双靶点融合蛋白、编码基因、载体或宿主细胞及其应用与表达和纯化方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及双靶点融合蛋白、编码基因、载体或宿主细胞及其应用与表达和纯化方法。


背景技术：

2.成纤维细胞生长因子21(fgf21)是fgf家族成员之一，是一种特异性作用于肝脏、脂肪和胰岛组织的新型代谢调控因子。研究表明，fgf21具有降低机体血糖血脂、改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞等多种糖脂代谢调控的功能。因此，其在糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化和脂肪肝等多种代谢疾病的临床应用方面极具潜力。但临床试验发现fgf21类似物在糖尿病患者中并没有显著改善血糖的作用，这可能跟与设计的fgf21突变体的活性和体内稳定性有关，所以对fgf21进行基因工程改造、功能融合或化学修饰逐渐成为近年来研究的热点。
3.胰高血糖素样肽
‑
1(glp
‑
1)是回肠内分泌细胞生成的一种脑肠肽。glp
‑
1由胰高血糖素原基因表达，其有2种生物活性形式，分别为glp
‑
1(7
‑
37)和glp
‑
1(7
‑
36)酰胺，这两者仅有一个氨基酸序列不同，glp
‑
1约80％的循环活性来自glp
‑
1(7
‑
36)酰胺。由于glp
‑
1可抑制胃排空，减少肠蠕动，故有助于控制摄食来减轻体重。并且glp
‑
1还具有许多其他生物学特性及功能，如glp
‑
1可能发挥降脂、降压作用，从而对心血管系统产生保护作用。glp
‑
1在体内不稳定，易被dpp
‑
4酶水解，故提高glp
‑
1的稳定性和活性来增强药效在生物制药领域方面具有重要的意义。
4.类弹性蛋白多肽(elp)一类由vpgxg五肽重复序列串连而成的人工多聚物(其中x是除了pro的其它氨基酸)，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度溶液中呈可溶状态，在高于相变温度溶液中呈凝聚状态，而且此过程是可逆的。因此，elp融合蛋白不仅可用简单的离心法进行分离纯化，而且纯化效率可与亲和层析相当。另外，由于elp是根据体内蛋白序列合成，其生物相容性好、免疫原性低，已被广泛于药物载体的应用领域。
5.fgf21和glp
‑
1通过不同的靶细胞上的相应受体或相同靶细胞上的不同受体而发挥调节血糖血脂的作用。若二者的功能可以有效结合并产生协同效应，既能控制血糖，又能分解脂肪和降低体重，对于糖尿病和肥胖等代谢疾病的治疗，协同功效将比单一的fgf21或glp
‑
1类似物具有明显的优势。


技术实现要素：

6.基于此，为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供了一种双靶点融合蛋白、编码基因、载体或宿主细胞及其应用与表达和纯化方法，本发明提供的双靶点融合蛋白是将glp
‑
1或其类似物和人fgf21突变体通过类弹性蛋白(elp)连接而成，一方面提高蛋白的稳定性，另一方面增加蛋白的药效。并通过重组dna技术实现双靶点融合蛋白的制备和生产，该双靶点融合蛋白作为一种治疗药物或者药物组合物，将在高血糖和高血脂相关的疾病如
糖尿病、肥胖、脂肪性肝炎或心血管疾病的治疗上具有巨大的潜力。
7.本发明提供了一种双靶点融合蛋白，由以下几个片段组成：
8.r1
‑
r2
‑
r3、r3
‑
r2
‑
r1、r1
‑
l
‑
r2
‑
l
‑
r3、r3
‑
l
‑
r2
‑
l
‑
r1；
9.其中：r1为人成纤维细胞生长因子21(fgf21)或其类似物，r2为类弹性蛋白，r3为胰高血糖素样肽1(glp
‑
1)或其类似物；l为连接肽。
10.另外，根据本发明上述提供的一种双靶点融合蛋白，还可以具有如下附加的技术特征：
11.进一步的，所述r1片段的序列如seq id no：1所示，或者是与seq id no：1的氨基酸序列具有95％以上同源性的相同生物活性的衍生的蛋白质。
12.进一步的，所述r2片段的序列如seq id no：2所示，或者是将seq id no：2的单元序列增加或减少来衍生的蛋白质。
13.进一步的，所述r3片段的序列如seq id no：3氨基酸序列的蛋白质，或者是与seq id no：3的氨基酸序列具有95％以上同源性的相同生物活性的衍生的蛋白质。
14.进一步的，l连接肽由(ggggs)n氨基酸序列组成，n可以是0
‑
5之间的整数。
