水稻qVEα-toco/total-toco分子标记与应用的制作方法

水稻qve
α
‑
toco/total
‑
toco分子标记与应用
技术领域
1.本发明属于水稻育种及分子生物学技术领域，具体涉及一个调控水稻维生素eα
‑
生育酚占总生育酚含量的主效qtl位点的标记及其应用。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa l.)作为世界上重要的粮食作物之一，随着社会的发展和生活水平的提高，人们越来越关注水稻营养品质。水稻籽粒是人们日常摄取微量营养元素的主要来源之一，其中，维生素e(ve)在生物体内起着至关重要的抗氧化作用
[1
‑
2]
，不仅是水稻自身代谢和抵御逆境所必需的，也关系到人类的营养和健康
[3
‑
5]
。
[0003]
维生素e各异构体的生物活性存在显著差异，其中α
‑
生育酚的活性最高，能有效降低血液中胆固醇水平，已作为脂溶性维生素被美国联邦法规认定为安全的食品添加剂
[6]
。除此之外，人体内的生育酚结合蛋白(tbp)对生育酚各异构体的结合能力不同，在相同的条件下，对α
‑
生育酚亲和能力最强，优先吸收α
‑
生育酚
[7]
。因此，提高水稻内维生素e的含量尤其是增大α
‑
生育酚的比重是培育高品质水稻的重要思路之一。人们对于优质水稻的需求也越来越大。培育出兼顾产量和品质的水稻已经成为我国粮食生产的主要方向
[8]
。
[0004]
近年来，随着基因组作图技术和分子标记技术的发展，植物维生素e的qtl定位已成为一个新的研究热点。目前，在大豆、油菜、拟南芥等植物中，已定位到不少有关维生素e含量或组分的qtl，但对于水稻，有关维生素e含量控制的qtl研究较少，仍处于起步阶段。在已有的研究结果中，水稻中维生素e主要异构体α
‑
生育酚相关qtl的定位结果如下：
[0005]
张晓娜等
[9]
以珍汕97(zs97)和南洋占(nyz)为亲本构建的重组自交系(ril)群体为实验材料，测定维生素e含量，成功定位到4个与维生素e相关的qtl，分别位于第1、2及6号染色体。其中位于第1号染色体的是一个α
‑
生育酚相关qve
‑
1，加性效应为0.8522，贡献率为8.9％；同时，该基因位点qve
‑
1(rm5
‑
rm488)与sookwong等
[10]
定位到的(rm8144
‑
rm3642)存在重叠区间，因此两者有可能来源于同一个位点。此外，张晓娜还对亲本为南洋占和珍汕97的水稻植株及其f2群体进行实验，在2010至2011期间共检测到6个与α
‑
生育酚相关的qtl位点，分别为qtα2，qtα4，qtα5，qtα7，qtα7a，qtα8，贡献率在6.4％
‑
10.3％范围之间，分别位于2、4、5、7、8号染色体上。
[0006]
水稻作为世界一半以上人口的主食，其营养品质与人们的健康息息相关。提高水稻中维生素e的含量具有非常重要的社会效益和巨大的经济效益，但是，目前对于水稻中维生素e存在的主要异构体α
‑
生育酚qtl定位的研究较为有限。主要由于水稻维生素e含量表型鉴定费用高，且水稻中维生素e含量较低，其精确测量难度较大。因此，需要进一步地深入挖掘与分析水稻籽粒中维生素e含量控制的qtl位点及相关分子标记，为优质水稻育种提供新的选择。
[0007]
参考文献
[0008]
[1]fitzgerald m.a.,mccouch s.r.,and hall r.d.,2009,not just a grain of rice:the quest for quality,trends plant sci.,14(3):133
‑
139(梅利莎
·
菲茨杰
progenies[j].j.agric.food chem.,57(11):4620
‑
4625(朴宗雄,村田和正,中川清泷,柴田彰,木村俊之,山口龟田,小岛阳一郎,宫泽光雄,2009,异交受精促进水稻生育三烯醇合成及其f2子代的qtl分析[j].农业和食物化学杂志,57(11):4620
‑
4625)。


技术实现要素：

[0018]
本发明要解决的技术问题是提供调控水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值的主效qtl及与其紧密连锁的分子标记，用于选育高维生素e的水稻品种，可提高筛选效率。
[0019]
为解决上述技术问题，本发明提供一种调控水稻维生素eα生育酚占总生育酚比值的主效qtl，所述主效qtl位定位于水稻11号染色体上，命名为qveα
