再参与反应生成皂苷。
100.以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，上述实施例所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的实施方式并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的实现方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。