一种耐高盐降解废水COD菌株及筛选方法和应用与流程

一种耐高盐降解废水cod菌株及筛选方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐高盐降解废水cod菌株及筛选方法和应用。


背景技术：

2.近年来我国制药市场蓬勃发展，这势必造成制药废水的激增。制药废水中含有大量有机和无机污染物，成分复杂，给环境造成严重污染。其中高盐废水占废水总量的5％以上，并以每年2％的速度快速上升。高盐废水是指总含盐量(以氯化钠含量计)≥1％的废水，会使水体富营养化和土地盐碱化。
3.目前处理制药废水主要有化学法、物化法和生物法。化学法需要配置大型设备、添加药剂，不仅能耗高，产生的大量排水也难以回用。物化法需要对废水进行预处理，去除废水中的油、悬浮物和有害气体等，必要时还需要调整ph值，处理效率低且运行成本高。生物法处理效率高、成本低，是废水处理的首选方法。但是制药废水中含有的毒性苯、醛、酯、醚类物质，卤化物和各类抗生素对微生物具有极大的抑制和毒害作用，一般微生物不能正常生长。而废水的高盐度会使细胞内外的渗透压过大导致微生物死亡，或者抑制酶活影响生长代谢。为了提高生物法的处理效果，需要驯化培养出既能在具有生物毒性的废水中生存，又能耐受高盐，高效降解cod的菌株。
4.目前一些学者在高盐度废水处理方面也发表了一些研究。郑丹等利用嗜麦芽寡养单胞菌在高浓度硫酸根离子环境中去除皂素废水有机污染物，其cod去除效率达62.34％。廖焰焰等筛选出毕赤酵母，将菌株运用于高盐医药废水处理，cod去除率达73％。但能够耐受并可高效降解制药厂排放的成分复杂、毒性大、高盐度的制药废水的寡养单胞菌，却并无相关报道。


技术实现要素：

5.(一)要解决的技术问题
6.鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种耐高盐降解废水 cod菌株，所述菌株能够用于降解成分复杂、高cod、高盐度的制药废水，为生物法处理废水提供了优质菌株。本发明还涉及该菌株的筛选方法和应用。
7.(二)技术方案
8.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
9.第一方面，本发明提供一种耐高盐降解废水cod菌株，所述菌株为寡养单胞菌(stenotrophomonas pavanii)，命名为stenotrophomonas pavaniim02，已于2021年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.22898，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
10.所述菌株具有可耐受高浓度盐分、降解高cod值废水的特点，可应用到成分复杂(如含具有毒性的苯、醛、酯、醚类物质、卤化物和抗生素等成分的废水)的制药废水中，用于
降解废水的cod值。
11.第二方面，本发明提供一种耐高盐降解废水cod菌株的筛选方法，其包括：
12.s1、耐盐菌的定向驯化
13.从制药厂废水处理的二沉池中取得活性污泥，在mbbr装置中曝气好氧培养，培养期间加入氯化钠和营养物质，并逐步提高培养液中氯化钠浓度，运行2个月，直至在高浓度氯化钠的废水中，cod去除率稳定在82.5％以上；
14.s2、纯化单菌落
15.从mbbr装置的填料上取新鲜污泥混合物，混匀，自然沉降后，取上清液为筛选菌液；
16.取筛选菌液进行梯度稀释至10
‑5倍，取不同稀释度的菌悬液分别涂布在盛有固体基础培养基的平板上、于恒温箱中倒置培养，直至有明显菌落产生；在适宜梯度的平板里挑取形态、大小、颜色不同的单菌落，多次划线培养，直至得到纯化的单菌落；
17.s3、耐盐菌的筛选
18.分别配制氯化钠浓度为0
‑
250g/l的选择性培养基，将纯化后单菌落，制成菌悬液，以1.9％
‑
2.1％(优选2.0％)的接种浓度(体积百分比浓度)接入所述选择性培养基中，并在摇床中恒温培养3