‑
toco/total
‑
toco，定位区间遗传距离为90.36
‑
97.08cm，物理距离为21077880
‑
22646003bp。
[0020]
本发明还同时提供了调控水稻维生素e含量的主效qtl的分子标记(主效qtl紧密连锁的分子标记)：
[0021]
所述主效qtl位于分子标记indel tococ
‑
1和分子标记indel tococ
‑
2之间；
[0022]
所述分子标记indel tococ
‑
1的引物对为：
[0023]
上游引物：5
’‑
tggaaatcgcatgaccagta
‑3’
；
[0024]
下游引物：5
’‑
cccatgctcctagctgagtc
‑3’
；
[0025]
所述分子标记indel tococ
‑
2的引物对为：
[0026]
上游引物：5
’‑
tcgttgtccttaaactggtctg
‑3’
；
[0027]
下游引物：5
’‑
tcaggcatggatggcttag
‑3’
。
[0028]
本发明还同时提供了调控水稻维生素e含量的主效qtl在水稻品种选育中的应用：
[0029]
利用分子标记，检测水稻品种或品系中与维生素e含量相关qtl，从而通过所述分子标记选育具有α生育酚占总生育酚比值高的水稻。
[0030]
本发明还同时提供了一种高维生素e含量水稻的选育方法：提取水稻dna，使用如上所述的分子标记的引物对对dna进行pcr扩增，扩增产物进行电泳检测，通过带型分析水稻的维生素e含量(通过带型分析水稻籽粒的维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值高低)；
[0031]
针对利用华占作为亲本所得的杂交水稻；
[0032]
当条带趋向于亲本华占，则说明该株系水稻籽粒维生素eα生育酚占总生育酚比值高；反之，则说明维eα生育酚占总生育酚比值低。
[0033]
说明：另一亲本为维生素eα生育酚占总生育酚较低的水稻品种，例如为热研2号、日本晴等。
[0034]
作为本发明的高维生素e含量水稻的选育方法的改进：
[0035]
pcr扩增的反应体系(11μl)为：上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板2μl，mix酶6μl，ddh2o 1μl；
[0036]
mix酶购买于擎科生物公司(2
×
taq master mix)；
[0037]
pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环；最后72℃终延伸10min。
[0038]
本发明还同时提供了一种高维生素e含量水稻选育试剂盒：包括如上所述的分子标记的引物对。即，上述分子标记的引物对可用于制备高α
‑
生育酚占总生育酚比值水稻选育试剂盒。本发明的快速简便筛选籽粒维生素eα生育酚占总生育酚比值的试剂盒，可利用
分子标记辅助育种，提高稻米品质。
[0039]
本发明可用于水稻优良品种筛选以及水稻种质资源分子鉴定。
[0040]
本发明以粳稻品种热研2号为母本、籼稻品种华占为父本进行杂交，以杂交f1代连续自交后得到的重组自交系群体为材料，采用高效液相色谱仪进行维生素eα
‑
生育酚与总生育酚的测定，同时利用该群体构建的加密遗传图谱对数据进行qtl作图分析，检测到一个lod值高达4.92的qtl，命名为qveα
‑
toco/total
‑
toco，该位点位于水稻11号染色体上，遗传距离为90.36
‑
97.08cm，物理距离为21077880
‑
22646003bp。
[0041]
上述调控水稻维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值的主效qtl可应用于水稻品种选育，通过开发与主效qtl紧密连锁的分子标记，检测水稻品种或品系中控制维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值的相关qtl，可加快高维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值水稻品种的选育进程。
[0042]
上述分子标记indel tococ
‑
1和分子标记indel tococ
‑
