与ONFH风险性有关CEBPA、PPARγ、CREBBP基因SNP检测物质及应用的制作方法

与onfh风险性有关cebpa、ppar
γ
、crebbp基因snp检测物质及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关基因的单核苷酸多态性的物质，进一步将其用于非创伤性股骨头坏死的分子预警、药物治疗靶标和临床分子诊断与分型。


背景技术：

2.股骨头坏死(osteonecrosisofthefemoralhead，onfh)是由遗传因素与环境因素共同作用引起的复杂性疾病。在近10多年来，onfh的发病率呈现逐年增加的趋势。据估计在美国年均20000～30000位患者被新诊断为onfh，在中国每年新增onfh病例为150000～200000，而且目前中国成年人onfh患者812万人，主要发病群体为40岁至50岁之间的青壮年，致残率高，导致严重社会与家庭经济负担，是目前人类健康面临主要挑战之一。及早发现onfh遗传学分子诊断标志物进而实施早期分子预警，使其防治时段前移，是降低onfh发病率的关键。
3.近年来onfh分子发病机理研究进展的重要标志之一，是陆续提出了纤溶酶原激活/抑制系列、血管生成系列、脂代谢系列、ⅱ型胶原系列、细胞因子系列、生长因子系列基因多态性与onfh的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响onfh的发病，或者影响其它易感基因的表达功能，在onfh的发生发展中起协同作用。这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，onfh属于多个微效基因联合参与并由环境因素诱导的复杂病。
4.cebpa基因染色体位置19q13.11，含有1个外显子。该基因编码一个转录因子，它包含一个碱性亮氨酸拉链(bzip)结构域，并识别靶基因启动子中的ccaat基序。编码的蛋白质在同型二聚体和含ccaat/增强子结合蛋白β和γ的异二聚体中起作用。cebpa基因编码蛋白可以调节参与细胞周期调节和体重动态平衡的基因表达。该基因参与多种不同转录因子的转录协同激活。
5.crebbp基因染色体位置16p13.3，含有33个外显子。该基因最初作为一种结合camp反应元件结合蛋白(creb)的核蛋白被分离出来，其通过将染色质重构与转录因子识别偶联，在胚胎发育、生长控制和体内平衡中发挥关键作用。由该基因编码的蛋白质具有固有的组蛋白乙酰转移酶活性，并作为支架稳定其它蛋白质与转录复合物之间的相互作用。涉及该基因的染色体易位与急性髓系白血病有关。
6.pparγ基因色体位置3p25.2，含有14个外显子。该基因编码核受体过氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)亚家族成员。ppars与维甲酸x受体(rxrs)形成异二聚体，这些异二聚体调节各种基因的转录。已知有三种ppar亚型，pparα、pparδ和pparγ。pparγ是脂肪细胞分化的主控制器。此外，pparγ与许多疾病的病理学有关，包括onfh、肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化和肿瘤。
7.onfh病变骨髓腔往往充填了大量脂肪组织，因而脂代谢紊乱早已被公认为股骨头
坏死核心发病环节之一。鉴于动物实验及临床研究已充分证实，高脂环境可以抑制成骨细胞的分化，高脂血症后骨髓内脂肪细胞增多增大压迫股骨头微血管引起骨细胞缺血性坏死，较早就推测成脂与成骨分化的调控异常可能在onfh发生发展起关键作用，但一直不清楚其脂肪蓄积的分子机理。
8.近年对骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells，bmscs)分化微环境的研究，发现了成脂关键转录因子pparγ在调节成骨、成脂分化中的关键作用。pparγ是一个ii类核受体，一直被定义为脂肪细胞分化的主调控器。在脂肪细胞分化序贯的分子级联事件中，pparγ基因在脂肪细胞分化的早期表达上调被广泛用作脂肪细胞分化的标志。在pparγ删除事件中，没有其他因素可以恢复脂肪形成，而且几乎前成脂细胞的所有信号通路均会集于pparγ，这些关键作用充分展示了pparγ在脂肪代谢的主调控器地位。pparγ被充分证明具有拮抗骨形成作用，两者很大程度上介导不同细胞因子决定bmscs成骨或成脂分化方向，一种转录因子的表达增加往往相关于另一种转录因子的表达下调。
9.onfh被认为是一种干细胞病，由于bmscs成骨成脂分化转分化障碍，导致大量脂肪蓄积在病变骨髓腔，引发股骨头坏死。成骨转录因子与包括cebpa、crebbp及pparγ在内的成脂转录因子在bmscs成脂和成骨分化程序中发挥关键调节作用。bmscs的成骨与成脂分化具有共同的调节途径，wnt信号通路是控制成脂与成骨分化转换的关键信号通路，成脂主要转录因子pparγ调控wnt信号通路朝向成脂分化的方向，成骨主要转录因子runx2调控wnt信号通路朝向成骨分化的方向。wnt信号通路通过细胞增殖和分化调节等系列关键事件控制骨形成和脂肪生成的方向。在成骨倾向的骨髓间充质干细胞，wnt信号通路被激活，在控制成骨分化和成脂分化的平衡中起关键作用。
10.近年来onfh分子发病机理的重要研究进展是陆续提出了多系列基因多态性与onfh的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响onfh的发病，或者影响其它易感基因的表达功能，在onfh的发生发展中起协同作用。这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，onfh属于多个微效基因联合参与并由环境因素诱导的复杂病。然而，目前国内外关于onfh的基因多态性研究领域存在的主要瓶颈问题，零散研究基因位点的资料多，系统研究多基因位点的资料少，不利于多种微效基因联合致病的分子病因学与分子发病机理的阐述。这些瓶颈问题是阐述onfh分子发病机理的严重束缚，也是onfh分子病因学的最新成果与临床防治实施对接的关键障碍。


