人CLDN10-AS1lncRNA在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒的制作方法

人cldn10
‑
as1 lncrna在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及人cldn10
‑
as1 lncrna在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.肺癌在我国的发病率不断增加，且在癌症相关死亡病因中排名第一位。肺癌按病理类型可以分为两大类，即小细胞肺癌与非小细胞肺癌，非小细胞肺癌约占所有肺癌病例的85％，包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌，其中肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的病理类型，约占原发肺癌的40％。在人类恶性肿瘤中，肺癌预后相对较差，其5年生存率不足20％。目前，关于肺腺癌侵袭转移机制尚未充分阐明，进一步探究肺腺癌恶性生物学行为发生机制，并给予适当的干预措施，对于提高肺腺癌的临床诊治水平以及改善患者预后都具有十分重要的现实意义，其中，明确新的与肺腺癌患者术后生存期相关的分子标志物并应用于肺腺癌预后评估是目前急需解决的问题。
3.人类基因组由30亿对碱基构成，可以产生大约18万个转录产物，其中约2万个转录本能够编码蛋白，剩余约16万个转录本不能产生蛋白产物，被称为非编码rna(non
‑
coding rna,ncrna),其中大多数ncrna的长度超过200个碱基，称为长链非编码rna(long non
‑
coding rna,lncrna)。近年来，随着测序技术的发展和普及，越来越多的lncrna被检测出来，并被证实参与了各种各样的生理进程，例如肌细胞分化、神经细胞分化、突触形成、多能干细胞的重新编辑、炎症调节以及癌症的发生、发展等。在目前已知与肺癌相关的lncrna中，有些lncrna被证实具有癌症驱动作用，例如linc00673、anril、agap2
‑
as1、hottip、snhg1；另一些lncrna则发挥着抑癌基因的作用，例如gas6
‑
as1、meg3、linc00961、spry4
‑
it1等。这些lncrna通过调控肿瘤增殖、侵袭、凋亡与耐药，在肿瘤发生、发展进程中发挥着重要作用。现阶段关于lncrna在肺腺癌中的功能与机制研究仍远远不够，进一步发现新的肺腺癌相关的lncrna，并且阐明其在肺腺癌中的功能以及预后意义，对于促进个体化临床诊疗策略的发展具有重要意义。
4.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)是一种利用碱基互补配对原则，在dna聚合酶作用下，体外特异性扩增目的dna片段的技术。荧光定量pcr是通过镶嵌在dna双链中的荧光信号，对pcr过程进行实时检测，在指数扩增期，模板中目的cdna的拷贝数与ct值存在线性关系，据此可以进行目的rna的定量分析。特异性识别目的片段的上、下游引物序列对于目的rna准确的定量分析至关重要。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了人cldn10
‑
as1 lncrna在评估肺腺癌患者预后中的应用及检测试剂盒。
6.本发明的技术方案如下：
7.人cldn10
‑
as1 lncrna在制备肺腺癌预后评估产品中的应用。
8.根据本发明优选的，所述应用中cldn10
‑
as1 lncrna为肺腺癌预后评估的生物标志物。
9.根据本发明优选的，所述cldn10
‑
as1 lncrna的核苷酸序列如seq no.5所示。
10.根据本发明优选的，所述产品用于评估和预测肺腺癌患者总生存期。
11.根据本发明优选的，所述肺腺癌预后评估产品包括特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的物质。
12.进一步优选的，所述特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的物质选自特异性扩增cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物对。
13.进一步优选的，所述特异性扩增cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物对为seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物；或seq id no.3所示的上游引物和seq id no.4所示的下游引物。
14.根据本发明优选的，所述肺腺癌预后评估产品的检测样本选自细胞或组织。
15.特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的物质在肺腺癌预后评估产品中的应用。
16.根据本发明优选的，所述特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的物质选自特异性扩增cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物对。