2为与水稻维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值的主效qtl紧密连锁的分子标记，通过分子标记的检测，可以预测水稻籽粒维生素e含量高低，加快高维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值水稻品种的选育进度。
[0043]
综上所述，本发明定位到调控水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值的主效qtl qveα
‑
toco/total
‑
toco，应用该qtl位点获得与其紧密连锁的2对分子标记，利用该分子标记可预测水稻品种的维生素eα生育酚占总生育酚比值高低，加快水稻理想株型的选育。
附图说明
[0044]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0045]
图1为调控水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值的主效qtl定位过程中所使用的遗传材料构建流程图；
[0046]
图2为ril频率分布图；
[0047]
其中，nekken代表水稻品种热研2号，hz代表水稻品种华占；
[0048]
图3为调控水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值的主效qtl qveα
‑
toco/total
‑
toco在第11号染色体上的位置；
[0049]
图4所示为分子标记indel tococ
‑
1的引物对在亲本及其f1代和ril群体中扩增产生的电泳图；
[0050]
其中，1为华占、2为热研2号、3为热研2号/华占杂交后代f1、4
‑
12为热研2号/华占杂交组合的ril群体(f12)中含量较高的水稻株系材料。
[0051]
图5所示为分子标记indel tococ
‑
2的引物对在亲本及其f1代和ril群体中扩增产生的电泳图；
[0052]
其中，1为华占、2为热研2号、3为热研2号/华占杂交后代f1、4
‑
12为热研2号/华占杂交组合的ril群体中含量较高的水稻株系材料。
具体实施方式
[0053]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0054]
实施例1、调控水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值的主效qtl定位
[0055]
1、实验材料的获取
[0056]
以热研2号为受体亲本，水稻品种华占为供体亲本进行杂交，利用单粒传法(即，对f1进行套袋单株受种处理，直至后代株系表型不发生分离)，最终得了120个稳定遗传的株系(f12，所有株系表型稳定)，组成重组自交系ril群体，如图1。
[0057]
选取亲本与各株系种子(f12)各60粒，表面消毒后浸种2天，再用湿润的毛巾包裹，置于37℃恒温箱中催芽48h后，挑选露白一致的种子播种。30天后，选择生长状况相似的亲本及各株系秧苗各24株移栽，所有水稻材料种植于浙江省金华市浙江师范大学生化学院试验田，常规管理。
[0058]
2、水稻籽粒维生素e含量数据测定
[0059]
利用高效液相色谱(high performance liquid chromatogra,hplc)对水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚与生育酚含量进行测量；
[0060]
结果如图2所示，维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值数据表现为连续正态分布且范围广泛，有较多超亲个体存在，表现出数量性状的遗传特点。
[0061]
图2中的横坐标代表α
‑
生育酚占总生育酚比值，纵坐标代表ril群体数量。
[0062]
3、qtl定位分析
[0063]
利用实验室前期开发的大量的snp和indel标记构建的遗传图谱，对水稻维生素e含量进行数量性状座位(qtl)区间作图，通过r
‑
qtl专业软件分析整个染色体组的标记和数量性状表型值的关系，将qtl逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。若检测到lod>3的分子标记，则认为lod值最高处对应的2个标记间存在1个qtl。
[0064]
最终，在水稻华占整个染色体组中找到位于第11染色体上的indel tococ
‑
1标记和indel tococ
‑