技术实现要素：

11.为解决上述技术问题，本发明联合应用分子技术的创新集成在国内外率先阐述成脂分化转录因子pparγ及其转录共因子cebpa、crebbp基因分型、等位基因频率、基因之间的组合与onfh发病风险的关联，为建立onfh的分子水平防治对策提出关键分子靶点，用于onfh的易感人群筛查及早期干预，促进分子病因学的研究成果与onfh的临床防治及早对接，并在非创伤性股骨头坏死分子预警、分子诊断及治疗药物靶标的具有重要应用价值。
12.本发明的一个目的是提供了检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关cebpa、pparγ和crebbp基因的单核苷酸多态性的物质，所述物质在诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；或所述物质在评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤
性股骨头坏死风险性的产品中的应用；所述与非创伤性股骨头坏死有关的位点或具有交互作用的位点组合为以下(1)至(9)中的任意一个或多个：
13.(1)cebpa基因rs17694108位点；(2)cebpa基因rs3745971位点；(3)pparγ基因rs2920502位点与crebbp基因rs2072381位点的组合；(4)pparγ基因rs2028759位点与cebpa基因rs10500264位点的组合；(5)pparγ基因rs3856806位点与cebpa基因rs17694108位点的组合；(6)crebbp基因rs9392位点与crebbp基因rs2283487位点的组合；(7)crebbp基因rs3751845位点与crebbp基因rs2283487位点的组合；(8)crebbp基因rs2072381位点与crebbp基因rs10500264位点的组合；(9)crebbp基因rs129974位点与crebbp基因rs2283487位点的组合。
14.进一步的，所述物质为制备预测或辅助预测非创伤性股骨头坏死风险性的产品，或所述物质为制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品，所述产品中包括记载有如下a至n中至少一种条件的可读性载体：
15.a.携带所述rs17694108位点为最小纯合基因型gg型待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
16.b.携带所述rs17694108位点的最小等位基因g频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
17.c.所述rs17694108位点遗传学显性模型(gg agvsaa)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
18.d.所述rs17694108位点遗传学隐性模型(ggvsag aa)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
19.e.携带所述rs3745971位点为最小纯合基因型tt型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
20.f.携带所述rs3745971位点的最小等位基因t频率高的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
21.g.所述rs3745971位点遗传学显性模型(tt tcvscc)相关于增加创伤性股骨头坏死风险性；
22.h.同时携带rs2920502位点最小纯合基因型gg型与rs2072381位点最小纯合基因型aa型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
23.i.同时携带所述rs2028759位点最小纯合基因型cc型与rs10500264位点最小纯合基因型aa型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
24.j.同时携带所述rs9392位点最小纯合基因型aa型与rs2283487位点最小纯合基因型gg型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
25.k.同时携带所述rs3751845位点最小纯合基因型aa型与rs2283487位点最小纯合基因型gg型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
26.l.同时携带所述rs129974位点最小纯合基因型tt型与rs2283487位点最小纯合基因型gg型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
27.m.同时携带所述rs3856806位点最小纯合基因型tt型与rs17694108位点最小纯合基因型gg型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低。
28.n.同时携带所述rs2072381最小纯合基因型aa型与rs10500264最小纯合基因型aa
型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低。
