一种人SERPINB7基因突变快速分型的检测试剂盒的制作方法

一种人serpinb7基因突变快速分型的检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于体外核酸检测技术领域，涉及一种人serpinb7基因突变快速分型的检测试剂盒，其中包括特异性的引物探针组合物及配套试剂，以及适用于该试剂盒的检测方法。


背景技术：

2.长岛型掌跖角化症(nagashima
‑
type palmoplantar keratosis，nppk，omim 615598)属于弥漫性非残毁性掌跖角化病，是一种常染色体隐性遗传的掌跖角化病(ppk)，属于弥漫性非表皮松解性掌跖角化症，是中国汉族人群最常见的掌跖角化症类型。该病于1977年首次在长岛被报告，其发病率相对较高，在我国汉族人群中发病率约3.1/10000。nppk的致病基因目前已明确为丝氨酸蛋白酶抑制剂b7(serpinfamilyb，serpinb7)。
3.serpinb7基因位于18q21.3，共有8个外显子，起始密码子位于2号外显子，终止密码子位于8号外显子，编码380个氨基酸。目前已报道serpi nb7基因上nppk致病突变有:c.796c＞t，c.218_219del aginstaaactttacct，c.455
‑
1g＞a，c.455g＞t，c.650
‑
653del ctgt，c.522
‑
523inst，c.336 2t＞g，c.122_127deltggtcc，c.830c＞t，c.382c＞t，c.635delg，c.271delc，c.1136g＞a，其中c.796c＞t突变频率最高，通过千人基因组数据库，c.796c＞t在中国正常人群中的携带频率为6/197。
4.nppk临床表现为皮肤红斑基础上轻度角化，临床特征为手掌、手背、腕部、足底、足背、踝部、跟腱等部位出现红斑、丘疹、斑块、角化、脱屑，伴手足多汗症，易伴发皮肤浅表真菌感染，多数患者伴有掌跖多汗和/或掌跖部位异味
[2
‑
3]
。目前尚未找到根治nppk的治疗方法，维甲酸类药物如维a酸软膏、他扎罗汀或激素软膏如丙酸氯倍他索霜，合并真菌感染联合抗真菌药物，这些治疗方法能缓解该患者的病情，但停药后容易复发
[6]
。
[0005]
目前，针对serpinb7基因突变的检测主要依赖于sanger测序。这一方法的基本原理是通过pcr扩增后，将获取的目的基因片段进行sanger测序，根据测序结果，分析是否存在致病性serpinb7基因突变。该方法的不利之处在于实验操作复杂、时间久、结果分析需要相应的专业知识、检测成本相对较高。因此高效、快速、操作简便的实时荧光定量pcr成为分子诊断领域的主要方法。
[0006]
根据ncbi dbsnp数据库数据，本试剂盒所检测4个位点：c.796c>t(rs142859678)、c.522_523inst(rs672601344)、c.650_653delctgt(rs534014297)、c.806_818delinst(rs1157759655)在正常东亚人群中的突变型等位基因频率分别为：0.0119、0.0032、0.003、0.0006，据此计算，上述四个位点在人群中的携带率约为3.7/100。
[0007]
[1]nagashima m.handbook of human genetics[m].tokyo:igaku shoin,1977:23
‑
27.
[0008]
[2]kabashima k，sakabe j，yamada y，et al.“nagashima
‑
type”keratosis as a novel entity in the palmoplantar keratoderma category[j].a rch dermatol，2008，144(3):375
‑
379.
[0009]
[3]kubo a,shiohama a,sasaki t,et al.mutations in serpinb7,encoding a member of the serine protease inhibitor superfamily,cause nagas hima
‑
type palmoplantar keratosis[j].am j hum genet,2013,93(5):945
‑
956.
[0010]
[4]zhang j,zhang g,ni c,et al.nagashima
‑
type palmoplantar keratosis in a chinese han population[j].mol med rep,2016,14(5):4049
‑
4054.
[0011]
[5]戴珊,南栩,赵红珊,等.长岛型掌跖角化病:serpinb7基因突变位点研究[j].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2017,16(2):108
‑
112.
[0012]
[6]一例长岛型掌跖角化症患者serpinb7基因的突变分析[j].右江医学,2018,46(1):23
‑
25.


