稳定化的糖苷水解酶变体的制作方法

技术特征：
1.一种具有糖苷水解酶(ec 3.2.1.
‑
)、纤维素酶或内切葡聚糖酶活性的亲本多肽的变体，其中该变体包含催化结构域、富含脯氨酸的接头区域和碳水化合物结合模块(cbm)，并且其中该变体具有糖苷水解酶、纤维素酶或内切葡聚糖酶活性，其中该变体具有与该亲本相比的在包含蛋白酶的水性组合物中的改善的稳定性。2.一种具有糖苷水解酶(ec 3.2.1.
‑
)、纤维素酶或内切葡聚糖酶活性的亲本多肽的变体，其中该变体包含催化结构域、工程化的接头区域和碳水化合物结合模块(cbm)，并且其中该变体具有糖苷水解酶、纤维素酶或内切葡聚糖酶活性，其中该变体具有与该亲本相比的在包含蛋白酶的水性组合物中的改善的稳定性。3.根据前述权利要求中任一项所述的变体，该变体是家族gh45内切葡聚糖酶。4.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该cbm是cbm1。5.一种变体，该变体是具有糖苷水解酶活性，例如内切葡聚糖酶活性，优选地gh45内切葡聚糖酶活性的杂合多肽，该变体包含(a)来自具有糖苷水解酶活性，例如内切葡聚糖酶活性，优选地gh45内切葡聚糖酶活性的多肽的催化结构域，(b)选自由以下组成的组的接头：ppppppp(seq id no:31)、pppppppg(seq id no:30)、spspspspsp(seq id no:58)和spspspspspg(seq id no:25)，和(c)碳水化合物结合模块(cbm)，优选地cbm1，优选地其中该变体具有与亲本相比的在包含蛋白酶的水性组合物中的改善的稳定性。6.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中改善的稳定性根据实例2和/或实例7中所述的测定来确定。7.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包含n
‑
末端催化结构域和c
‑
末端cbm。8.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包含c
‑
末端催化结构域和n
‑
末端cbm。9.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体展示了例如，在蛋白酶的存在下储存后，相对于该亲本的改善的织物或纺织品护理和/或改善的洗涤性能。10.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头包含至少25％脯氨酸，例如，至少28％脯氨酸、至少30％脯氨酸、至少35％脯氨酸、至少40％脯氨酸、至少50％脯氨酸，例如，至少60％、至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％脯氨酸。11.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头具有至少四个氨基酸的长度，并且包含以下任选重复基序中的一个或多个：a.[p/s/t/r/k/d/e]p，优选地[p/s/t]p，最优选地(sp)
a
，a＝2
‑
10或p
b
，b＝4
‑
20，优选地4
‑
15；b.p[s/t/r/k/d/e/n/q]p[s/t/r/k/d/e](seq id no:102)，优选地p[s/e]pt(seq id no:109)。12.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头具有至少四个氨基酸的长度，并且包含以下任选重复基序：[s/t/r/k/d/e]p[s/t/r/k/d/e/n/q][p/s/t/r/k/d/e][p/s/t/r/k/d/e]p和/或p[p/s/t/r/k/d/e][p/s/t/r/k/d/e]。13.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头包含：a.(sp)
a
，a＝2
‑
10；b.(ps)
a
，a＝2
‑
10；
c.p
b
，b＝4
‑
20，优选地4
‑
15；d.(pept(seq id no:125))
c
，c＝2
‑
5；e.(pspt(seq id no:104))
d
，d＝2
‑
5；f.(p[s/t/r/k/d/e/n/q]p[s/t/r/k/d/e](seq id no:102))
e
，e＝2
‑
5；g.([s/t/r/k/d/e]p)
f
，f＝2
‑
10，优选地2
‑
5；h.([s/t/r/k/d/e/n/q]p[s/t/r/k/d/e])
g
，g＝2
‑
6；i.([s/t/r/k/d/e/n/q][s/t/r/k/d/e/n/q]p)
h
，h＝2
‑
5；j.(tp)
i
，i＝2
‑
10；k.([s/t/p][s/t/p][s/t/p])
j
，j＝2
‑
11；和/或其组合，其中组合包含各个单体单元。14.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头包含：a.(sp)
a
，a＝2
‑
10；b.(ps)
a
，a＝2
‑
10；c.p
b
，b＝4
‑
20，优选地4
‑
15；或d.(pept(seq id no:125))
c
，c＝2
‑
5。15.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头具有至少4个氨基酸且不超过30个氨基酸的长度，例如4
‑
28个氨基酸，优选地4
‑
20个氨基酸，或甚至4
‑
10个氨基酸，例如4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸或10个氨基酸的长度。16.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头包含spsp(seq id no:130)、spspsp(seq id no:131)、spspspsp(seq id no:132)、spspspspsp(seq id no:58)、spspspspspsp(seq id no:133)、spspspspspspsp(seq id no:134)、spspspspspspspsp(seq id no:135)、pppp(seq id no:27)、ppppp(seq id no:28)、pppppp(seq id no:29)、ppppppp(seq id no:31)、pppppppp(seq id no:136)、ppppppppp(seq id no:137)、pppppppppp(seq id no:138)、ppppppppppp(seq id no:139)、pppppppppppp(seq id no:140)、ppppppppppppp(seq id no:141)、pppppppppppppp(seq id no:142)、ppppppppppppppp(seq id no:143)、peptpept(seq