‑
4天，筛选出耐高盐菌株；
19.s4、耐盐菌的鉴定
20.将筛选的耐高盐菌株涂布在盛有固体基础培养基的平板上、于恒温箱中倒置培养，对菌落观察形态学特征，并进行16s rdna序列测定，对菌株进行同源性分析，构建系统发育树，确定菌株种属。
21.经形态学特征观察，菌落呈白色、圆形、边缘规则，表面光滑、湿润，侧面观察为扁平状，显微镜观察菌体呈短棒状；经16s rdna序列测定，与stenotrophomonas pavanii的同源性达到99％，将菌株和其他几个相似度高的同源菌构建系统发育树，确定该菌株为stenotrophomonaspavanii种属的新菌株。
22.根据本发明的较佳实施例，s1中营养物质为：葡萄糖0.8
‑
1.2g/l(优选为1g/l)、硫酸铵0.2
‑
0.3g/l(优选为0.25g/l)、磷酸氢二钠0.04
‑
0.06g/l (优选为0.05g/l)、硫酸钾0.04
‑
0.05g/l(优选为0.45g/l)。
23.优选地，在步骤s1中，氯化钠在mbbr装置中的初始浓度为4
‑
5g/l，培养过程中逐步提高至60
‑
80g/l。
24.根据本发明的较佳实施例，s2中固体基础培养基为：牛肉膏 2.8
‑
3.5g/l(优选为3g/l)、蛋白胨6
‑
10g/l(优选为8g/l)、氯化钠20
‑
40g/l (优选为30g/l)、琼脂18
‑
22g/l(优选为20g/l)，ph 7.0
‑
8.0，经灭菌后制得。s2中恒温箱培养温度为29
‑
31℃，优选为30℃。
25.根据本发明的较佳实施例，s3中的选择性培养基为：葡萄糖 0.18
‑
0.22/l(优选为0.2g/l)、硫酸铵0.92
‑
0.96g/l(优选为0.943g/l)、磷酸二氢钾0.15
‑
0.2g/l(优选为0.18g/l)、硫酸镁0.08
‑
0.12g/l(优选为 0.1g/l)、氯化钠0
‑
250g/l，ph 7.0
‑
8.0，经灭菌后制得。s3中培养条件为：29
‑
31℃(优选为30℃)，180
‑
210r/min，摇床培养72
‑
80h。
26.优选地，不同选择性培养基中的氯化钠的浓度为0g/l、20g/l、40g/l、 80g/l、140g/l、200g/l、250g/l。
27.根据本发明的较佳实施例，s4中的固体基础培养基与步骤s2中的固体基础培养基
相同，培养条件为:倒置于恒温培养箱中，29
‑
31℃(优选为 30℃)培养20
‑
24h。
28.根据本发明的较佳实施例，s4中，经鉴定筛选的菌株甲基红实验为阳性，v
‑
p实验为阴性，革兰氏染色为阳性，为兼性好氧菌，最适生长 ph值为7.0
‑
8.0；菌株的形态学特征和理化性质，与已经报道的 stenotrophomonas pavanii相似但存在一定差异，16s rdna序列测定为一株新的stenotrophomonas pavanii菌株，命名为stenotrophomonas pavaniim02，已于2021年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.22898。
29.第三方面，本发明提供一种耐高盐降解废水cod菌株的应用，其用于降解高浓度氯化钠废水的cod。
30.优选地，所述应用的方法包括：
31.步骤1：菌株放大培养，得到放大培养的菌液；
32.步骤2：将菌液以1.9
‑
2.1％(优选为2％)接种浓度(体积百分比浓度) 接入生化反应器处理制药厂高盐废水；
33.步骤1包括：取出
‑
80℃保藏的菌株甘油冻存管，以0.90
‑
1.2％接种浓度(体积百分比浓度)接入基础培养基中，29
‑
31℃(优选为30℃)， 200
‑
230r/min(优选为220r/min)摇床培养过夜，得到培养液；然后以4
‑
8％ (优选为5％)接种浓度(体积百分比浓度)，转接到全培养基中，于29
‑
31℃ (优选为30℃)、170
‑
190r/min(优选为180r/min)摇床培养20
‑
26h(优选为24h)；
