一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵方法与流程

1.本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵方法。


背景技术：

2.深海菌的次级代谢产物种类丰富，骨架结构新颖多样，生物学活性显著，是发现药物先导化合物的重要来源。不恰当和不合理地使用抗生素已导致对抗菌素耐药性的发展与增加，出现全球性威胁。近年来世界各地出现多种“超级细菌”，它们对大多数抗生素都产生耐药性，给临床上病原菌感染等疾病的治疗带来巨大的挑战，从海洋放线菌中分离出新的次生代谢物具有巨大的潜力。而现有技术发酵手段发酵效率低下，产量低，环境污染大，非常不实用，因此需要一种新的发酵工艺提高抗菌剂产能。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了解决现有放线菌发酵效率低下、产量低等问题，提供一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵方法。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
5.一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵方法，所述方法为：将深海菌活化，菌株经过固态筛选配方和发酵条件筛选后，得到最佳发酵条件后，进行发酵，切块后用乙酸乙酯萃取后旋蒸获得微生物菌剂。
6.进一步地，所述方法包括以下步骤：
7.s1：准备需要筛选含培养基的种子瓶，利用高压蒸汽对种子瓶进行灭菌0.5h，灭菌完成后，将上述培养基均匀铺板，冷却后将深海菌涂布到平板上，发酵后用乙酸乙酯浸提3次，每次24小时，得到抗菌剂；所述培养基包括isp1培养基、lb培养基、waksman培养基、thronton培养基、tsb培养基、高氏一号培养基、甘露糖大豆培养基、蔗糖大豆培养基、葡萄糖酵母粉培养基；
8.s2：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别配置五种ph值的培养基，其分别为6、6.5、7、7.5和8，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标；
9.s3：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别发酵3、5、7、9和11天，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标；
10.s4：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别以26℃、28℃、30℃和32℃发酵培养，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标；
11.s5：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别以选取nacl、mgso4、feso4和k2hpo4筛选无机盐发酵培养，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标；
12.s6：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别以0.5％、1.5％、2.5％、3.5％和4.5％的接种量发酵培养，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标。
13.本发明相比于现有技术的有益效果为：本发明完成了抗菌剂的发酵，生产效率高，
而且废渣可以重复当复合肥进行利用，使得废料不会被浪费，而且得到的抗菌剂产量高，适合大量推广使用。
具体实施方式
14.下面将结合本发明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.为了便于理解本发明，下面对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
16.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
17.工作原理：首先准备发酵平板，利用高压蒸汽对其进行灭菌0.5h；灭菌完成后，将灭过菌且筛选好的培养基倒入平板中，在冷却凝固前对培养基进行ph值测试，将ph值调到7.5；冷却凝固后，将活化好的菌液涂布到平板上，发酵完成后，切块后用乙酸乙酯浸提24h，浸提三次，37℃减压旋蒸，加水过滤后得到抗菌液。
18.具体实施方式一：本实施方式记载的是一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵方法，所述方法为：将深海菌活化，菌株经过固态筛选配方和发酵条件筛选后，得到最佳发酵条件后，进行发酵，切块后用乙酸乙酯萃取后旋蒸获得微生物菌剂。
19.本发明首先获取所需应用性微生物，经过纯化和分离，获得纯种菌株，纯种菌株经过液体筛选配方和固态筛选配方应用性筛选后，然后进行发酵，分离后获得微生物菌剂。
20.具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵方法，所述方法包括以下步骤：
21.s1：准备需要筛选含培养基的种子瓶，具体地，用培养基的抗菌液对金黄色葡萄球菌做抑菌实验，用抑菌圈的大小来筛选，利用高压蒸汽对种子瓶进行灭菌0.5h，灭菌完成后，将上述培养基均匀铺板，冷却后将深海菌涂布到平板上，发酵后用乙酸乙酯浸提3次，每次24小时，得到抗菌剂；所述培养基包括isp1培养基、lb培养基、waksman培养基、thronton培养基、tsb培养基、高氏一号培养基、甘露糖大豆培养基、蔗糖大豆培养基、葡萄糖酵母粉培养基；s1中，初始选择的条件就是菌培养的常规条件，发酵7天，ph为7.5，接种量1.5％，温度28摄氏度，然后s2
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s6就改其中的一个条件做优化；
22.s2：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别配置五种ph值的培养基，其分别为6、6.5、7、7.5和8，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标；
23.s3：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别发酵3、5、7、9和11天，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标；
24.s4：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别以26℃、28℃、30℃和32℃发酵培养，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标；
25.s5：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别以选取nacl、mgso4、feso4和k2hpo4筛选无机盐发酵培养，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标；
26.s6：用s1步骤筛选得到的培养基配方，分别以0.5％、1.5％、2.5％、3.5％和4.5％的接种量发酵培养，用抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈作为评价指标。
27.根据上述的s1～s6，筛选出的最优条件为isp1为最佳发酵培养基，温度28摄氏度，无机盐没有合适的，时间是7天，接种量3.5％，ph为7.5。
28.本发明通过步骤s1
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s6步骤完成抗菌剂的发酵工艺，其生产效率高，废物可回收利用，适合大量推广使用。
29.具体实施方式三：具体实施方式二所述的一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵工艺，所述步骤s1～s6中，蒸汽温度为121℃，压强为0.103mpa
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0.168mpa。
30.具体实施方式四：具体实施方式二所述的一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵工艺，所述步骤s2～s5中，所加入的菌液的体积为培养基的体积1.5％。
31.具体实施方式五：具体实施方式二所述的一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵工艺，所述步骤s2中，用于测量种子罐ph值的工具为进口精密ph计、精密ph试纸或常规ph计。
32.具体实施方式六：具体实施方式二所述的一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的发酵工艺，所述步骤s1、s2、s3、s5和s6中，温度为28℃。
33.具体实施方式七：具体实施方式二所述的一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的制备工艺，所述步骤s1～s6中，需要对平板做镜检，需要检验菌体的形态和生长状况。
34.具体实施方式八：具体实施方式二所述的一种基于深海菌的定向筛选的抗菌剂的制备工艺，所述步骤s1、s3～s6中，ph调至7.5左右。
35.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其效物界定。