17.进一步优选的，所述特异性扩增cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物对为seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物；或seq id no.3所示的上游引物和seq id no.4所示的下游引物。
18.一种肺腺癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的物质。
19.根据本发明优选的，所述特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的物质选自特异性扩增cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物对。
20.进一步优选的，所述特异性扩增cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物对为seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物；或seq id no.3所示的上游引物和seq id no.4所示的下游引物。
21.根据本发明优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量pcr的检测试剂。
22.有益效果：
23.1、本发明首次证实了cldn10
‑
as1 lncrna表达上调能够促进肺腺癌细胞的增殖与迁移，并且上调的cldn10
‑
as1 lncrna表达水平与肺腺癌患者总生存期的缩短显著相关。因此本发明以cldn10
‑
as1 lncrna为肺腺癌的生物标志物，提出了cldn10
‑
as1 lncrna在肺腺癌中的用途，尤其是在制备肺腺癌预后评估产品中的应用。
24.2、本发明设计了特异性扩增cldn10
‑
as1 lncrna的引物对，可特异性有效检测cldn10
‑
as1 lncrna表达水平。
附图说明
25.图1是本发明通过rna测序技术检测7对肺腺癌组织以及临近正常肺组织中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平，以临近正常肺组织中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平为标准，
计算癌组织中cldn10
‑
as1 lncrna相对表达水平，应用student’s t检验分析组间差异的统计学意义的示意图。
26.图2是本发明试剂盒检测10对肺腺癌组织与临近正常肺组织中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平，按照2
‑△△
ct
计算癌组织中cldn10
‑
as1 lncrna相对表达水平，应用student’s t检验分析组间差异的统计学意义的示意图。
27.图3是本发明试剂盒检测肺腺癌细胞系(a549、h1299、h1975)与正常支气管上皮细胞(beas
‑
2b)中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平，按照2
‑△△
ct
计算肺腺癌细胞系cldn10
‑
as1 lncrna相对表达水平，应用student’s t检验分析组间差异的统计学意义的示意图。
28.图4是应用cck
‑
8实验和transwell实验检测cldn10
‑
as1 lncrna稳定敲低对a549细胞增殖与迁移的影响，应用student’s t检验分析组间差异的统计学意义的折线图(左)和柱状图(右)。
29.图5是应用cck
‑
8实验和transwell实验检测外源性cldn10
‑
as1 lncrna表达对beas
‑
2b细胞增殖与迁移的影响，应用student’s t检验分析组间差异的统计学意义的折线图(左)和柱状图(右)。
30.图6是使用kaplan
‑
meier plotter数据库分析cldn10
‑
as1 lncrna表达水平对肺腺癌患者预后的影响，应用kaplan
‑
meier法比较cldn10
‑
as1 lncrna高表达与低表达肺腺癌患者之间的预后差异，应用log
‑
rank检验组间差异是否具有的统计学意义的示意图。
具体实施方式
31.下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。
32.实施例内容是经过山东大学第二医院医学伦理委员会批准，所有病例都得到了患者的知情同意。
33.正常人支气管上皮细胞系beas
‑
2b以及人源肺腺癌细胞系a549、h1299、h1975均购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
34.实施例1
35.本发明利用rna
‑
seq(ribo
‑
free)对肺腺癌组织以及临近正常肺组织标本(各7例)中lncrna表达谱进行检测，通过生物信息学分析发现，其中表达上调的lncrna(log2 fold change>2，p value<0.05)共有275个，表达下调的lncrna(log2 fold change<
‑
2，p value<0.05)共有90个。其中，cldn10
‑
as1 lncrna是肺腺癌组织中上调倍数最高的一种lncrna。与临近正常肺组织相比，癌组织中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平显著上调，具体分析结果如图1所示。
36.具体实施过程如下：