29.进一步的，所述rs17694108位点为人类基因组19号染色体自5'末端起第33240645位核苷酸；所述rs17694108位点的核苷酸为g或a。所述rs3745971位点为人类基因组19号染色体自5'末端起第33304320位核苷酸；所述rs3745971位点的核苷酸为c或t。所述rs10500264位点为人类基因组19号染色体自5'末端起第33259408位核苷酸；所述rs10500264位点的核苷酸为g或a。所述rs2920502位点为人类基因组3号染色体自5'末端起第12287696位核苷酸；所述rs2920502位点的核苷酸为g或c。所述rs2028759位点为人类基因组3号染色体自5'末端起第12377113位核苷酸；所述rs2028759位点的核苷酸为c或t。所述rs3856806位点为人类基因组3号染色体自5'末端起第12434058位核苷酸；所述rs3856806位点的核苷酸为c或t。所述rs2072381位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3731312位核苷酸，所述rs2072381位点的核苷酸为g或a。所述rs9392位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3725168位核苷酸，所述rs9392位点的核苷酸为g或a。所述rs2283487位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3919885位核苷酸，所述rs2283487位点的核苷酸为a或g。所述rs3751845位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3728336位核苷酸，所述rs3751845位点的核苷酸为g或a。所述rs129974位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3745291位核苷酸，所述rs129974位点的核苷酸为c或t。
30.进一步的，所述物质为用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种snp分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
31.进一步的，用于检测所述rs17694108位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对甲或成套单链dna分子甲；所述引物对甲由如seqidno.1所示的单链dna分子组成和如seqidno.2所示的单链dna分子组成：所述成套单链dna分子甲由如seqidno.1所示的单链dna、如seqidno.2所示的单链dna和如seqidno.3所示的单链dna组成。
32.进一步的，用于检测rs3745971位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对乙或成套单链dna分子乙；所述引物对乙由如seqidno.4所示的单链dna分子组成和如seqidno.5所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子乙由如seqidno.4所示的单链dna、如seqidno.5所示的单链dna和如seqidno.6所示的单链dna组成。
33.进一步的，用于检测rs10500264[g/a]位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链dna分子丙；所述引物对丙由如seqidno.7所示的单链dna分子组成和如seqidno.8所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子丙由如seqidno.7所示的单链dna、如seqidno.8所示的单链dna和如seqidno.9所示的单链dna组成。
[0034]
进一步的，用于检测rs2920502位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链dna分子丁；所述引物对丁由如seqidno.10所示的单链dna分子组成和如seqidno.11所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子丁由如seqidno.10所示的单链dna、如seqidno.11所示的单链dna和如seqidno.12所示的单链dna组成。
[0035]
进一步的，用于检测rs2028759位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链dna分子戊；所述引物对戊由如seqidno.13所示的单链dna分子组成和如seqidno.15所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子丁由如seqidno.13所示的单链
dna、如seqidno.14所示的单链dna和如seqidno.15所示的单链dna组成。
[0036]
进一步的，用于检测rs3856806位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对己或成套单链dna分子己；所述引物对己由如seqidno.16所示的单链dna分子组成和如seqidno.17所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子己由如seqidno.16所示的单链dna、如seqidno.17所示的单链dna和如seqidno.18所示的单链dna组成。
[0037]
