一种泛酸合成酶突变体、编码基因、载体及应用的制作方法

一种泛酸合成酶突变体、编码基因、载体及应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种泛酸合成酶突变体、编码基因、载体及应用，属于酶工程技术领域。
(二)

背景技术：

2.d
‑
泛酸(d
‑
pantothenic acid)又称维生素b5，是水溶性维生素b族的一种，是coa和酰基载体蛋白acp的重要前提，而根据kegg数据库查阅，coa参与的酶促反应达400多种，涉及脂肪酸代谢，细胞信号传递，三羧酸循环等中心代谢反应。天然泛酸具有右旋光性，即d
‑
泛酸，是一种重要的食品添加剂和饲料添加剂，也是一种重要的维生素药物。临床上用于治疗维生素b缺乏症、周围神经炎、手术后肠梗阻、链霉素中毒及类风湿等疾病。
3.泛酸的商品形式主要为d
‑
泛酸钙。自20世纪40年代起，世界上已开始研究泛酸钙的合成，60年代开始进行工业化生产。目前，世界年产量约20000吨，主要生产公司有浙江鑫富药业，新发药业，山东华辰，帝斯曼以及巴斯夫等，其中浙江鑫富生化股份有限公司d
‑
泛酸钙年产量达7500吨，全球市场占有率达38.86％以上。中国在d
‑
泛酸钙的生产能力占世界总生产能力的60％，其中用于饲料行业产品占据了94％，而对于医药级和食品级的d
‑
泛酸钙仍然不能满足内需。
4.泛酸的合成有化学法和生物法。化学法主要采用stiller法，将异丁醛，氰化钠或者乙醛酸
‑
异丁醛合成dl
‑
泛解酸内脂，再将β
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丙氨酸钙与dl
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泛解酸内酯直接缩合获得dl
‑
泛酸钙，然后拆分获得d
‑
泛酸钙。由于化学法存在底物毒性以及拆分中生产成本高，生产量小，产品光学纯度差等问题，研究者仍然在寻找能产生泛酸生物合成过程中有用的酶或微生物系统。生物法合成泛酸主要是在生物体内，由α
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酮异戊酸通过泛解酸羟甲基转移酶，通泛解酸还原酶，l
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天冬氨酸
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α
‑
脱羧酶，泛酸合成酶(panc)的作用下生成泛酸。泛酸合成酶是泛酸合成的最后一步，是泛酸合成的关键酶之一，是将β
‑
丙氨酸和泛解酸在atp的参与下形成泛酸。1994年，hikichi yuichi等人开发了从葡萄糖生物合成d
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泛解酸的大肠杆菌重组表达系统，表达大肠杆菌fv525泛酸合成酶的方法，仅添加β
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丙氨酸，培养72h，直接发酵葡萄糖产生d
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泛酸达65.4g/l。2005年，巴斯夫的专利cn02803857.6报道的用枯草芽孢杆菌表达系统通过表达来源于枯草芽孢杆菌的panbcd，pane1，pane2，ilvd，ilvbnc，glya等基因生产泛酸，发酵48h产量达86g/l。以上均为大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌表达自身过着同种的泛酸合成酶，而对于异源表达的泛酸合成酶报道的较少，发酵时间较长。而目前的泛酸合成酶的研究报道主要集中在发展一下mycobacterium tuberculosis泛酸合成酶结构，机理以及一下小分子抑制剂等，而对于其他来源的泛酸合成酶的报道却非常少。1978年，kazutaka miyatake等报道的来源于e.coli b的泛酸合成酶酶活2.05μmol/min/mg，1999年，hermann sahm报道的来源于谷氨酸棒状杆菌的酶活12nmol/min/mg蛋白，2008年，silvia ronconi等报道的来源于methanosarcina mazei的泛酸合成酶的酶活为0.14μmol/min/mg，报道的酶活都较低。
(三)

技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明通过pcr定点定向突变得到催化活性提高的泛酸合成酶突变体，为其进一步的工业化应用奠定基础。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一种泛酸合成酶突变体，由氨基酸序列如seq id no.1所示的泛酸合成酶(编码基因seq id no.5)的第5位和/或第176位氨基酸经定点突变获得。