37.(1)收集组织样本：收集7对手术切除的肺腺癌标本，肿瘤组织均取自中心非坏死部位，邻近正常组织取自距离肿瘤边缘大于5cm的区域，液氮速冻，
‑
80℃保存。7例患者术前均未接受放化疗，术后病理结果证实为肺腺癌。上述病例收集经过山东大学第二医院医学伦理委员会批准，并且得到患者知情同意；
38.(2)lncrna测序：使用trizol试剂将上述液氮冻存组织裂解，应用苯酚
‑
氯仿
‑
异丙醇法提取rna，应用琼脂糖凝胶电泳评估所提rna的完整性，使用nanodrop2000检测所提rna
的浓度与纯度，选取rin>7的rna样品进行建库，由北京诺禾致源生物信息科技有限公司应用rna
‑
seq(ribo
‑
free)技术进行测序；
39.(3)生物信息学分析：分析测序所得原始数据，依次进行质量评估，剔除低质量序列，与参考基因组进行比对，筛选lncrna，进行差异表达分析，按照(log
2 fold change>2，p value<0.05)或者(log
2 fold change<
‑
2，p value<0.05)标准筛选差异表达lncrna。结果显示，肺腺癌组织中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平，相比于临近正常肺组织显著升高。
40.实施例2
41.收集10对手术切除的肺腺癌组织与临近正常组织标本，提取总rna，应用本发明中特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物序列进行实时荧光定量pcr检测上述样本中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平，结果显示，肺腺癌组织中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平，相比于临近正常组织显著升高，具体分析结果如图2所示。
42.具体实施过程如下：
43.(1)收集组织样本：收集10对手术切除的肺腺癌标本，肿瘤组织均取自中心非坏死部位，邻近正常肺组织取自距离肿瘤边缘大于5cm的区域，液氮速冻，
‑
80℃保存。15例患者术后病理结果证实为肺腺癌，且术前均未接受放化疗。上述病例收集经过山东大学第二医院医学伦理委员会批准，并且得到患者知情同意。
44.(2)提取组织总rna：使用rna
‑
quick purification kit(上海奕杉，rn001)从肺腺癌组织及临近正常肺组织中提取总rna，提取方法严格按照说明书内所述步骤进行，通过琼脂糖凝胶电泳检测所提rna的完整性，使用nanodrop2000检测rna的浓度和纯度。
45.(3)rt
‑
qpcr：使用lnrcute lncrna cdna第一链合成试剂盒(tiangen，kr202)先去除基因组dna，再逆转录合成cdna，具体按照说明书步骤进行，使用lnrcute lncrna荧光定量检测试剂盒(sybr green)(tiangen，fp402)以及本发明中如seq no.1和seq no.2、seq no.3和seq no.4所示的特异性引物分别进行荧光定量pcr，以gapdh为内参，使用2
‑
δδct
方法计算lncrna
‑
cldn10
‑
as1相对表达水平，结果显示，相比于临近正常肺组织，肺腺癌组织中lncrna
‑
cldn10
‑
as1表达水平显著升高。
46.其中，引物对的核苷酸序列如下：
47.上游引物#1：5
’‑
ctgagcatgtgggtccttat
‑3’
(seq id no.1)
48.下游引物#1：5
’‑
ctatacagggcaatacgggg
‑3’
(seq id no.2)
49.上游引物#2：5
’‑
gagcatgtgggtccttatc
‑3’
(seq id no.3)
50.下游引物#2：5
’‑
cagctagaggaagcaaagaa
‑3’
(seq id no.4)
51.基因组dna去除体系：rna(250ng/μl)2μl，5
×
gdna buffer 2μl，rnase
‑
free ddh2o6μl；反应条件：42℃孵育3分钟，置于冰上备用。
52.逆转录pcr体系：10
×
lnr rt buffer 2μl，lnr rt enzyme mix 1μl，lnr
‑
rt primer mix2μl，rnase
‑
free ddh2o 5μl，基因组dna去除体系产物10μl；反应条件：42℃孵育15分钟，95℃孵育3分钟，4℃保存备用。
53.实时荧光定量pcr体系(10μl)：逆转录体系产物1μl,2x lnr lncrna premix 5μl，引物稀释液(1μm)3.8μl,50x rox reference dye 0.2μl。反应条件：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸20秒，共40循环；95℃变性15秒，60℃孵育1分钟，95℃变性15秒。
lncrna cdna第一链合成试剂盒(tiangen，kr202)进行逆转录合成cdna，使用lnrcute lncrna荧光定量检测试剂盒(tiangen，fp402)以及本发明中如seq no.1和seq no.2、seq no.3和seq no.4所示特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物序列进行荧光定量pcr，以gapdh为内参，使用2
‑
δδct
方法计算cldn10
‑
as1 lncrna相对表达水平；
68.(3)cck
‑