进一步的，用于检测rs2072381位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对庚或成套单链dna分子庚；所述引物对庚由如seqidno.19所示的单链dna分子组成和如seqidno.20所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子庚由如seqidno.19所示的单链dna、如seqidno.20所示的单链dna和如seqidno.21所示的单链dna组成。
[0038]
进一步的，用于检测rs9392位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对辛或成套单链dna分子辛；所述引物对辛由如seqidno.22所示的单链dna分子组成和如seqidno.23所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子辛由如seqidno.22所示的单链dna、如seqidno.23所示的单链dna和如seqidno.24所示的单链dna组成。
[0039]
进一步的，用于检测rs2283487位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对壬或成套单链dna分子壬；所述引物对壬由如seqidno.25所示的单链dna分子组成和如seqidno.26所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子壬由如seqidno.25所示的单链dna、如seqidno.26所示的单链dna和如seqidno.27所示的单链dna组成。
[0040]
进一步的，用于检测rs3751845位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对癸或成套单链dna分子癸；所述引物对癸由如seqidno.28所示的单链dna分子组成和如seqidno.29所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子癸由如seqidno.28所示的单链dna、如seqidno.29所示的单链dna和如seqidno.30所示的单链dna组成。
[0041]
进一步的，用于检测rs129974位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对子或成套单链dna分子子；所述引物对子由如seqidno.31所示的单链dna分子组成和如seqidno.32所示的单链dna分子组成；所述成套单链dna分子子由如seqidno.31所示的单链dna、如seqidno.32所示的单链dna和如seqidno.33所示的单链dna组成。
[0042]
进一步的，所述预测或辅助预测非创伤性股骨头坏死风险性的产品或所述评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品为试剂盒，所述试剂盒包括所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的(1)至(9)位点或位点组合的单核苷酸多态性的物质。
[0043]
本发明还提供一种靶向治疗药物，所述药物为以所述与非创伤性股骨头坏死有关的(1)至(9)位点或具有交互作用的位点组合中的任意一个或多个为靶标基因的药物。
[0044]
本发明首次阐述了所述11snps与onfh发病风险的关联，对onfh分子预警及分子水平防治具有重大价值。本发明提供了cebpa基因单核苷酸多态位点rs17694108、rs3745971、rs10500264标志物，pparγ基因单核苷酸多态位点rs2920502、rs2028759、rs3856806标志物，crebbp基因单核苷酸多态位点rs2072381、rs9392、rs2283487、rs3751845、rs129974标志物组合在检测非创伤性股骨头坏死发病风险中的应用，进一步用于onfh分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
[0045]
本发明所提供了用于检测rs17694108、rs3745971、rs10500264、rs2920502、rs2028759、rs3856806、rs2072381、rs9392、rs2283487、rs3751845、rs129974位点及其具有交互的组合在onfh发病风险及分子预警、临床分子诊断与分型的产品，或作为onfh药物治
疗靶标的应用及其产品。
[0046]
本发明中通过中国汉族人群onfh临床病例对照体系研究，发现cebpa基因单核苷酸多态位点rs17694108最小纯合基因型gg型及最小等位基因g频率显著相关于降低患onfh风险，cebpars17694108位点显性模型(gg agvsaa)、隐性模型(ggvsag aa)也显著相关于降低患onfh风险；rs2072381与rs10500264的交互作用、rs3856806与rs17694108交互作用也显著相关于降低onfh发病风险，可作为降低onfh风险的分子保护标志物。而发现cebpa基因单核苷酸多态位点rs3745971最小等位基因t频率、遗传学显性模型(tt tcvscc)均显著相关于增加患onfh风险；发现rs2920502与rs2072381交互作用、rs2028759与rs10500264交互作用、rs9392与rs2283487交互作用、rs3751845与rs2283487交互作用、rs129974与rs2283487交互作用均显著相关于增加onfh发病风险，可作为onfh分子预警、分子诊断、临床药物治疗靶标应用分子标志物。
附图说明
[0047]
图1为massarraysnp分型实验流程图。
具体实施方式