id no:144)、peptpeptpept(seq id no:145)、peptpeptpeptpept(seq id no:146)、peptpeptpeptpeptpept(seq id no:79)、psptpspt(seq id no:147)、psptpsptpspt(seq id no:148)、psptpsptpsptpspt(seq id no:149)、psptpsptpsptpsptpspt(seq id no:150)、spssps(seq id no:151)、spsspssps(seq id no:152)、spsspsspssps(seq id no:153)、spsspsspsspssps(seq id no:154)、tpttpt(seq id no:155)、tpttptg(seq id no:96)、tpttpttpt(seq id no:156)、tpttpttpttpt(seq id no:157)、tpttpttpttpttpt(seq id no:158)、peptprptpeptprpt(seq id no:159)、peptpkptpeptpkpt(seq id no:160)、peptpqptpeptpqpt(seq id no:161)、prptpeptprpt(seq id no:162)、pkptpeptpkpt(seq id no:163)、peptpqpt(seq id no:164)、peptpqptpept(seq id no:165)、peptprptpeptprptg(seq id no:85)、peptpkptpeptpkptg(seq id no:87)、peptpqptpeptpqptg(seq id no:88)、prptpeptprptg(seq id no:89)、pkptpeptpkptg(seq id no:90)、peptpqptg(seq id no:91)、peptpqptpeptg(seq id no:92)、pppggpggpgtptstapgsgptspgggsg(seq id no:82)中的一
个或多个。17.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头进一步包含在c
‑
末端位置的甘氨酸。18.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该催化结构域包含与如seq id no:1的位置1
‑
212、seq id no:2的位置1
‑
211、seq id no:3的位置1
‑
210、seq id no:4的位置1
‑
211所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性的氨基酸序列。19.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该cbm包含与如seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:173、seq id no:174、seq id no:175、seq id no:176、seq id no:177、seq id no:178、seq id no:179、seq id no:180、seq id no:181、seq id no:182、seq id no:183、seq id no:184、seq id no:185、seq id no:186、seq id no:187、seq id no:188、seq id no:189、seq id no:190、seq id no:191、seq id no:192、seq id no:193、seq id no:194、seq id no:195、seq id no:196、seq id no:197、seq id no:198、seq id no:199、seq id no:200所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，例如，至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性的氨基酸序列。20.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头选自由以下组成的组：ttpptptptptpg(seq id no:12)ttptpptptptptpg(seq id no:13)ttptptpptptptptpg(seq id no:14)ttptptptpptptptptpg(seq id no:15)tpptpptpptpptpptpptpptpptpptpptppg(seq id no:16)tpttpttpttptg(seq id no:17)tpttpttpttpttpttptg(seq id no:18)spsspsspsspsg(seq id no:19)spsspsspsspsspsg(seq id no:20)sppsppsppsppsppg(seq id no:21)sppsppsppsppsppsppsppsppsppsppg(seq id no:22)ppsspsspsspsspsspsspsg(seq id no:23)spspg(seq id no:24)spspspspspg(seq id no:25)tptptptptpg(seq id no:26)pppp(seq id no:27)ppppp(seq id no:28)pppppp(seq id no:29)pppppppg(seq id no:30)ppppppp(seq id no:31)
ppppppppg(seq id no:32)pppppppppg(seq id no:33)ppppppppppg(seq id no:34)pppppppppppg(seq id no:35)pppppppppppppg(seq id no:36)peptpeptg(seq id no:37)peptpeptpeptg(seq id no:38)peptpeptpeptpeptg(seq id no:39)peptpeptpeptpeptpeptg(seq id no:40)psptpsptpsptpsptg(seq id no:41)psptpsptpsptpsptpsptg(seq id no:42)pqptpqptg(seq id no:43)pdptpdptg(seq id no:44)prptpeptg(seq id no:45)pqptpeptg(seq id no:46)pspnspnspng(seq id no:47)peptprptg(seq id no:48)pqptpeptpqptpeptpqptpeptpqptg(seq id no:49)pdptpdptpdptg(seq id no:50)pqptpqptpqptpqptg(seq id no:51)pqptpeptpqptpeptg(seq