34.所述基础培养基含有：牛肉膏2.8
‑
3.5g/l、蛋白胨8
‑
12g/l、氯化钠 20
‑
40g/l、ph 7.0
‑
8.0，经灭菌后制得。
35.所述全培养基含有：蛋白胨14
‑
16g/l(优选为15g/l)、酵母粉 6.5
‑
8.5g/l(优选为7.5g/l)、十二水磷酸氢二钠16.5
‑
18.5g/l(优选为 17.9g/l)、磷酸二氢钾6
‑
7.5g/l(优选为6.8g/l)、硫酸铵3.5
‑
4.5g/l(优选为4.0g/l)、无水硫酸镁0.80
‑
0.92g/l(优选为0.87g/l)、葡萄糖4
‑
6g/l (优选为5g/l)、甘油10
‑
15g/l(优选为12g/l)、氯化钠20
‑
40g/l(优选为30g/l)，ph7.0
‑
8.0，经灭菌后制得。
36.优选地，所述高浓度氯化钠废水的氯化钠浓度为0
‑
200g/l，cod范围为2000
‑
15000mg/l。经实验证实，菌株对高盐废水cod的去除率最高达95.02％。
37.(三)有益效果
38.本发明的主要技术效果是：
39.通过对制药厂废水处理二沉池中的活性污泥在mbbr装置中培养、高浓度氯化钠驯化，平板划线纯化，获得一株高耐盐的寡养单胞菌 (stenotrophomonas pavanii)，该菌株可以耐受含氯化钠浓度高达200g/l 及2000
‑
15000mg/l cod的废水，且对废水中的cod去除率最高可达 95.02％，因此该菌株可以接种到制药厂的废水生化反应器中，对制药废水进行高效降解。
40.经实验证实，该菌株在高浓度的氯化钠(氯化钠最大浓度200g/l) 环境中有较强的生长能力和高效的降解废水有机污染物(进水cod最高可达15650mg/l)的能力，具有广谱耐盐性。菌株延迟期短(0
‑
2.5h)，对数生长期与稳定期长(2.5
‑
72h)，有利于消耗各种有机物污染物，将菌株扩大培养后应用于生化反应器，cod去除率可达95.02％，出水达到国家标准对制药工业水污染物排放浓度的要求。本发明为制药厂高氯离子、高cod废水的降解，提
供了高效的菌源，拓宽了寡养单胞菌的功能应用，具有较强的实用价值。
附图说明
41.图1是本发明筛选的菌株在不同氯化钠浓度下的生长情况。
42.图2是本发明筛选的菌株的生长曲线。
43.图3是本发明筛选的菌株的菌落形态图。
44.图4是本发明筛选的菌株的菌体形态图。
45.图5是本发明筛选的菌株的系统发育树。
46.图6是本发明筛选的菌株对不同cod浓度的制药废水的降解曲线。
47.图7是本发明筛选的菌株在更高氯化钠浓度下对不同cod浓度制药废水的降解曲线。
具体实施方式
48.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
49.实施例1
50.本实施例为菌株驯化和筛选，其方法如下：
51.第一步：耐盐菌的定向驯化
52.从石家庄某制药厂废水处理二沉池中，取得活性污泥，在mbbr装置中培养。采用逐步提高氯化钠浓度的办法，定向驯化耐盐菌群。
53.(1)从石家庄某制药厂废水处理的二沉池中，取得活性污泥。在260l 的mbbr装置的好氧池中，投加制药厂回收杂盐(主要成分为氯化钠) 1000g、葡萄糖260g、硫酸铵65g、磷酸氢二钠13g、硫酸钾11.5g、折干污泥(活性污泥)2kg，补加自来水至液位线。初始氯化钠浓度为4224mg/l，曝气好养运行。
54.(2)运行一周后，cod降低85％。开始连续运行，24h进水50l。每隔24h检测一次，根据检测结果补加营养物质，逐步提高氯化钠浓度。
55.(3)运行2个月后，氯化钠浓度达到了60000mg/l，cod去除率稳定在82.5％以上。填料挂膜情况良好，镜检可见菌胶团明显，得到定向驯化的耐盐菌群。
56.第二步：纯化单菌落
57.(1)从mbbr系统填料上取新鲜污泥混合物，用混匀器混合2分钟，自然沉降后，取上清液做实验菌液。
58.(2)取实验菌液1.0ml进行梯度稀释，稀释到实验菌液浓度的10