[0048]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0049]
下述实施例中所用的实验材料及试剂如无特殊说明均可通过商业途径购买。
[0050]
实施例1、cebpa、pparg、crebbp转录因子基因组合在非创伤性股骨头坏死分子预警、分子诊断及治疗药物靶标的应用。
[0051]
一、onfh病例对照研究体系建立；建立在知情同意基础上，onfh病例对照研究体系共600例，其中健康对照组300例，onfh患者组300例。onfh病例来自于2012年6月至2018年10月期间分别就诊于吉林大学第二、第三临床医学院骨科的住院临床患者，其中男性204例，女性96例，年龄54.49
±
11.8岁。排除明显髋关节的外伤史和髋关节先天性疾病、髋关节感染性疾病及髋关节肿瘤，按ficat诊断与分期标准进行onfh的临床诊断与分期。健康对照组来自2013年11月至2014年3月期间在吉林大学第二临床医学院体检中心的健康体检者，其中男性131名，女性169名，年龄56.5
±
8.61岁。其空腹血糖、血清甘油三脂及总胆固醇均居于正常人群参考值水平，腹腔脏器超声检查及胸部x线摄片无异常，并排除心脑血管疾病等重大疾病史。以上病例
‑
对照研究体系均为中国汉族人，个体之间无血缘关系。
[0052]
二、外周血白细胞基因组dna提取；
[0053]
空腹状态下采集肘静脉血液2ml，按照全血基因组dna提取试剂盒说明书的规程操作，主要步骤依次为：抗凝血2ml，2000rpm离心10min，取血浆
‑
80℃保存；剩余细胞加入红细胞裂解液a型1ml并轻柔颠倒混匀；10000g室温离心2min，弃上清；将沉淀重悬于500μl的红细胞裂解液a型中，轻柔吹打混匀后，10000g室温离心min，去上清；加入0.6ml溶液a，轻柔吹打混匀,室温作用5min；加入0.2ml氯仿和0.3ml溶液b，立即颠倒混匀；室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml塑料离心管；加入0.7ml异丙醇，颠倒混匀5
‑
8次，出现絮状dna沉淀；加入1ml75％乙醇，13000g离心min，弃上清后空气中挥发乙醇，加入0.2mltris
‑
edta反应溶解dna；取1μl提取dna，应用nanodrop2000检测dna含量及纯度；将dna分装，
‑
80℃保存。
[0054]
三、目标基因及其snps的优化筛选；
[0055]
应用hapmap数据库以及相关文献查询cebpa、pparg、crebbp基因的snps，通过多种生物信息库比对各snps位点在不同国家、民族、地区人群的分布，尤其在亚洲人群的分布数据，基因多态性的分布符合hardway平衡，分别在基因编码区、启动子区及内含子及选择11snps作为研究的靶位点，所选择的目标基因snps位点见表1。
[0056]
表1
[0057][0058][0059]
所述crebpa、pparg、crebbp基因11snps序列信息见表2。
[0060]
表2
[0061][0062][0063]
四、massarraysnp分型实验流程，具体见图1。
[0064]
(一)引物设计及合成、稀释
[0065]
1.基因序列的获取：
①
在myagena网站中注册成用户；
②
在ncbi网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/snp/)中输入该snp位点的名称,按照dbsnpbatchreportor格式显示；
③
将snp位点所在序列发送到myagena网站注册的邮箱中；
④
在myagena网站的tools工具栏中选择genotyping；
⑤
点击rsformat，在browse按钮中选择ncbi网站发送到邮箱的文件；
⑥
网站对序列的格式化完成后在sentto栏中，选择proxsnp；
⑦
开始proxsnp，点击beginstart；
⑧
上述步骤完成后，在sentto栏中选择prextend；
⑨
开始proxsnp，点击beginstart；
⑩
在产生的结果中，选择output，并把文件内容复制在新的文本文件.txt中。
[0066]
2.采用assaydesigner3.1软件进行引物设计pcr反应和单碱基扩展引物，并交由生物公司合成：
①
在软件snpgroup栏中选择browse按钮，找到上述产生的txt文件；
②
在aassydesign栏中选择sbemassextend，并在sbestopmix栏中选择iplex，在mμltiplexlevel中按照实际情况选择不同的反应重数；
③
snpcapture，extendprimerdesign，massmμ
ltiplexing均选择默认参数；
④
参数设定后，点击run；
⑤
在txt文件目录相应位置找到产生的引物序列文件，设计的引物序列见表3。
[0067]
表3
[0068][0069]
3.引物稀释：
[0070]
①
pcrmastermix引物配置，稀释单管pcrmaster至浓度100μm，加入去离子水混合所有单管pcrmaster使最终反应pcrmastermix浓度为0.5μm；
②
extendmix引物配置：稀释单管延伸引物至终浓度500μm，加入引物混合后使得各引物浓度为8μm、10μm、15μm。按照dna合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。
②
将混合好的单管延伸引物根据分子量大小，分别取(小于6300da)1倍，(6300da至7200da)1.2倍，(大于7200da)1.5倍体积量进行混合待用。
[0071]
(二)agenamassarray系统基因分型步骤
[0072]