15.进一步的，包括药学上可接受的半衰期延长方式选自下列组成：聚合物，非结构化(多)肽链，血清蛋白，血清蛋白结合分子，抗体，免疫球蛋白，免疫球蛋白的fc区/域和免疫球蛋白结合域。
16.本发明还提出一种携带上述的双靶点融合蛋白的氨基酸序列所编码的基因及其载体或宿主细胞。
17.本发明还提出了根据上述的载体或宿主细胞在制备治疗糖尿病、肥胖、肝炎或肝炎相关疾病中的一种或多种疾病的药物中的应用。
18.本发明还提出一种治疗糖尿病、肥胖及非酒精性脂肪肝等代谢类疾病及肝炎或相关疾病的药物或药物组合物，包含上述的双靶点融合蛋白。
19.本发明还提出一种双靶点融合蛋白的表达和纯化方法，包括如下步骤：
20.携带双靶点融合蛋白基因表达载体的构建：根据大肠杆菌密码子偏好性，设计基因，将合成的含有目的基因片段与pet30a( )载体连接，转化大肠杆菌，获得表达菌种；
21.双靶点融合蛋白的表达：表达菌种培养到一定密度后通过iptg诱导所述双靶点融合蛋白的表达，继续培养4
‑
10h后收集菌体；
22.双靶点融合蛋白的纯化：获得的表达菌体，经破碎、离心、包涵体变性、复性、离子交换色谱、超滤等工序，最终获得高纯度的目标所述双靶点融合蛋白。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)、本发明的双靶点融合蛋白与单独fgf21和glp
‑
1类似物相比具有更长效、更稳定及更佳的治疗胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、高血糖症、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、肝损伤、肝硬化、肝癌、原发性胆汁性胆管炎及原发性硬化性胆管炎等代谢类疾病的功效。
24.(2)、本发明的双靶点融合蛋白治疗过程中均未出现glp
‑
1治疗过程引起肠胃不适及饮食下降的副作用，对机体正常生命活动影响较小。
附图说明
25.图1为gef融合蛋白的表达鉴定电泳分析结果；
26.图2为纯化制备的gef融合蛋白的液相分析结果；
27.图3为gef融合蛋白的体外温度稳定性检测；
28.图4为gef融合蛋白的免疫原性检测；
29.图5为gef融合蛋白对hfd诱导的nash小鼠的体重影响结果；
30.图6为gef融合蛋白对hfd诱导的nash小鼠的血糖和ogtt影响结果；
31.图7为gef融合蛋白对hfd诱导的nash小鼠的血脂和肝功的影响结果；
32.图8为gef融合白对hfd诱导nash模型小鼠脂肪性肝炎等相关指标的影响结果。
33.如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
34.为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。以下实施例中所描述的实验流程仅用于证明本发明的可行性，本发明的应用并不仅限于此。实施例中所提及的实验操作，如无特殊说明，均为常规实验方法；所提及的试剂耗材，如无特殊说明，均为常规试剂耗材。
35.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
36.本发明提供了一种新型的具有人fgf21和glp
‑
1的双功能生物活性的药物。
37.本发明的另一方面是提供所述双靶点融合蛋白编码的基因及含该基因序列的载体，还有含该载体的宿主细胞。
38.本发明的另一方面是提供一种双靶点融合蛋白协同治疗代谢类疾病的蛋白药物，可用于治疗糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗等高血糖、高血脂、肝炎或相关疾病包括降低肝脏重量和肝脏甘油三酯的含量、修复肝脏损伤、抑制炎症因子的表达，改善非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、肝损伤、肝硬化及肝癌原发性胆汁性胆管炎和/或原发性硬化性胆管炎等相关的代谢综合征。
39.在本发明的第一方面，提供了一种双靶点融合蛋白，它包括fgf21类似物、glp
‑
1类似物和类弹性蛋白(elp)的氨基酸序列以及各序列之间的0
‑
30个氨基酸组成的连接肽序列。fgf21氨基酸序列可以位于融合蛋白的c末端，也可以位于融合蛋白的n末端。较佳地，fgf21位于融合蛋白的c端。
40.在本发明的第二方面，提供了一种氨基酸序列，如seq id no.4所示，它编码本发明上述的融合蛋白。
41.在本发明的第三方面，提供了含有上述dna分子的表达载体。
42.在本发明的第四方面，提供了包含上述表达载体的宿主细胞。
