改善肠道屏障功能母乳低聚糖组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种改善肠道屏障功能母乳低聚糖组合物及其应用。


背景技术：

2.肠道菌群结构和组成与婴儿的健康息息相关，稳定的肠道菌群组成有助于有效的肠道屏障的建立以及平衡的粘膜免疫系统的组成。婴儿的肠道菌群结构对于成人来说相对简单，以双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、乳杆菌属、链球菌属、粪杆菌属等为主。影响其肠道菌群的因素也相对可控，有利于研究单一因素对其肠道菌群的影响。对于婴儿来说，其肠道菌群容易受各种遗传因素和环境因素的影响。而且饮食的改变或者抗生素的使用等都可能会导致婴儿获得免疫相关的疾病，如过敏、肠绞痛或者肠炎。因此，健康的肠道菌群环境有助于促进婴儿的健康发展。
3.母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,hmos)是母乳中重要的生物活性成份，也是影响婴儿肠道菌群组成的重要因素之一，具有结构多样性，目前已检测出超过200种结构。由于它在婴儿的肠道当中能够发挥益生元效应并且引导婴儿肠道菌群稳定以及建立更健康的肠屏障功能和促进粘膜免疫系统的发育，近几年来备受科学家们关注。hmos在上消化道当中是不被消化的，所以hmos会直接到达婴儿的大肠并且刺激婴儿肠道中的有益菌，比如双歧杆菌或者乳酸菌的生长，并产生对婴儿健康有益的短链脂肪酸和乳酸。除了刺激肠道中有益菌的生长外，hmos还可以直接影响到婴儿粘膜免疫系统和肠屏障功能的建立。
4.近年来国内外众多研究已经阐明了hmos对婴儿肠道的有益影响，但是由于hmos结构众多，性质复杂，不同结构的hmos对肠道的影响是不同的，目前关于不同结构的hmo
s
对婴儿肠道的发酵特性以及肠屏障功能的评价并不全面，缺乏hmos对不同类型的婴儿肠道菌群作用的深入研究。
5.中国专利申请cn112514997a公开了改善肠道微环境健康的母乳低聚糖及其应用。具体地，本发明提供了母乳低聚糖特别是岩藻糖基类低聚糖2
’‑
fl(2
’‑
岩藻糖基乳糖)或3
‑
fl(3
‑
岩藻糖基乳糖)在制备用于改善肠道微环境健康的食品中的应用，其中，所述改善肠道微环境健康包括：在肠道系统中作为益生元被肠道菌群利用并产气，降低ph以维持肠道微环境健康，和/或减少支链脂肪酸如异丁酸和/或异戊酸。本发明的母乳低聚糖用于添加在婴幼儿食品(包括婴幼儿配方粉、辅食、营养补充剂)，以及3岁以上儿童、青少年和成人的营养补充剂或食品中，具有广阔的应用前景。该专利申请关注的是单一母乳低聚糖的作用。
6.中国专利申请cn112075637a公开了一种减少肠道气体产生的组合物途，所述组合用于制备一营养组合物或制剂，所述营养组合物用于：(a)减少婴幼儿肠道气体的产生；和/或(b)抑制婴幼儿肠道产气梭菌的过度生长；其中，所述营养组合物中包括：(i)一种母乳低聚糖(hmo)；和(ii)一种益生菌微生物，所述益生菌微生物包括双歧杆菌。本发明的组合或营养组合物可以显著降低婴幼儿肠道产气、可较优的改善腹胀以及腹绞痛婴儿的肠道菌
群。但该专利申请重点关注的是肠道产气，而没有涉及肠道短链脂肪酸和支链脂肪酸的平衡以及维持双歧杆菌优势地位。


技术实现要素：

7.基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于提供能促进婴儿结肠产短链脂肪酸、减少气体产生并维持双歧杆菌优势地位，改善肠道屏障功能的益生元母乳低聚糖组合物。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
8.本发明一方面涉及一种母乳低聚糖组合物，其中包括2
’‑
fl(2
’‑
岩藻糖基乳糖)和gos(低聚半乳糖)，其中2
’‑
fl与gos的重量比例为1：1
‑
3；优选为1：1.8
‑
2.2；最优选为1：2。