技术实现要素：

[0013]
本发明的主要目的就是针对目前国内外均没有可用于nppk基因诊断的产品，提供一种人serpinb7基因突变快速分型的检测试剂盒。该试剂盒包括了特异性的引物探针组合物，以及其他配套试剂。同时本发明还提供了一种人serpinb7基因突变分型检测方法。本发明所提供的试剂盒可以特异、准确、快速检测长岛型掌趾角化症致病性基因，并适用于大规模推广应用。
[0014]
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种人serpinb7基因突变快速分型的检测试剂盒，包括引物探针组合物，pcr反应容器，外部质控容器；
[0015]
所述引物探针组合物为包括以下序列引物及探针的干粉或溶液：
[0016]
c.796c>t位点：序列如seq id no.1及seq id no.2所示的引物，序列如seq id no.3和seq id no.4所示探针；
[0017]
c.522_523inst位点：序列如seq id no.5及seq id no.6所示引物，序列如seq id no.7和seq id no.8所示探针；
[0018]
c.650_653delctgt位点：序列如seq id no.9、seq id no.10及seq id no.11所示引物，序列如seq id no.12、seq id no.13所示探针；
[0019]
c.806_818delinst位点：序列如seq id no.1及seq id no.14所示引物，序列如seq id no.15和/或seq id no.16所示探针；
[0020]
所述pcr反应容器包括dna聚合酶、dntp、mg
2
、特殊辅助增强剂、pcr缓冲液；
[0021]
所述外部质控容器包括突变对照和正常对照；所述正常对照为如序列seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20所述的核酸组合物，所述突变对照为如序列seq id no.21、seq id no.22、seq id no.23、seq id no.24所示核酸组合物。
[0022]
作为优选，任一所述探针的5’端连接荧光基团，任一所述探针的3’端连接荧光淬灭基团；所述荧光基团独立地选自fam、vic、cy5、rox、hex、joe、ned、texas red或cy3；所述淬灭基团独立地选自mgb、bhq
‑
1、bhq
‑
2、bhq
‑
3或tamra。
[0023]
作为优选，所述引物探针组合物分为第一反应剂及第二反应剂；
[0024]
所述第一反应剂为含有如下序列的引物及探针组合物的干粉或溶液：
[0025]
序列如seq id no.1及seq id no.2所示的引物、序列如seq id no.3所示探针，序列如seq id no.5及seq id no.6所示引物、序列如seq id no.7和seq id no.8所示探针，序列如seq id no.9、seq id no.10所示引物，序列如seq id no.12所示探针；
[0026]
所述第二反应剂含有如下序列的引物及探针组合物的干粉或溶液：
[0027]
序列如seq id no.1及seq id no.2所示的引物、序列如seq id no.4所示探针，序列如seq id no.9及seq id no.11所示引物、序列如seq id no.13所示探针，序列如seq id no.1及seq id no.14所示引物，序列如seq id no.15和/或seq id no.16所示探针。
[0028]
作为优选，在所述第一反应剂或第二反应剂内，任一所述探针所连接的荧光基团各不相同。
[0029]
作为优选，所述第一反应剂中，序列如seq id no.3所示探针所连荧光基团为fam，序列如seq id no.7所示探针所连荧光基团为cy5，序列如seq id no.8所示探针所连荧光基团为rox，序列如seq id no.12所示探针所连荧光基团为vic；
[0030]
所述第二反应剂中，序列如seq id no.4所示探针所连荧光基团为rox，序列如seq id no.13所示探针所连荧光基团为fam，序列如seq id no.15所示探针所连荧光基团为cy5，序列如seq id no.16所示探针所连荧光基团为vic。
[0031]
在实际检测过程中，第一反应剂与第二反应剂分开检测，每次检测4组不同的荧光通道。当检测反应剂为2组时，其准确性与操作便捷程度等达到最佳的平衡，可在避免荧光互相干扰的情况下，尽可能地减少操作次数。
[0032]
作为优选，所述第一反应剂及第二反应剂均为溶液中：各所述引物的终浓度为0.2
‑
1.2μm，优选为0.6μm；所述各所述探针的终浓度为0.1
‑
0.8μm，优选为0.35μm。
[0033]
作为优选，所述pcr缓冲液包括tris、10mm～500mm的kcl、10mm～500mm的(nh4)2so4、1％～50％质量含量的甘油、0.001mg/ml～1mg/ml的bsa、0.1％～10％质量含量的tween 20、1mm/ml～100mm/ml的二硫苏糖醇、0.1m～3m的甜菜碱以及0.1％～10％质量含量的dmso。
[0034]
作为优选，所述正常对照为如序列seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20所述的人工dna序列；所述突变对照为含有如序列seq id no.21、seq id no.22、seq id no.23、seq id no.24所示的质粒。