2标记之间的一个主效qtl，水稻籽粒维生素e含量lod值高达4.92，其遗传距离为90.36
‑
97.08cm，物理距离为21077880
‑
22646003bp，并命名为qveα
‑
toco/total
‑
toco(图3)。
[0065]
实施例2、分子标记辅助选择
[0066]
在qtl位点qveα
‑
toco/total
‑
toco上下游分别设定分子标记indel tococ
‑
1和分子标记indel tococ
‑
2，并设计引物；
[0067]
分子标记indel tococ
‑
1的引物对为：
[0068]
上游引物：5
’‑
tggaaatcgcatgaccagta
‑3’
(seq id no.1)；
[0069]
下游引物：5
’‑
cccatgctcctagctgagtc
‑3’
(seq id no.2)；
[0070]
分子标记indel tococ
‑
2的引物对为：
[0071]
上游引物：5
’‑
tcgttgtccttaaactggtctg
‑3’
(seq id no.3)；
[0072]
下游引物：5
’‑
tcaggcatggatggcttag
‑3’
(seq id no.4)。
[0073]
取亲本热研2号、华占及其f1代和ril群体(实施例1的步骤1所得)的水稻叶片，提取基因组dna，利用上述分子标记对其基因组dna进行pcr扩增；
[0074]
pcr反应体系：上游引物(10μmol)1μl，下游引物(10μmol)1μl，dna模板(＞100ng/μl)2μl，mix酶(擎科生物公司，2
×
taq master mix)6μl，ddh2o 1μl；
[0075]
反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环；最后72℃终延伸10min。
[0076]
pcr扩增产物在4％琼脂糖凝胶电泳检测，
[0077]
采用分子标记indel tococ
‑
1的引物对，电泳检测结果如图4所述；
[0078]
采用分子标记indel tococ
‑
2的引物对，电泳检测结果如图5所述。
[0079]
对电泳检测条带带型进行分析，其中，条带趋向于亲本华占，则说明该株系水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值高，若趋向热研2号则说明水稻籽粒α
‑
生育酚占总生育酚比值低。
[0080]
采用高效液相色谱仪法(为gb 5009.82—2016)进行株系水稻籽粒α
‑
生育酚以及总生育酚总含量的检测，所得结果如下：
[0081][0082]
因此，将受试株系水稻籽粒维生素e含量与通过带型分析预测的结果进行比对，显示预测结果与实际检测结果相吻合。
[0083]
实施例3、水稻维生素e含量相关qtl在水稻育种中的应用
[0084]
将维生素eα
‑
toco/total
‑
toco含量较低的水稻品种父本日本晴，与母本华占进行杂交，获得相应的f1，以日本晴为轮回亲本进行回交，至bc3f1代。提取bc3f1代部分单株dna，然后用indel tococ
‑
1和indel tococ
‑
2的引物进行pcr扩增，并进行电泳检测。
[0085]
对电泳检测条带带型进行分析，条带趋向于亲本华占，则说明该株系水稻籽粒维生素e含量高。利用该方法进行筛选，定向选择，可获得维生素e含量高且保留了日本晴优良性状的水稻，大大提高了育种效率。
[0086]
实际，将上述条带趋向于亲本华占的9个单株进行种植，其最终所得的α
‑
生育酚占生育酚总含量的比值分别为0.8755,0.8754,0.8758,0.8759,0.8755,0.8754,0.8760,0.8751,0.8756，而亲本华占所得的α
‑
生育酚占生育酚总含量的比值为0.8758，因此证明本发明所得的结果与实际结果相吻合。
[0087]
综上所述，本发明的调控水稻水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值高的主效qtl可以有效加快优化水稻品种的进程。在水稻分子辅助育种的过程中可以培育水稻籽粒维生素eα
‑
生育酚占总生育酚比值高的水稻，同时进行水稻品质和产量的优化。此种方法简便易行，安全有效，有益于提高水稻品种的经济价值，兼顾经济与生态效益，适于大规模推广应用。
[0088]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。