‑5为止。取不同稀释度(梯度稀释)的菌悬液，分别涂布于固体基础培养基上。将固体基础培养基倒置于恒温培养箱中，30℃培养，直至有明显菌落产生，记录菌落形态。固体基础培养基组成为：牛肉膏3g/l、10g/l 的蛋白胨、氯化钠30g/l、琼脂20g/l、ph 7.0
‑
8.0，经灭菌后制得。
59.(3)在适宜梯度(单菌落分布较稀的平板易于挑取单菌落)的平板上挑取形态、大小、颜色不同的单菌落，多次划线培养，直至得到纯化的单菌落。记录菌落形态和细菌颜色结果并记录。
60.第三步：耐盐菌的筛选
61.分别配制氯化钠含量为0g/l、20g/l、40g/l、80g/l、140g/l、200g/l、 250g/l的选择性培养基。选择性培养基组成如下：葡萄糖0.2/l、硫酸铵 0.943g/l、磷酸二氢钾0.18g/l、硫酸镁0.1g/l、氯化钠0
‑
250g/l(分别为0g/l、20g/l、40g/l、80g/l、140g/l、200g/l、250g/l)，ph 7.0
‑
8.0，经灭菌后制得。
62.将纯化后单菌落，制成菌悬液，以2％的接种量，接入选择性培养基中。于30℃，200r/min，摇床培养72h，筛选出可耐受高盐且能降解废水 cod的菌株。处理效果见说明书附图1：该菌株在氯化钠浓度为 0
‑
250mg/l的选择性培养基中均能生长，在氯化钠浓度为20
‑
80mg/l时，菌株的生长情况最好，cod去除率最大。
63.制作生长曲线，如说明书附图2所示：菌株的延迟期为0
‑
2.5h；对数期为2.5
‑
16h；稳定期为16
‑
72h；72h后进入衰亡期。菌株的延迟期短，快速进入对数期，对数生长期与稳定期长，可以达到96h。生长迅速且稳定期很长的细菌，在生产中非常利于消耗各种有机物污染物。
64.第四步：耐盐菌的鉴定
65.将筛选出的可耐受高盐且能降解废水cod的菌株，接种到固体基础培养基上，倒置于恒温培养箱中，30℃培养24h得到单菌落。菌落呈白色、圆形、边缘规则，表面光滑、湿润，侧面观察为扁平状，菌落图片见说明书附图3。
66.革兰氏染色为阳性，在光学显微镜下观察菌体形态呈短棒状，两端较圆滑，无鞭毛，菌体图片见说明书附图4。
67.理化性质实验结果显示：甲基红实验为阳性，v
‑
p实验为阴性，兼性好氧菌。最适生长ph值为7.0
‑
8.0。
68.进一步提取所筛选菌株的基因组dna。使用16s rdna通用引物进行pcr扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认pcr扩增片段。送样进行16s rdna序列测定。测定的序列与stenotrophomonas pavanii的同源性最高，相似度达到99％以上，但本菌株的形态学特征和理化性质与已经报道的stenotrophomonas pavanii存在一定差异(邓阳等对寡养单胞菌属细菌的研究进展中，说明寡养单胞菌属特征为革兰氏染色阴性杆菌，有鞭毛。)，故鉴定为stenotrophomonas pavanii属种的新菌株，命名为 stenotrophomonas pavanii m02，并已于2021年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.22898。将stenotrophomonas pavanii m02和其他几个相似度高的同源菌，用mega7.0软件构建系统发育树见说明书附图5。查阅有关资料，尚无有关寡养单胞菌属在高浓度氯化钠废水中降解高浓度cod能力的文章和报道。将stenotrophomonas pavanii m02制作成甘油冻存管，于
‑
80℃下保藏。
69.实施例2
70.本实施例为stenotrophomonas pavanii m02的放大培养方法，培养方法如下：
71.步骤1：将
‑
80℃保藏的菌株甘油冻存管取出，以1％接种浓度(体积百分比浓度)接入基础培养基中，30℃，220r/min摇床培养过夜。
72.所述基础培养基组分为：牛肉膏2.8