[0035]
在某些具体实施方式中，上述突变对照及正常对照被用于对照分析。
[0036]
作为优选，所述pcr缓冲液的ph值在25℃时为7.5～9.5。
[0037]
作为优选，该试剂盒适用的检测方法为taqman探针法；所述第一反应剂用于检测c.796c>t位点的突变型、c.522_523inst位点的野生型和突变型、c.650_653delctgt位点的野生型；所述第二反应剂用于检测c.796c>t位点的野生型、c.650_653delctgt位点的突变型、c.806_818delinst位点的野生型和突变型。
[0038]
所述的taqman探针法具体包括如下步骤：
[0039]
步骤1：对血样进行处理，edta抗凝全血样本采用样本释放剂处理，获得含有待测核酸的混合溶液；
[0040]
步骤2：以步骤1所获得的核酸溶液作为模板，用含有上述引物探针组合物的pcr扩增体系，选择性特异性扩增目标核酸序列；其中所述目标序列为各引物对所对应的核酸序列；
[0041]
步骤3：用仪器测量步骤2扩增后的荧光强度，进行定量分析，判断待测样本检测范围内的serpinb7基因上4个致病性突变位点的基因型。
[0042]
所述taqman探针法的定量检测原理为：当探针完整时检测不到荧光，在pcr延伸过
id no.9。具体地，c.650_653delctgt位点的野生型所对应的引物对为：序列如seq id no.9及seq id no.10所示引物。c.650_653delctgt位点的突变型所对应的引物对为：序列如seq id no.9及seq id no.11所示引物。
[0055]
表1. 4个位点的16条pcr扩增引物与荧光素标记特征
[0056][0057][0058]
表2为上述探针所要检测的对应位点的具体基因型。
[0059]
表2
[0060][0061]
上述所示的引物探针组合物，可以通过普通的taqman探针法进行检测。每次检测可以只针对一个位点的一个基因型进行检测，也可以一次同时检测多个位点。需要注意的是，同时检测多个位点时，在一次检测中各探针所用的荧光基团的激发波长应确保不同，且具有较高的可分辨性。
[0062]
实施例2检测盒
[0063]
本实施例中，用于长岛型掌趾角化症的分型检测试剂盒的所需包含的试剂如表3所示。在本实施例中，所述的检测反应液a与检测反应液b即组成所述探针组合物。pcr反应容器包括ser主反应液与反应a辅助液、反应b辅助液。其中，反应a辅助液、反应b辅助液的配方均为本领域常用的配方。
[0064]
表3
[0065][0066][0067]
在具体实施方式中，所述检测反应液a与检测反应液b中，各引物的终浓度可选范围是0.2
‑
1.2μm，各探针的终浓度可选范围是0.1
‑
0.8μm。
[0068]
在本实施例中，所述检测反应液a与检测反应液b中，各引物的终浓度是0.6μm，各探针的终浓度是0.35μm。
[0069]
其中所述的pcr反应缓冲液还包括如下组分：tris、10mm～500mm的kcl、10mm～500mm的(nh4)2so4、1％～50％质量含量的甘油、0.001mg/ml～1mg/ml的bsa、0.1％～10％质量含量的tween 20、1mm/ml～100mm/ml的二硫苏糖醇、0.1m～3m的甜菜碱以及0.1％～10％质量含量的dmso。所述pcr缓冲液的ph值在25℃时为7.5～9.5。
[0070]
其中，检测反应液a及b所包含的引物探针组合物所对应的具体序列如表4所示。
[0071]
表4
[0072][0073][0074]
利用所述试剂，通过荧光定量pcr仪对待测样本进行检测，具体步骤如下：
[0075]
1.样本预处理
[0076]
本试剂盒检测前不需要进行样本dna提取与纯化，仅需进行简易处理后即可用于检测。
[0077]
处理步骤：
[0078]
a)吸取预处理人抗凝全血3倍体积的沉淀处理缓冲液到0.2ml八联管中，推荐人抗凝全血的体积为25μl，最小体积不得少于10μl；
[0079]
b)加待处理抗凝全血到沉淀处理缓冲液中，用移液器来回吹吸几次，以彻底溶解残留在吸头上的血液，剧烈震荡1min(充分震荡混匀非常重要)；室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次，7000rpm离心5分钟，吸去上清，留下沉淀进行后续操作。
[0080]
c)向沉淀中加入80μl核酸释放缓冲液，剧烈震荡1min，混匀后得到后续用于检测得核酸溶液，若不立即检测，可置于
‑
20
±
5℃保存；
[0081]
本试剂盒所需的edta抗凝全血样本体积为25μl，建议根据检测需要的样本体积，处理后的混合溶液可直接用于本试剂盒检测。
[0082]
2.样本检测
[0083]
1)取出在
‑
15至
‑
25℃避光保存的试剂盒，将试剂盒组份平衡至室温；
[0084]
2)取出相应数量的96孔板或pcr反应管；
[0085]
3)根据当次实验所进行的反应数计算并移取相应量的试剂，反应数指标本检验量加上1个空白对照(以纯化水代替dna)、1个突变对照、1个正常对照，剩余试剂放回
‑
15至
‑
25℃避光条件下保存；
[0086]
4)按以表5方案配制反应a和反应b反应体系；
[0087]
表5：扩增反应管a/b配制
[0088][0089]
5)模板溶液指1中预处理后的样本混合溶液、空白对照品、突变对照品、正常对照品；
[0090]
6)将96孔板封膜或盖好pcr反应管盖，振荡均匀，2000rpm离心10秒，将其放入荧光定量pcr仪内；