8实验：使用胰蛋白酶消化a549
‑
sh
‑
cldn10
‑
as1与a549
‑
vector细胞，收集细胞并制备细胞悬液，调整细胞浓度至20,000个/ml培养基,将上述细胞悬液加入96孔板中(100μl/孔)，6个复孔，在指定时间向每孔加入10μl cck
‑
8试剂(targetmol，c0005)，在37℃孵箱放置1小时，使用酶标仪测量450nm的吸光度值。
69.(4)transwell实验：使用胰蛋白酶消化上述细胞，收集细胞并离心，使用无血清dmem培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至100,000个/ml培养基，将transwell小室(corning，3422)放入24孔板中(含600μl完全培养基/孔)，吸取200μl上述细胞悬液加入到小室内，置于37℃孵箱培养48小时，使用4％多聚甲醛室温下固定细胞15分钟，甲醇处理细胞25分钟，使用0.1％的结晶紫染色30分钟，用棉签刮掉小室内面未穿孔的细胞，显微镜下观察穿孔细胞并记录细胞数量。
70.实施例5
71.构建外源性cldn10
‑
as1 lncrna稳定表达的beas
‑
2b细胞株，应用cck
‑
8实验和transwell实验检测外源性cldn10
‑
as1 lncrna表达对beas
‑
2b细胞增殖与迁移的影响，结果显示，外源性cldn10
‑
as1 lncrna表达显著增强了beas
‑
2b细胞的增殖与迁移，具体分析结果如图5所示。
72.具体实施过程如下：
73.(1)构建外源性cldn10
‑
as1 lncrna稳定表达的beas
‑
2b细胞株：cldn10
‑
as1 lncrna质粒及空载体质粒由北京擎科生物科技公司合成。使用lipo293转染试剂(beyotime，c0521)将pmd2g、pspax2以及cldn10
‑
as1 lncrna质粒或者空载体质粒转染到293t细胞中，48小时后收集培养基，使用0.45μm滤膜进行过滤，向滤液中加入5
×
peg8000溶液，4℃放置过夜后离心，保留沉淀，使用无血清dmem培养基重悬慢病毒。用所得慢病毒感染beas
‑
2b细胞，并用含嘌呤霉素(1μg/ml)的完全培养基筛选耐药细胞，即可获得外源性cldn10
‑
as1 lncrna稳定表达的beas
‑
2b细胞株(beas
‑
2b
‑
cldn10
‑
as1)与稳定表达空载体细胞株(beas
‑
2b
‑
vector)。
74.(2)验证beas
‑
2b
‑
cldn10
‑
as1与beas
‑
2b
‑
vector细胞中cldn10
‑
as1 lncrna表达水平：使用rna
‑
quick purification kit(上海奕杉，rn001)提取上述细胞总rna，使用lnrcute lncrna cdna第一链合成试剂盒(tiangen，kr202)进行逆转录，使用lnrcute lncrna荧光定量检测试剂盒(tiangen，fp402)以及本发明中如seq no.1和seq no.2、seq no.3和seq no.4所示特异性识别cldn10
‑
as1 lncrna逆转录产物cdna的引物序列进行荧光定量pcr，以gapdh为内参，使用2
‑
δδct
方法计算cldn10
‑
as1 lncrna相对表达水平。
75.(3)cck
‑
8实验：使用胰蛋白酶消化beas
‑
2b
‑
cldn10
‑
as1细胞和beas
‑
2b
‑
vector细胞，收集细胞并制备细胞悬液，调整细胞浓度至15000个/ml培养基，将上述细胞悬液加入96孔板中(100μl/孔)，6个复孔，在指定时间向每孔加入10μl cck
‑
8试剂(targetmol，c0005)，37℃孵育1小时，使用酶标仪测量450nm的吸光度值。
76.(4)transwell实验：使用胰蛋白酶消化并收集上述细胞，使用无血清dmem培养基
制备细胞悬液，调整细胞浓度至100000个/ml培养基，将transwell小室(corning，3422)放入24孔板中(含600μl完全培养基/孔)，吸取200μl上述细胞悬液加入到小室内，置于37℃孵育箱培养48小时，室温下4％多聚甲醛固定细胞15分钟，甲醇处理细胞25分钟，使用0.1％的结晶紫染色30分钟，用棉签刮掉小室内面未穿孔的细胞，显微镜下观察穿膜细胞并记录细胞数量。
77.实施例6
78.应用kaplan
‑
meier plotter数据库分析cldn10
‑
as1 lncrna高表达与低表达肺腺癌患者之间的预后差异，结果显示，与cldn10
‑
as1 lncrna低表达的肺腺癌患者预后相比，高表达cldn10
‑
as1 lncrna的肺腺癌患者的总生存期显著缩短，具体分析结果如图6所示。
79.具体实施过程如下：
80.从kaplan
‑
meier plotter网站中下载肺腺癌患者预后信息以及cldn10
‑
as1相对表达水平，应用kaplan
‑
meier法分析cldn10
‑
as1 lncrna高表达与低表达患者的总生存期(overall survival)差异,共672例肺腺癌患者，其中cldn10
‑
as1 lncrna高表达332例，中位生存期95.07个月；cldn10
‑
as1 lncrna低表达340例，中位生存期110.27个月，应用log
‑
rank检验分析组间生存差异的统计学意义。
81.以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。