43.在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明双靶点融合蛋白的方法，它包括以下步骤：
44.在合适表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白，和纯化制备所述的融合蛋白的工艺方法。
45.在本发明的第六方面，提供了一种药物及其组合物，它包括药学上可接受的载体
或赋形剂或稀释剂，以及含有本发明的融合蛋白。
46.在本发明的第七方面，提供了双靶点融合蛋白一种修饰方式包括药学上可接受的半衰期延长方式选自下列组成：聚合物(例如聚乙二醇(peg)，羟乙基淀粉(hes)，透明质酸，聚唾液酸)，非结构化(多)肽链(例如pas，xten)，血清蛋白(例如白蛋白)，血清蛋白结合分子(例如白蛋白结合域(abd)，白蛋白结合脂肪酸)，抗体，免疫球蛋白，免疫球蛋白的fc区/域和免疫球蛋白结合域。
47.以下为本发明中双靶点融合蛋白的人工序列表：
48.49.50.[0051][0052]
实施例1：重组融合蛋白的构建、表达及纯化
[0053]
(1)融合蛋白表达载体的构建
[0054]
根据大肠杆菌密码子偏好性设计融合蛋白glp1
‑
elp
‑
fgf21基因(gef)，其氨基酸序列如序列表中seq id no：4所示。基因通过至南京金斯瑞公司合成，同时在目的基因两端设计nde i与bamh i两酶切位点。将合成的含有目的基因片段的载体和pet30a( )分别用nde i与bamh i双酶切，酶切完毕后，胶回收各自需要的目标片段。使用t4
‑
dna连接酶将目的片段与原核表达载体pet30a( )连接，连接反应体系为10μl，混匀，4℃连接过夜，然后各自转化至大肠杆菌dh5α中。挑取阳性克隆，经过酶切鉴定后，即构建得到重组质粒pet30a
‑
glp
‑
elp
‑
fgf21(pet30a
‑
gef)。
[0055]
(2)融合蛋白的表达及纯化
[0056]
将含有正确序列的重组质粒pet30a
‑
glp
‑
elp
‑
fgf21转化至表达菌株bl21(de3)感受态细胞中。挑取单菌落分别接种至20ml含kan(50μg/ml)的lb培养基中，37℃培养8h，以体积比为1:100接种于另一20ml含kan(50_μg/ml)的lb培养基中，37℃培养，当a600在0.35左右时，加入iptg至终浓度为0.25mmol/l进行诱导，诱导温度为30℃，5h后收获菌体，用pbs重悬菌体，破碎菌体后离心，分别取上清和沉淀进行12％sds
‑
page电泳分析。结果显示glp
‑
elp
‑
fgf21(gef)融合蛋白在大肠杆菌中大部分以包涵体形式表达，表达量适中(如图1所示)。
[0057]
通过高密度发酵获得大量诱导后的菌体，通过0.45μm
‑
750kd中空纤维膜富集并洗涤菌体(20mmol/l tris，150mmol/l nacl，ph8.0缓冲液洗涤)，向菌体中加入溶菌酶(1mg/ml)，冰上放置30min，700
‑
800bar高压匀浆2
‑
3次，直至菌体破碎完全。利用750kd超滤中空纤维柱富集并洗涤包涵体(3
‑
5倍ph 7.0
‑
8.5 1m尿素洗涤液洗滤)；采用ph 7.0
‑
8.5 8m尿素变性液变性溶解包涵体后，20
‑
100倍ph 7.0
‑
8.5 1m尿素复性液稀释复性，最后通过5
‑
10kd中空纤维柱对复性液进行浓缩和缓冲液置换，获得复性融合蛋白。
[0058]
将复性蛋白过q阴离子交换色谱柱精纯，通过台阶梯度洗脱的方式纯化融合蛋白，获得的馏分经sds
‑
page分析鉴定，最终采用5
‑
10kd中空纤维柱对目标馏分进行纯化和缓冲液置换得纯品蛋白，并进行高效液相色谱分析。结果显示纯化后gef融合蛋白液相纯度达98％以上(如图2所示)。
[0059]
实施例2：gef融合蛋白体外稳定性分析
[0060]
纯化后的gef融合蛋白经0.22μm滤膜过滤除菌后，将蛋白在37℃放置72h。sds
‑
page分析结果表明，gef融合蛋白在37℃放置72h没有产生明显的降解条带(如图3所示)，说明gef融合蛋白具有良好的体外稳定性。
[0061]
实施例3：gef融合蛋白免疫原性分析
[0062]
取spf级8周龄雄性小鼠24只，随机分为对照组(vehicle)、elp
‑
f组(弹性蛋白融合fgf21)、gef组、g
‑
elp组(glp
‑
1融合弹性蛋白)，于每天早上8点半左右给予实验组相应的受试物一次，皮下注射，剂量2mg/kg，vehicle组注射相同体积的pbs，连续给药4周，4周后各实验组小鼠处死(前夜禁食)，眼球取血测定实验小鼠血清中抗重组蛋白相应抗体。