9.在本发明的另一个优选实施方式中，所述的母乳低聚糖组合物还包括瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r52)、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis r33)和/或两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r71)。
10.在本发明的另一个优选实施方式中，所述的母乳低聚糖组合物还包括婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis r33)；优选的，所述婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis r33)与2
’‑
fl(2
’‑
岩藻糖基乳糖)的重量比为0.4
‑
0.6：1，其中婴儿双歧杆菌的浓度为106～10
11
cfu/g。
11.本发明另一方面涉及一种食品，其包括上述母乳低聚糖组合物，所述低聚糖组合物在食品中的终浓度为100mg/100g～104mg/100g。
12.在本发明的一个优选实施方式中，所述食品为营养补充剂、婴幼儿配方粉、辅食。
13.本发明另一方面还涉及上述母乳低聚糖组合物在制备改善微环境健康的食品中的应用。
14.在本发明的一个优选实施方式中，所述改善微环境健康包括能促进婴儿结肠产短链脂肪酸、减少气体产生并维持双歧杆菌优势地位，改善肠道屏障功能。
15.有益效果
16.本发明发现，以特定质量比的2
’‑
fl(2
’‑
岩藻糖基乳糖)和gos(低聚半乳糖)的组合，可以显著协同促进婴儿结肠产短链脂肪酸、减少气体产生并维持双歧杆菌优势地位，改善肠道屏障功能。本发明的母乳低聚糖组合物能显著改善肠道微环境健康，可用于添加在婴幼儿食品(包括婴幼儿配方粉、辅食、营养补充剂)，以及3岁以上儿童、青少年和成人的营养补充剂或食品中，具有广阔的应用前景。
附图说明
17.图1是示出益生元在发酵过程的产气动态的图；
18.图2是示出发酵24小时短链脂肪酸产量的图；
19.图3是示出发酵24h时样本中双歧杆菌属的相对丰度的图；
20.图4是示出发酵上清液对肠道屏障的作用的图。
21.图5是示出发酵上清液对肠道屏障的作用的图。
22.图6是示出发酵上清液对肠道屏障的作用的图。
具体实施方式
23.为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
25.实施例1：
26.2.1研究方法
27.研究对象：招募10名月龄为3
‑
7月、无抗生素摄入的健康顺产母乳喂养婴儿并收集其粪便，粪便中优势菌群为双歧杆菌(相对丰度>50％)。
28.益生元：a：2
’‑
fl(2
’‑
岩藻糖基乳糖)，b：gos(低聚半乳糖)，c：2
’‑
fl gos(1：2)，d：2
’‑
fl gos(1：4)，e:2
’‑
fl fos(低聚果糖)(1：2)。
29.益生元与益生菌的组合：f：2
’‑
fl gos 瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r52)(1：2：0.5)，g：2
’‑
fl gos 婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis r33)(1：2：0.5)
30.说明：上述比例指重量比
31.实验方法：1)体外大肠发酵：在厌氧环境下，分别将每份婴儿粪便与碳酸磷酸盐缓冲液按1:4(w/v)的比例混合并通过4层滤布过滤，制成粪便匀浆。将粪便浆液(1ml)、碳酸磷酸盐缓冲液(3ml)、50mg益生元或益生元与益生菌的组合(干基)分别加入厌氧瓶中并密封，于37℃恒温酵解4h、8h、12h和24h后取出，用于后续产气、产酸及菌群分析。2)代谢物含量测定：产气——使用标有刻度的注射器收集发酵气体进行气体产量测量；产酸——用气相色谱法测量发酵液中短链脂肪酸含量；菌群组成——通过16s rrna序列分析法分析发酵前后的粪便菌群组成。
