水稻GS2基因的荧光分子标记引物组及应用的制作方法

水稻gs2基因的荧光分子标记引物组及应用
技术领域
1.本发明涉及水稻选育技术领域，具体涉及水稻gs2基因的荧光分子标记引物组及应用。


背景技术：

2.中国是世界第一大水稻生产国和消费国，提高水稻产量在保障我国粮食安全、帮助农村人口就业与减少贫困人口等方面都具有重要作用。研究表明，选育大粒重穗水稻新品种，是挖掘水稻生产潜力、实现水稻单产提升的有效途径。国际水稻研究所有研究表明，千粒重与籽粒大小在一定范围内呈正相关，提高粒重可以增加产量。
3.gs2是一个控制水稻籽粒大小的基因，其通过促进细胞分裂和细胞膨大调控籽粒大小。该基因位于水稻第二染色体上，是一个半显性的位点，第3外显子上发生了tc
→
aa的替换进而产生大粒表型。gs2作为一个调控种子大小的稀有等位变异基因，在育种中的应用鲜有报道，且现有针对gs2基因选择的标记多为连锁标记和需要酶切的dcaps标记，这些标记需利用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶进行电泳检测，所使用到的检测材料有毒，不环保，且检测过程繁琐，分析时间长。因此，发明人抛开传统的分子标记，创建荧光分子标记，通过荧光扫描结合软件分析，快速实现基因分型。