分型原理：通过pcr反应扩增出含有待检snp位点的目的片段，然后用sap酶去除pcr体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)和引物，所述pparγ、cebpa、crebbppcr引物及测序引物序列表见表3，再加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨snp位点，且与目的片
段上的碱基完全互补，采用四种ddntp替代dntp，这样，探针在snp位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddntp与snp位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi
‑
tofms)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。
[0073]
1.pcr扩增反应：
[0074]
①
取1.5mlep管中配置pcrmastermix，并振荡低速离心，反应组分见下表4；
②
选用8道移液器，在384孔板的每个加样孔中加入4μlpcrmastermix，最后加入1μl模板dna(20ng/μl)混匀，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止pcr程序时出现蒸发等现象。1000rpm离心1minute；
③
设置如下pcr扩增反应程序：94℃5min；94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，45cycles；72℃3min；4℃∞。将pcr反应板放置于pcr仪上，启动程序。
[0075]
表4
[0076][0077]
2.产物碱性磷酸酶处理：
[0078]
①
在pcr反应结束后，将pcr产物用sap(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps；
②
在新1.5mlep管中配制碱性磷酸酶处理反应液，sapmix反应组分见下表5；
③
将sapmix加入384孔pcr反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应总体积为7μl，其中pcr产物5μl，sapmix2μl；
④
移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止pcr程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序；
⑤
设置sap反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞。并将384孔反应板放置于pcr仪上，启动程序。
[0079]
表5
[0080]
sapmixofreagentconcentrationvolume(1rxn)water(hplcgrade)na1.53μlsapbuffer10x0.17μlsapenzyme1u/μl0.30μltotalvolume
‑
2.00μl
[0081]
3.单碱基延伸反应：
①
在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl；
②
在新1.5mlep管中配制单碱基延伸反应液，extendmix反应组分见下表6；
③
将extendmix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系extendmix2μl；sap pcrreaction7μl,totalvolume9μ；
④
移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个
孔，防止pcr程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序:94℃30sec；[94℃5sec，(52℃5sec,80℃5sec)5cycles]40cycles；4℃∞。
[0082]
表6
[0083]
extendmixofreagentconc.in9μlvolume(1rxm)water(hplcgrade)na0.619μliplexbufferplus0.222x0.200μliplexterminationmix1x0.200μlprimermix(7μm:14μm)0.625um:1.25um0.940μliplexenzyme1x0.041μl
[0084]
4.树脂纯化：
①
在384/6mgdimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干；
②
在384样本板的每个孔中加16μl水；
③
将384样本板轻轻翻转过来扣在dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中；
④
将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
[0085]
5.芯片点样：启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384
‑
wellspectrochipbioarray上。
[0086]
6.质谱检测及数据输出：将点样后的spectrochip芯片使用maldi
‑
tof质谱仪分析，检测结果使用typer4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。
[0087]
(三)统计分析；
[0088]
基因型频率和等位基因频率计算，检验hardy
‑
weinberg平衡和maf，通过person卡方检验比较病例组和对照组之间基因型和等位基因分布情况。
[0089]