‑
3.5g/l、蛋白胨8
‑
12g/l、氯化钠20
‑
40g/l、ph 7.0
‑
8.0，经灭菌后制得。
73.步骤2：接着以5％接种浓度(体积百分比浓度)，转接到全培养基中。30℃，180r/min摇床培养24h，得到放大培养的菌液。
74.所述的全培养基组分为：蛋白胨15g/l、酵母粉7.5g/l、十二水磷酸氢二钠17.9g/l、磷酸二氢钾6.8g/l、硫酸铵4.0g/l、无水硫酸镁0.87g/l、葡萄糖5g/l、甘油12g/l、氯化钠20
‑
40g/l，ph7.0
‑
8.0，经灭菌后制得。
75.实施例3
76.本实施例为stenotrophomonas pavanii m02的高耐盐特性及其应用实验。
77.(1)取石家庄某抗生素生产厂高盐废水检测，其结果如下：
78.废水进水cod为15650mg/l，bod5(5日生化需氧量)为7360mg/l， ph为7.21，氯离子含量为34260mg/l，nh3‑
n(氨氮)为507mg/l，tn (总氮)为1120mg/l，ss为137mg/l。
79.此外，废水中还检测到苯、醛、酯、酮、酚、醚类物质。
80.(2)将废水梯度稀释至四个cod浓度，分别为：2360mg/l、 4020mg/l、8236mg/l、12027mg/l。
81.(3)将5个浓度废水加入对应的生化反应器中，调节ph值至7
‑
8，开启曝气泵，调节空气流量，控制溶氧至3
‑
5mg/l。
82.(4)将实施例2中放大培养的菌液以2％接种浓度(体积百分比浓度)，接入生化反应器中，用于处理制药厂高盐废水，24h测定一次cod，连续检测4天。
83.结果如说明书附图6所示：菌株在废水初始cod为4020mg/l和 8236mg/l的环境下去除效果最好，第96h时cod去除率分别为94.78％和95.02％。
84.实施例4
85.本实施例为测试stenotrophomonas pavanii m02在更高氯化钠浓度下的cod降解特性。
86.(1)取石家庄某抗生素生产厂高盐废水检测，其结果如下：
87.废水进水cod为15650mg/l，bod5(5日生化需氧量)为7360mg/l， ph为7.21，氯离子含量为34260mg/l，nh3‑
n(氨氮)为507mg/l，tn (总氮)为1120mg/l，ss为137mg/l。向该废水中再加入氯化钠，使氯化钠浓度达到200g/l。
88.(2)将废水梯度稀释至四个cod浓度，分别为：2131mg/l、 4034mg/l、8103mg/l、12072mg/l。
89.(3)将5个浓度高盐废水加入对应的生化反应器中，调节ph值至 7
‑
8，开启曝气泵，调节空气流量，控制溶氧至3
‑
5mg/l。
90.(4)将实施例2中放大培养的菌液以2％体积百分比的接种浓度接入生化反应器中，用于处理高盐废水，24h测定一次cod，连续检测8 天。
91.结果如说明书附图7所示：在氯化钠浓度为200g/l的情况下，cod 最大去除率为43.40％(cod＝8103mg/l)。由此可见，本发明筛选的 stenotrophomonas pavanii m02可以在高浓度的氯化钠(氯化钠最大浓度 200g/l)环境中有较强的生长能力和高效的降解废水有机污染物(进水 cod最高可达15650mg/l)的能力，具有广谱耐盐性。
92.此外，本发明筛选的stenotrophomonas pavanii m02菌株延迟期短，对数生长期与稳定期长，这些特点有利于消耗各种有机物污染物，将菌株扩大培养后应用于生化反应器，可大幅提高废水中cod的去除率。利用本发明筛选的stenotrophomonas pavanii m02降解制药厂废水，出水达到国家标准对制药工业水污染物排放浓度的要求。本发明为制药厂高氯离子、高cod废水的降解，提供了优质、高效的菌源，拓宽了寡养单胞菌的功能应用，具
有较强的实用价值。
93.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。