8.具体的，所述定点突变为第5位苏氨酸突变为谷氨酸，突变体氨基酸序列如seq id no.2所示(编码基因seq id no.6)。
9.或者，所述定点突变为第176位异亮氨酸突变为缬氨酸，突变体氨基酸序列如seq id no.3所示(编码基因seq id no.7)。
10.又或者，所述定点突变为第5位苏氨酸突变为谷氨酸、同时第176位异亮氨酸突变为缬氨酸，突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示(编码基因seq id no.8)。
11.本发明还涉及编码所述的泛酸合成酶突变体的基因，以及含有所述的编码基因的表达质粒。优选的，所述的表达质粒以pet
‑
28a( )为载体。
12.本发明还涉及表达所述的突变体的重组菌。所述的重组菌是以细菌、真菌或动植物细胞为宿主。
13.本发明还涉及所述的泛酸合成酶突变体在生物催化泛解酸制备泛酸中的应用。
14.本发明的有益效果主要体现在：本发明通过多序列比对选点并进行定点定向突变改变蛋白质氨基酸残基，提高泛酸合成酶催化效率，进一步提高了泛酸合成酶产量。本发明构建的泛酸合成酶的重组大肠杆菌可将泛酸合成酶酶活较出发菌株提高1.25倍。改造后的基因工程菌产酶能力明显提高，摇瓶发酵生产泛酸合成酶酶活达到144.266u/ml，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
(四)附图说明
15.图1为突变后泛酸合成酶核酸凝胶电泳图：m1：dl2000marker；1
‑
2：panc片段的扩增产物；m2:250kb marker；3
‑
5:重组质粒pet
‑
28a( )
‑
panc的pcr扩增产物；
16.图2为突变菌株中泛酸合成酶蛋白凝胶电泳图：m：marker；1:原始菌株e.coli bl21
‑
pet
‑
28a( )
‑
panc蛋白凝胶电泳泳道；2：突变菌株e.coli bl21
‑
pet
‑
28a( )
‑
panct5e；3：e.coli bl21
‑
pet
‑
28a( )
‑
panci176v；
17.图3为对第5位突变时泛酸合成酶酶活；
18.图4为对176位突变时泛酸合成酶酶活；
19.图5为组合突变前后泛酸合成酶酶活。
(五)具体实施方式
20.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
21.培养基：
22.lb液体培养基：蛋白胨10.0g/l，酵母粉5.0g/l，nacl 5.0g/l。
23.泛酸合成酶酶活力的测定：
24.酶活测定反应体系：25mm泛解酸、25mmβ
‑
丙氨酸、4.5mm atp、10mm氯化镁、15mm氯化钾，将ph调至8.0。
25.取20μl酶液加入1.1ml的反应体系中，混匀后于37℃下反应10min，然后向体系中加入10μl 6m盐酸，离心10min，吸取200μl加入液相瓶的内衬管中，进行高效液相检测。对照组采用去离子水代替粗酶液。1酶活活力单位(u)定义：上述条件下，1ml的酶液每分钟产1μg泛酸所需的酶量。配制不同浓度的泛酸溶液，并用液相进行检测峰面积，根据标准曲线计算酶活。
26.比酶活(u/mg)＝酶活/蛋白质量
27.表1：引物序列
[0028][0029]
实施例1：泛酸合成酶表达工程菌的构建
[0030]
将购于american type culture collection(atcc)网站的谷氨酸棒杆菌atcc 13032接种于5ml lb试管，37℃振荡培养12h，12000rpm离心获得菌体，先用试剂盒(fastdna试剂盒)提取谷氨酸棒状杆菌的基因组，从中克隆出所需的目的基因—panc，pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳验证后，观察到条带位置约为850bp左右(图1a)，与目的条带位置相符。一步克隆将其与表达载体pet
‑
28a( )连接，转化至大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞中，菌落pcr验证。将菌落pcr产物送去测序，测序结果与panc的碱基序列进行对比，结果正确提取重组质粒，将质粒转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，转化得到的单菌落即为所需工程菌e.coli bl21
‑
pet
‑
28a( )
‑
panc，将成功构建的工程菌进行低温甘油管保藏。
[0031]
实施例2：泛酸合成酶单点突变对泛酸合成酶酶活表达的影响
[0032]
设计引物t5e
‑
f、t5e
‑