单个snp关联分析，通过pearson卡方检验或fisher精确检验，分析onfh组和疾病组在每个位点上基因型和等位基因的差异，寻找与疾病相关的位点。
[0090]
多个snps之间的两两交互作用与onfh发病风险的相关性，通过plink软件基因交互作用(上位效应，epistasis)分析完成。
[0091]
五、实验结果分析
[0092]
(一)onfh组与对照组cebpa、pparγ、crebbp基因11snps基因分型与onfh发病风险的相关性，具体11snps基因型在onfh组与对照组的分布如表7所示。
[0093]
表7
[0094][0095][0096]
测序结果发现onfh组cebpa基因rs17694108(g/a)位点最小纯合基因型gg(minor genotype)频率显著低于对照组，p＝0.0002345见表7；也就是说，cebpa基因rs17694108(g/a)位点gg型携带者显著降低onfh发病风险，低于gg或ga基因型的携带者。
[0097]
(二)onfh组与对照组cebpa、pparγ、crebbp基因11snps等位基因频率与onfh发病风险的相关性，snp等位基因型在病例组与对照组样本中分布频数如表8所示。
[0098]
表8
[0099][0100][0101]
测序结果发现onfh组cebpa基因rs17694108(g/a))位点最小等位基因g频率显著低于对照组，p＝6.516e
‑
00；or(95％ci)0.311(0.189
‑
0.511)，也就是说，cebp基因ars17694108(g/a)位点的g等位基因频率显著降低onfh发病风险，等位基因为g的待测人患onfh的概率小于等位基因为a的待测人。
[0102]
测序结果还发现onfh组cebpa基因rs3745971(t/c)位点最小等位基因t频率显著高于对照组，p＝0.012；or(95％ci)1.636(1.113
‑
2.406)，见表8，也就是说，cebpa基因rs3745971(t/c)位点t等位基因频率显著增加onfh发病风险，等位基因为t的待测人患onfh的概率高于等位基因为c的待测人。
[0103]
(三)cebpa、pparγ、crebbp基因11snps不同遗传模型与onfh发病风险的相关性。
[0104]
cebpa基因rs17694108(g/a))位点不同遗传学模型分析结果进一步发现，onfh组cebpars17694108位点显性模型(gg agvsaa)显著低于对照组，p＝6.099e
‑
005，也就是说，
cebpa基因rs17694108(g/a))位点最小纯合基因型gg频率显著降低onfh发病风险，见表9。
[0105]
onfh组cebpa基因rs17694108(g/a))位点隐性模型(ggvsag aa)也显著低于对照组，见表8，p＝0.005164，也就是说，cebpa基因rs17694108(g/a)位点最小纯合基因型gg频率显著降低onfh发病风险，见表9。
[0106]
onfh组cebpa基因rs3745971(g/a)位点显性模型(tt tcvscc)显著高于对照组，p＝0.0019，也就是说，cebpa基因rs3745971(g/a)位点最小纯合基因型tt型频率显著增加onfh发病风险，见表9。
[0107]
表9
[0108]
[0109][0110]
*卡方统计分析
[0111]
(四)cebpa、pparγ、crebbp基因11snps交互作用与onfh风险的相关。
[0112]
应用plink软件基因交互作用分析方法对11snps(rs17694108、rs3745971、rs10500264、rs2920502、rs2028759、rs3856806、rs2072381、rs9392、rs2283487、rs3751845、rs129974)的两两交互作用分析。所述rs17694108位点为人类基因组19号染色体自5'末端起第33240645位核苷酸；所述rs17694108位点的核苷酸为g或a；所述rs3745971位点为人类基因组19号染色体自5'末端起第33304320位核苷酸；所述rs3745971位点的核苷酸为c或t；所述rs10500264位点为人类基因组19号染色体自5'末端起第33259408位核苷
酸；所述rs10500264位点的核苷酸为g或a；所述rs2920502位点为人类基因组3号染色体自5'末端起第12287696位核苷酸；所述rs2920502位点的核苷酸为g或c；所述rs2028759位点为人类基因组3号染色体自5'末端起第12377113位核苷酸；所述rs2028759位点的核苷酸为c或t；所述rs3856806位点为人类基因组3号染色体自5'末端起第12434058位核苷酸；所述rs3856806位点的核苷酸为c或t；所述rs2072381位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3731312位核苷酸，所述rs2072381位点的核苷酸为g或a；所述rs9392位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3725168位核苷酸，所述rs9392位点的核苷酸为g或a；所述rs2283487[a/g]位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3919885位核苷酸，所述rs2283487位点的核苷酸为a或g；所述rs3751845[g/a]位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3728336位核苷酸，所述rs3751845位点的核苷酸为g或a；所述rs129974位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第3745291位核苷酸，所述rs129974位点的核苷酸为c或t。不同snp交互作用与股骨头坏死相关性分析见表10。