[0063]
实验结果如图4所示，positive control组有显著的免疫反应性，而elp
‑
f组、egf组、g
‑
elp组与vehicle组一样，检测不到免疫反应性，说明重组蛋白elp
‑
f、egf和g
‑
elp注射小鼠均未产生免疫原性。
[0064]
实施例4：融合蛋白在非酒精性脂肪性肝炎(nash)模型小鼠上治疗效果研究
[0065]
实验动物及饲养：c57bl/6小鼠及动物实验均在江苏集萃药康生物科技有限公司进行。
[0066]
取spf级6周龄雄性c57bl/6小鼠45只，喂食60％高脂饲料(hfd)4个月后，剔除体重异常，筛选血糖及体重值相对接近均值的成模小鼠32只，随机分为vehicle组、elp
‑
f组、egf组、g
‑
elp组，每组8只。另取8只同周龄雄性c57bl/6小鼠作为正常对照组(normal组)。每两天早上8点半左右给予实验组相应的受试物一次，皮下注射，剂量2mg/kg，vehicle和normal组注射相同体积的生理盐水，连续给药6周。实验过程中自由饮食、饮水。期间监测小鼠饮食和体重状况。给药4周后，检测个实验组小鼠空腹血糖水平(6h)及口服葡萄糖耐受(ogtt)。给药6周后，各实验组小鼠处死(前夜禁食)，测定实验小鼠肝脏谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、总胆固醇(chol)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl
‑
c)水平并进行组织切片染色和炎症指标检测。所得实验数据进行统计学分析。
[0067]
体重水平检测数据如图5所示，相对于生理盐水对照组，egf和g
‑
elp均可显著降低小鼠体重，而相对于g
‑
elp和elp
‑
f，egf组小鼠体重控制的更显著。
[0068]
给药4周后，各实验组小鼠空腹血糖及ogtt结果如图6所示，相对于生理盐水组，elp
‑
f组、egf组、g
‑
elp组小鼠的空腹血糖水平下降显著，且口服葡萄糖耐量都得到了显著的改善，同时egf组的血糖控制能力显著优于于elp
‑
f组和g
‑
elp组。
[0069]
给药6周后，各实验组小鼠血清血脂和肝功参数结果如图7所示，相对于生理盐水组，三种蛋白组均可显著降低模型小鼠血清中ast、alt、chol、ldl
‑
c的水平，而egf蛋白给药组的肝功和血脂水平改善更显著。
[0070]
此外，对各实验组小鼠肝组织切片进行he染色和油红染色，并对组织切片进行评分(从脂肪变性、炎性病灶和气球样化三个方面打分)。判定标准为：总和＜3分，即为非nash；评分总和＞5分，即为nash；3分＜评分总和＜5分，即为非确定性nash。病理结果显示(见图8，脂肪变性(黑色星号)，炎性病灶(红色小三角)，气球样化(蓝色小三角)，bar＝50μm)，以vehicle高脂喂养组为对照组，normal为普通饲料喂养，elp
‑
f组、egf组、g
‑
elp组给药组对脂肪肝有明显治疗效果，以gef效果最优，可显著降低肝脏脂肪空泡，并且egf组肝脏病理切片显微镜下几乎观察不到空泡，。
[0071]
根据以上实施例的方法与结果可知，通过本发明的设计并纯化制备了一种稳定性
及活性较佳的融合蛋白，通过动物实验的多项指标检测发现本发明制备的egf融合蛋白针对nash疾病上糖脂絮乱及脂肪肝症状的治疗效果显著优于单独的elp
‑
f、g
‑
elp蛋白，综上说明了该融合蛋白在代谢疾病的治疗方面具有良好的疗效和应用价值。
[0072]
综上，本发明上述实施例当中的双靶点融合蛋白、编码基因、载体或宿主细胞及其应用与表达和纯化方法，本发明的双靶点融合蛋白与单独fgf21和glp
‑
1类似物相比具有更长效、更稳定及更佳的治疗胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、高血糖症、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、肝损伤、肝硬化、肝癌、原发性胆汁性胆管炎及原发性硬化性胆管炎等代谢类疾病的功效；另一方面，本发明的双靶点融合蛋白治疗过程中均未出现glp
‑
1治疗过程引起肠胃不适及饮食下降的副作用，对机体正常生命活动影响较小。
[0073]
以上实施例描述了本发明的基本设计原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。