技术实现要素：

4.基于以上问题，本发明提供水稻gs2基因的荧光分子标记引物组及应用，本发明可简便可靠的检测水稻品种中是否含有gs2基因，结合水稻gs2基因的荧光分子标记引物组和常规育种方法，可实现快速选育具有大粒特性的恢复系水稻品种，可加快大粒型杂交水稻的选育速度。
5.为解决以上技术问题，本发明提供了水稻gs2基因的荧光分子标记引物组，所述荧光分子标记引物组由如下三条引物构成：
6.gs2
‑
fat：gaaggtgaccaagttcatgctcgtttccacaggctttctttt；
7.gs2
‑
fca：gaaggtcggagtcaacggattcgtttccacaggctttcttga；
8.gs2
‑
r：gattccaagtactgcgagcg；
9.gs2
‑
fat的核苷酸序列如seq id no.1所示，gs2
‑
fca的核苷酸序列如seq id no.2所示，gs2
‑
r的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10.为解决以上技术问题，本发明还提供了荧光分子标记引物组在制备用于选育或鉴定大粒水稻的试剂盒中的应用。
11.进一步的，利用所述试剂盒选育水稻大粒恢复系的方法如下：
12.s1：利用水稻gs2基因的荧光分子标记引物组从水稻种质资源中筛选鉴定出含有gs2基因的材料，将含有gs2基因的材料作为父本，与生产上主要应用的杂交水稻恢复系进行杂交，获得杂交f1代种子；其中采用pcr扩增法进行筛选鉴定，并将pcr扩增产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，将荧光
信号值文件通过snp decoder工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果，根据基因型结果进行筛选；
13.s2：步骤s1中的f1代自交获得f2代，利用水稻gs2基因的荧光分子标记引物组从f2代中选择含有目标基因的农艺性状优良的单株进行回交；
14.s3：连续回交两代后，进行多代自交，每代均结合农艺性状并利用水稻gs2基因的荧光分子标记引物组进行选择，获得稳定的含有gs2基因的株系后，与不育系进行测配。
15.进一步的，所述pcr扩增反应体系为10μl，具体如下：5μl包含2条通用荧光引物的2
×
parms master mix，0.15μl 10mm gs2
‑
fat标记引物，0.15μl 10mm gs2
‑
fca标记引物，0.4μl 10mm gs2
‑
r通用反向引物，1μl模板dna，3.3μlddh2o；所述pcr扩增反应程序如下：94℃，4min；然后10个循环94℃，20s，65℃，
‑
0.8℃每循环，1min；然后32个循环94℃，20s，56℃，1min。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的荧光分子标记引物组可简便可靠的检测水稻品种中是否含有gs2基因，省去了后续电泳检测，避免使用有毒物质，更加环保；本发明可通过荧光扫描直接读取基因型的信号，结合软件分析，可快速实现基因分型，具有方便快捷、无污染、检测效率高和检测成本低等优势，更适合大批量的基因分型工作。
附图说明
17.图1为本发明的实施例对72份水稻种质资源的基因型鉴定结果图；
18.图2为本发明的实施例的r38与亲本g204和r789的粒型比较图。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
20.实施例：
21.gs2基因位于水稻第二染色体上，是一个半显性的位点，第3外显子上发生了tc
→
aa的替换进而产生大粒表型，gs2与gs2序列中的差异碱基如下：
[0022][0023]
因此，本实施例利用gs2与gs2在第3外显子上存在的tc
→
aa的碱基差异开发了水稻gs2基因的荧光分子标记引物组pm
‑
gs2，pm
‑
gs2由如下三条引物构成：
[0024]
gs2
‑
fat：gaaggtgaccaagttcatgctcgtttccacaggctttctttt；
[0025]
gs2
‑
fca：gaaggtcggagtcaacggattcgtttccacaggctttcttga；
[0026]
gs2
‑
r：gattccaagtactgcgagcg；
[0027]
gs2
‑
fat的核苷酸序列如seq id no.1所示，gs2
‑
fca的核苷酸序列如seq id no.2所示，gs2
‑
r的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0028]
上述pm
‑
gs2可用于制备用于选育或鉴定大粒水稻的试剂盒，试剂盒用于pcr扩增时的反应体系为10μl，具体如下：5μl2
×
parms master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μl 10mm gs2
‑
fat标记引物，0.15μl 10mm gs2
‑
fca标记引物，0.4μl 10mm gs2
‑
r通用反向引
物，1μl模板dna，3.3μl ddh2o。
[0029]
pcr扩增反应程序如下：94℃，4min；然后10个循环94℃，20s，65℃(
‑
0.8℃每循环)，1min；然后32个循环94℃，20s，56℃，1min。
[0030]
接下来，本实施例利用pm
‑
gs2选育水稻大粒恢复系，具体方法如下：
[0031]
s1：利用pm
‑
gs2从水稻种质资源中筛选鉴定出含有gs2基因的材料，将含有gs2基因的材料作为父本，与生产上主要应用的杂交水稻恢复系进行杂交，获得杂交f1代种子；其中采用pcr扩增法进行筛选鉴定，并将pcr扩增产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，将荧光信号值文件通过snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果，根据基因型结果进行筛选；
[0032]
如果扫描获得fam荧光信号，则为含aa碱基的gs2等位基因型，在散点分型图上分为绿色圆点；如果扫描获得hex荧光信号，则为含tc碱基的gs2等位基因型，在分型图上为蓝色圆点；如果扫描同时获得fam和hex两种荧光信号，则为含杂合aa/tc碱基等位基因型，在分型图上则用红色圆点表示；见附图1，本实施例提取了72份水稻材料的dna，利用pm
‑
gs2进行pcr扩增，并利用上述方法进行基因分型，结果筛选到两个水稻品种材料中包含有gs2基因，进而将筛选到的带有gs2基因且农艺性状较好的材料g204作为父本，与生产上主要应用的杂交水稻恢复系r789进行杂交，获得杂交f1代种子；
[0033]
s2：步骤s1中的f1代自交获得f2代，利用pm
‑
gs2从f2代中选择含有目标基因gs2基因的农艺性状优良的单株与r789进行回交；
[0034]
s3：连续回交两代后，进行多代自交，每代均结合农艺性状并利用pm
‑
gs2进行选择，每代的不同株系进行比较，挑选出最优良单株，连续自交直至株系基本稳定；对不同复选株系进行比较，再次进行分子标记检测，选择丰产性能好、穗粒性状优、抗性较强、具有检测分子标记的稳定株系，获得稳定的含有gs2基因的株系；
[0035]
s4：以上述稳定的株系为父本与不同的不育系进行测配，通过农艺性状、配合力和杂种优势对不同测配组合进行区系比较，最终挑选出综合性状最为优良的恢复系。
[0036]
本实施例最终获得的水稻大粒恢复系为r38，见附图2，为r38与亲本g204和r789的粒型比较图，见下表，为r38与亲本农艺性状比较结果，由附图2和下表可见，r38的千粒重、粒长、粒宽相较于亲本r789有明显的增加，而结实率相当。
[0037]
表1选育的大粒恢复系r38与亲本农艺性状比较
[0038][0039]
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。