r(如表1所示)，以已经构建的pet
‑
28a( )
‑
panc为模板，进行pcr，突变第5位苏氨酸替换为谷氨酸，pcr反应条件为95℃5min，30个循环(95℃30s、55℃30s、72℃4min)，72℃10min。pcr扩增体系：模板1μl，上下游引物各1μl，buffer 25μl，dntp 1μl，酶1μl，ddh2o 20μl。跑胶验证条带大小，琼脂糖凝胶电泳结果如图1b所示，随后进行原模板消化。随后转化到bl21感受态，涂布kan板，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后获得定点突变的突变菌株。
[0033]
实施例1中将基因工程酶泛酸合成酶第5位苏氨酸点突变为谷氨酸时泛酸合成酶酶活稍有提升(如图3所示)，是出发菌株的1.16倍，命名为pet
‑
28a( )
‑
panc5e，再转入大肠杆菌bl21，以获得定点突变的突变菌株bl21
‑
pet
‑
28a( )
‑
panct5e，证明泛酸合成酶第5位进行点突变可以略微改变该酶的酶活。
[0034]
实施例3：泛酸合成酶单点突变对泛酸合成酶酶活表达的影响
[0035]
设计引物t5e
‑
f、t5e
‑
r和i176v
‑
f、i176v
‑
r(如表1所示)，以已经构建的pet
‑
28a
( )
‑
panc为模板，进行pcr，突变第5位苏氨酸替换为谷氨酸或者第176位异亮氨酸替换为缬氨酸，pcr反应条件为95℃5min，30个循环(95℃30s、55℃30s、72℃4min)，72℃10min。pcr扩增体系：模板1μl，上下游引物各1μl，buffer 25μl，dntp 1μl，酶1μl，ddh2o 20μl。跑胶验证条带大小后进行原模板消化。随后转化到bl21感受态，涂布kan板，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后获得定点突变的突变菌株。
[0036]
对突变菌株进行泛酸合成酶酶活力的测定，结果显示，将基因工程泛酸合成酶第176位异亮氨酸突变为缬氨酸时泛酸合成酶酶活也有些许提升(如图4所示)，为134.901u/mg，是出发菌株酶活的1.17倍，命名为pet
‑
28a( )
‑
panci176v，在转入大肠杆菌e.coli bl21(de3)，以获得定点突变菌株e.coli bl21
‑
pet
‑
28( )
‑
panci176v。证明对泛酸合成酶第176位进行定点突变可以改变该酶的酶活。
[0037]
实施例4：泛酸合成酶活性位点组合突变对泛酸合成酶酶活表达的影响
[0038]
利用定点突变试剂盒，设计引物t5e
‑
f、t5e
‑
r和i176v
‑
f、i176v
‑
r(如表1所示)，以已经构建的pet
‑
28a( )
‑
panc为模板，进行pcr，突变第5位苏氨酸替换为谷氨酸，并将第176位异亮氨酸替换为缬氨酸，pcr反应条件为95℃5min，30个循环(95℃30s、55℃30s、72℃4min)，72℃10min。pcr扩增体系：模板1μl，上下游引物各1μl，buffer 25μl，dntp 1μl，酶1μl，ddh2o 20μl。跑胶验证条带大小后进行原模板消化。随后转化到bl21感受态，涂布kan板，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后获得定点突变的突变菌株。
[0039]
对突变菌株进行泛酸合成酶酶活力的测定，结果显示，将基因工程泛酸合成酶第5位苏氨酸和第176位异亮氨酸定点突变为谷氨酸和赖氨酸时泛酸合成酶酶活有较大幅度提高(如图5所示)，为144.125u/ml，是出发菌株酶活的1.25倍，命名为pet
‑
28a( )
‑
panct5e
‑
i176v，再转入大肠杆菌e.coli bl21(de3)，以获得定点突变的突变菌株e.coli bl21
‑
pet
‑
28a( )
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panct5e
‑
i176v。证明组合突变这两个位点可以有效提高基因工程泛酸合成酶酶活。
[0040]
实施例5：泛酸合成酶生产菌株的摇瓶发酵
[0041]
挑选实施例3中转化子接种到装有lb液体培养基中，37℃，培养12h，转接到发酵培养基中，接种量为2％，培养2h，待od
600
达到0.6～0.8时，加iptg至终浓度为1mm，28℃培养16h，离心收集菌体，检测泛酸合成酶酶活，经计算，泛酸合成酶酶活可达到144.266u/ml发酵液。
[0042]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做的等同替换或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。