32.2.2结果分析
33.2.2.1发酵产气速率
34.益生元在发酵过程的产气动态如图1所示，a
‑
g在发酵0
‑
24h不断释放气体，不同组别的益生元在各发酵时间段的产气速率不同，其中c、f和g组合能够有效的降低产气速率，由此说明2
’‑
fl gos以特定的比例进行组合有助于降低产气速率，具有明显的气体缓释作用，有助于减少婴儿肠胀气等不适症状。
35.2.2.2短链脂肪酸产量
36.益生元在发酵24h时的短链脂肪酸产量如图2所示，a
‑
g组发酵过程中产生的scfas主要为乙酸以及少量丙酸和丁酸，其中c、f和g组合能够更有效促进肠道系统中对人体有益的乙酸、丙酸等短链脂肪酸的产生，由此说明2
’‑
fl gos以特定的比例进行组合有助于短链脂肪酸的产生，特别是g组肠道有益代谢物短链脂肪酸的产生更加显著。
37.2.2.3益生元的肠道菌群调节作用
38.益生元对肠道菌群调节作用如图3所示，发酵前，10个婴儿个体粪便菌群以双歧杆菌为优势菌群，双歧杆菌属相对丰度>50％；a
‑
g组益生元组合发酵24h后，可能由于发酵环境的影响，e组双歧杆菌丰度上升不显著，a
‑
d，f
‑
g组双歧杆菌都有显著的提升。但c、f和g组双歧杆菌作为各处理组中的优势菌属，上升最显著。由此说明c、f和g组对于显著升高双歧
杆菌丰度，维持双歧杆菌优势地位具有改善作用，但三组之间没有实质性差异。
39.实施例2：
40.3.1研究方法
41.研究对象：招募10名月龄为3
‑
7月、无抗生素摄入的健康顺产母乳喂养婴儿并收集其粪便，粪便中优势菌群为双歧杆菌(相对丰度>50％)。
42.益生元：a：2
’‑
fl(2
’‑
岩藻糖基乳糖)，b：gos(低聚半乳糖)，c：2
’‑
fl gos(1：2)，d：2
’‑
fl gos(1：4)，e:2
’‑
fl fos(低聚果糖)(1：2)。
43.益生元与益生菌的组合：f：2
’‑
fl gos 瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r52)(1：2：0.5)，g：2
’‑
fl gos 婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis r33)(1：2：0.5)
44.说明：上述比例指重量比
45.实验方法：1)体外结肠发酵：根据实施例2进行体外结肠发酵获得发酵上清液即发酵代谢物。2)肠上皮细胞免疫功能测定：购买自美国典型菌种保藏中心(atcc)的人caco
‑
2细胞。在37℃、5％co2环境中，用含有10％fbs，1％双抗的1640培养基培养caco
‑
2细胞。将caco
‑
2细胞以6
×
105/cm2接种于1.33cm2的transwell聚碳酸酯半透膜(0.4μm)上并在有10％fbs，1％双抗的1640培养基中生长21天。在实验当天，将用体外发酵收集的发酵代谢产物与1μg/ml的lps共干预caco
‑
2细胞。具体来说，即用上述a
‑
g 7种组合的发酵代谢物以稀释8倍的浓度与1μg/ml的lps添加到transwell的顶腔处。将仅有0.1μg/ml的lps的组作为阴性对照组。在干预24h后，使用电阻仪测量经上皮电阻，同时将细胞裂解提取rna，转录成cdna后用rt
‑
qpcr检测紧密连接蛋白(occudin，zo
‑
2和claudin
‑
1)表达量。
46.3.2结果分析
47.3.2.1肠屏障功能
48.益生元对肠屏障功能的作用如图4、图5和图6所示，a
‑
g组益生元组合干预caco
‑
2细胞24h后，均表现出不同程度的保护肠屏障功能的功效，其中c、f和g组合能够更有效提高teer值，改善肠道屏障功能。a
‑
g组合紧密连接蛋白的表达量均有增加。和其他组相比，c、f和g组合能够更显著提高zo
‑
2和claudin
‑
1紧密连接蛋白基因的表达量，改善肠道屏障功能。
49.以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。