id no:52)spspspspppg(seq id no:53)spspspspdpg(seq id no:54)spspspspkpg(seq id no:55)spspspspapg(seq id no:56)spspspspspsg(seq id no:57)spspspspsp(seq id no:58)spspspspsps(seq id no:59)spspspspspp(seq id no:60)spspspspspe(seq id no:61)spspspspspn(seq id no:62)spspspspspgg(seq id no:63)spspspspspk(seq id no:64)peptpeptp(seq id no:65)peptpeptr(seq id no:66)peptpeptpeptp(seq id no:67)peptpeptpeptpeptpsptg(seq id no:68)peptpeptpeptpeptptptg(seq id no:69)peptpeptpeptpeptpgptg(seq id no:70)
peptpeptpeptpeptpdptg(seq id no:71)peptpeptpeptpeptpetg(seq id no:72)peptpeptpeptpeptpeptd(seq id no:73)peptpepte(seq id no:74)peptpeptpeptpeptpep(seq id no:75)peptpeptpeptpeptpspt(seq id no:76)peptpeptpeptpeptprptt(seq id no:77)peptpeptpeptpeptpeptt(seq id no:78)peptpeptpeptpeptpept(seq id no:79)peptpeptpeptpeptpepts(seq id no:80)peptpeptpeptpeptpeptr(seq id no:81)pppggpggpgtptstapgsgptspgggsg(seq id no:82)pppggpggtgtptstapgsgptspgggsg(seq id no:83)ppsggpggpgtptstapgsgptspgggsg(seq id no:84)peptprptpeptprptg(seq id no:85)pkptpeptpkptpeptg(seq id no:86)peptpkptpeptpkptg(seq id no:87)peptpqptpeptpqptg(seq id no:88)prptpeptprptg(seq id no:89)pkptpeptpkptg(seq id no:90)peptpqptg(seq id no:91)peptpqptpeptg(seq id no:92)tpptppg(seq id no:93)spsspsg(seq id no:94)spsspsspsg(seq id no:95)tpttptg(seq id no:96)；以及tpttpttptg(seq id no:97)。21.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该接头是ppppppp(seq id no:31)、pppppppg(seq id no:30)、spspspspsp(seq id no:58)或spspspspspg(seq id no:25)。22.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体选自由以下5组成的组：
23.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体选自由以下组成的组：变体401、变体402、变体403、变体404、变体405、变体406、变体407、变体408、变体409、变体410、变体411、变体412、变体413、变体414、变体415、变体416、变体417、变体418、变体419、变体420、变体421、变体422、变体423、变体424、变体425、变体426、变体427、变体428、变体429和变体430。24.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码根据权利要求1
‑
23中任一项所述的变体。25.一种核酸构建体，该核酸构建体包含根据权利要求24所述的多核苷酸。26.一种表达载体，该表达载体包含根据权利要求24所述的多核苷酸。27.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求24所述的多核苷酸。28.一种产生根据权利要求1
‑
23中任一项所述的具有糖苷水解酶(ec3.2.1.
‑
)、纤维素酶或内切葡聚糖酶活性的变体的方法，该方法包括a.在适合于表达该变体的条件下培养根据权利要求27所述的宿主细胞；以及b.回收该变体。29.一种用于获得具有糖苷水解酶(ec 3.2.1.
‑
)、纤维素酶或内切葡聚糖酶活性的变体的方法，该方法包括向亲本糖苷水解酶中引入富含脯氨酸的接头区域；和回收该变体。30.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含根据权利要求1
‑
23中任一项所述的变体。31.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1
‑
23中任一项所述的变体。32.根据权利要求31所述的组合物，该组合物进一步包含蛋白酶。33.根据权利要求31
‑
32中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：(另外的)蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、(另外的)糖酶、(另外的)纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、核酸酶、地衣多
糖酶、氧化酶例如漆酶、和/或过氧化物酶，及其组合。34.根据权利要求31
‑
33中任一项所述的组合物，该组合物是洗涤剂组合物，优选地液体洗涤剂组合物。35.根据权利要求1
‑
23中任一项所述的变体或根据权利要求31
‑
34中任一项所述的组合物用于织物或纺织品护理的用途，例如用于预处理有污渍的织物或用于复原纺织品(例如，通过去除绒毛或绒球)，以恢复织物在长期使用后的视觉和感觉特性，以比得上新的纺织品。

技术总结
披露了例如在蛋白酶的存在下，具有改善的稳定性的糖苷水解酶变体、以及此类变体在洗涤剂应用例如衣物洗涤或餐具洗涤中的用途。剂应用例如衣物洗涤或餐具洗涤中的用途。


技术研发人员：L.吉格 F.W.拉斯穆森 S.G.卡斯加德 L.安德森 K.詹森 R.A.帕赫 D.M.K.克利特加德 M.L.D.奥弗加德 C.I.约恩森
受保护的技术使用者：诺维信公司
技术研发日：2020.04.08
技术公布日：2021/12/14