[0113]
表10
[0114][0115][0116]
*plink卡方检验；
▲
交互；
#
plink基因交互作用(上位效应，epistasis)分析。
[0117]
plink软件分析基因之交互作用的结果表明：
[0118]
pparγ基因rs2920502[g/c]位点、与crebbp基因rs2072381[g/a]位点之间的交互作用显著增加患onfh风险，or：1.812，p＝0.0222，见表10中序号1，也就是说，同时携带pparγ基因rs2920502[g/c]位点的最小纯合基因型gg型与crebbp基因rs2072381[g/a]位点的最小纯合基因型aa型的个体显著增加onfh发病风险，可作为onfh分子预警、分子诊断、临床
药物治疗靶标应用分子标志物。
[0119]
pparγ基因rs2028759[c/t]位点与cebpa基因rs10500264[g/a]位点之间的交互作用显著增加onfh发病风险，or：1.973，p＝0.0487，见表10中的序号2，也就是说，同时携带pparγ基因rs2028759[c/t]位点的最小纯合基因型cc型与cebpa基因rs10500264[g/a]位点的最小纯合基因型aa型的个体显著增加onfh发病风险，可作为onfh分子预警、分子诊断、临床药物治疗靶标应用分子标志物。
[0120]
crebbp基因rs9392[g/a]位点与crebbp基因rs2283487[a/g]位点之间的交互作用显著增加onfh发病风险，or：1.472，p＝0.02315，见表10中的序号4，也就是说，同时携带crebbp基因rs9392[g/a]位点最小纯合基因型aa型与crebbp基因rs2283487[a/g]位点最小纯合基因型gg型的个体显著增加onfh发病风险，可作为onfh分子预警、分子诊断、临床药物治疗靶标应用分子标志物。
[0121]
crebbp基因rs3751845[g/a]位点与crebbp基因rs2283487[a/g]位点之间的交互作用显著增加onfh发病风险，or：2.125，p＝0.006302，见表10中的序号5，也就是说，同时携带crebbp基因rs3751845[g/a]位点的最小纯合基因型aa型与crebbp基因rs2283487[a/g]位点的最小纯合基因型gg型的个体显著增加onfh发病风险，可作为onfh分子预警、分子诊断、临床药物治疗靶标应用分子标志物。
[0122]
crebbp基因rs129974[c/t]位点与crebbp基因rs2283487[a/g]位点之间的交互作用显著增加onfh发病风险，or:1.831，p＝0.01471，见表10中的序号7，也就是说，同时携带crebbp基因rs129974[c/t]位点基因最小纯合基因型tt型与crebbp基因rs2283487[a/g]位点最小纯合基因型gg型的个体显著显著增加onfh发病风险，可作为onfh分子预警、分子诊断、临床药物治疗靶标应用分子标志物。
[0123]
crebbp基因rs2072381[g/a]位点与cebpa基因rs10500264[g/a]位点的交互作用显著相关于降低onfh发病风险，or:0.3681，p＝0.04758，见表10中的序号6，也就是说，同时携带crebbp基因rs2072381[g/a]位点最小纯合基因型aa型与crebbp基因rs10500264[g/a]位点最小纯合基因型aa型的个体显著显著增加onfh发病风险，可作为降低onfh发病风险的分子保护标志物。
[0124]
pparγ基因rs3856806[c/t]位点与cebpa基因rs17694108[g/a]位点之间的交互作用显著增降低onfh发病风险，or:0.4148，p＝0.04181，见表10中的序号3，也就是说，同时携带pparγ基因rs3856806[c/t]位点的最小纯合基因型tt型与cebpa基因rs17694108[g/a]位点的最小纯合基因型gg型的个体显著降低onfh发病风险，可作为降低onfh风险的分子保护标志物。
[0125]
本发明首次发现14snps的两两交互作用显著相关于onfh发病风险，且这些风险相关性与单一snp对onfh发病风险所表现的作用部分或完全不同，基因交互作用的结果更清晰地发现了多个snps对onfh的风险作用或保护效应，进一步验证了onfh是多个微效基因联合引起的复杂病，阐述这些分子遗传学位点的联合效应，对onfh早期分子预警及分子防控对策建立具有重要价值。所述基因交互作用，又称上位效应(epistatic effect)是指影响同一性状的两对非等位基因，其中一对基因(显性或隐性的)抑制(或掩盖)另一对显性基因的作用时所表现的作用。
[0126]
本领域技术人员将能通过检测snp位点的任何方法或技术在个体的核酸中进行在
本文所公开的snp标记上存在的核苷酸的分析。例如，一个人能用本发明的方法通过进行tagman法、质谱法、dna微阵列法、微测序、杂交、限制性酶切分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性pcr
‑
hrm或联合应用上述方法检测snp位点标记，当然，这一列表仅是示例性的，并且决不用于限制本发明。
[0127]
本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。
[0128]
本发明的实施例中涉及到的主要实验仪器和设备如下表11。
[0129]
表11
[0130][0131][0132]
本发明的实施例中涉及到的主要试剂或软件如下表12。
[0133][0134][0135]
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。