[0091]
7)按表6条件进行pcr扩增：
[0092]
表6：扩增程序
[0093][0094]
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
[0095]
3.结果分析(请参照各仪器使用说明书进行设置，以下分析以abi系列仪器为例)
[0096]
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调整荧光信号阈值至突变对照品检测结果中所有野生型所对应的荧光通道无信号，野生型对照品检测结果中所有突变型所对应的荧光通道无检测信号。以abi 7500型荧光定量pcr仪为例，通常在荧光信号阈值为25000左右时可获得理想的检测结果。
[0097]
4.质量控制
[0098]
突变对照、正常对照和空白对照检测结果应符合以下要求，否则实验视为无效。
[0099]
1)本试剂盒反应液a和反应液b检测结果中荧光通道对应被检目的基因如下表7所示：
[0100]
表7：检测反应液a/b中荧光通道与被检基因对照表
[0101][0102]
2)空白对照品：
[0103]
反应液a和反应液b检测结果中任一检测通道ct值在38之前无信号。若信号升起，且ct值≤38，则此次实验结果无效，建议重新实验。
[0104]
3)突变对照品需同时满足：
[0105]
a)反应液a和反应液b检测结果中任一野生型所对应的通道ct值在38之前无信号；
[0106]
b)反应液a和反应液b检测结果中任一突变型所对应的通道有明显的信号升起，且ct值≤38。
[0107]
若a)中任一通道信号升起，且ct值≤38，或b)中任一通道无信号升起，或有信号升起但ct值＞38，则此次实验结果无效，建议重新实验。
[0108]
4)正常对照品需同时满足：
[0109]
c)反应液a和反应液b检测结果中任一突变型所对应的通道ct值在38之前无信号；
[0110]
d)反应液a和反应液b检测结果中任一野生型所对应的通道有明显的信号升起，且ct值≤38。
[0111]
若c)中任一通道信号升起，且ct值≤38，或d)中任一通道无信号升起，或有信号升起但ct值＞38，则此次实验结果无效，建议重新实验。
[0112]
5.结果判读
[0113]
在质控品正常的情况下，结果判读如下：
[0114]
待测样本中若任一检测通道有明显的信号升起，且ct值≤38，则该检测通道对应目标基因检测结果阳性。
[0115]
检测原理：taqman探针法的工作原理是利用了taq酶的5
’→3’
外切酶活性。由于探针的5’端标以荧光报告基团(如fam)，靠近3’端标以荧光淬灭基团mgb，两者之间构成能量传递结构。因此，当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基团吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当pcr反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交，当pcr进入延伸(复制)期，taq酶从引物3’端开始，随新链沿dna模板延伸，当延伸到探针结合的位置时，在其5
’→3’
端外切酶活性作用下，将探针切断。此时，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来。pcr反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。随着荧光信号的积累，便可通过荧光pcr仪检测出来。相对的，当探针序列与目的基因序列不匹配时，探针无法与目标序列结合，pcr延伸过程中就无法切断此特异性探针，自然也就不会出现相应的荧光信号。
[0116]
将两例serpinb7基因突变样本(具体基因型见表8)处理后核酸溶液采用本试剂盒重复检测10次，检测结果应为阳性，且符合相应的基因型别，且ct值精密度≦5.0％，说明本试剂盒重复性好。
[0117]
表8：2例基因突变样本对应基因型
[0118][0119]
将6例临床确诊为serpinb7基因突变样本(具体基因型见表9)处理后核酸溶液分别采用本试剂盒进行检测，检测结果和临床结果一致，说明本试剂盒准确性和特异性较好。
[0120]
表9：6例基因突变样本对应基因型
[0121]
样本编号基因位点基因型ser
‑
01c.796c>t纯合突变ser
‑
02c.522_523inst纯合突变ser
‑
03c.796c>t杂合突变ser
‑
04c.522_523inst杂合突变ser
‑
05c.806_818delinst杂合突变ser
‑
06c.650_653delctgt杂合突变
[0122]
本技术说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。
[0123]
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。
[0124]
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
[0125]
上述说明示出并描述了本技术的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本技术并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本技术的精神和范围，则都应在本技术所附权利要求的保护范围。