与IRGD共施用以治疗癌症的低剂量细胞因子的制作方法

与irgd共施用以治疗癌症的低剂量细胞因子
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年3月8日提交的美国临时专利申请号62/815,917的优先权，所述美国临时专利申请以引用方式整体并入本文。
发明领域
3.本发明涉及将irgd(内化的精氨酰甘氨酰天冬氨酸环肽；也称为cend
‑
1)与细胞因子共施用以治疗癌症。


背景技术：

4.相关领域
5.白介素
‑
2是一种于1976年首次被发现的天然存在的细胞因子。它主要由活化的t淋巴细胞(cd4 和cd8 t细胞)响应于刺激产生。il
‑
2和4α
‑
螺旋束细胞因子家族的其他成员共享相同的受体，包括il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
15、il
‑
21，在控制淋巴细胞的生死和适应性免疫应答的活化中起着关键作用。
6.阿地白介素是一种重组人il
‑
2，于1992年成为第一个获得fda批准的癌症免疫疗法。批准的适应症是转移性肾细胞癌和转移性黑素瘤。大剂量il
‑
2疗法大多用作没有其他疗法选项的患者的最后手段治疗。在高达10％的患者中的持久应答证明了il
‑
2的功效。毒性副作用，包括危及生命并且有时是致命的血管渗漏综合征(vascular leak syndrome,vls)，以及因其短半衰期而需要在八天内每天三次的给药方案，已经限制了阿地白介素的临床可用性。它只能提供给最健康的患者，并且只能在专业医疗中心的重症监护室中使用。
7.白介素
‑
2作用于免疫细胞上的细胞表面受体并刺激细胞因子级联，该细胞因子级联涉及各种类型的相关白介素(例如il
‑
1、il
‑
6、il
‑
15)、干扰素(ifn
‑
γ)和肿瘤坏死因子(tnfα和tnfβ)。il
‑
2作为免疫调节剂具有双重作用，因为其药理效应取决于靶组织处的暴露水平/局部浓度。不幸的是，无毒的低浓度刺激了调节性t(treg)细胞，即一种在癌症免疫疗法的背景下是非期望的效应。因此，测试用于癌症的低剂量il
‑
2疗法的尝试已经是令人失望的，据推测部分是由于treg细胞的扩增(waldmann,2015,cancer immunol res.3:219
–
227)。相比之下，il
‑
2的抗肿瘤活性被认为是由细胞毒性cd8 t细胞的活化引起的，这仅在高肿瘤内浓度的il
‑
2下发生。不幸的是，在肿瘤内达到和维持这些治疗上有益的il
‑
2水平所需的高全身剂量水平会导致严重的全身毒性。


技术实现要素：

8.本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其中该方法包括向有需要的患者施用irgd(cend
‑
1)；和低累积剂量的细胞因子。在特定实施方案中，癌症可以选自由以下组成的组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、唇癌和口腔癌、肝癌(例如，肾细胞癌)、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、非黑素瘤皮肤癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、小细胞肺癌、和甲状腺癌。在特定实施方案中，低累积剂量选自由以下
组成的组：比本领域已知的作为用于相应人类患者或动物模型的起始剂量的剂量的量低约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、120倍、140倍、160倍、180倍、190倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍和1,000倍。在其他实施方案中，细胞因子是阿地白介素或il
‑
2。
9.本文还提供了一种用于治疗、抑制或减小有需要的受试者或患者中的肿瘤体积的方法，其中该方法包括施用irgd(cend
‑
1)；和细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可选自由以下组成的组：il
‑
1样、il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
1ra、il
‑
18、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
13、il
‑
15、l
‑
3、il
‑
5、gm
‑
csf、il
‑
6样、il
‑
6、il
‑
11、g
‑
csf、il
‑
12、lif、osm、il
‑
10样、il
‑
10、il
‑
20、il
‑
14、il
‑
16、il
‑
17ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
γ、tnf、cd154、lt
‑
β、tnf
‑
α、tnf
‑
β、4
‑
1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall
‑
1、trail、tweak、trance、epo、tpo、flt
‑
3l、scf、m
‑
csf、msp。在另一个实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：il
‑
2、阿地白介素、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
13、il
‑
15。在又一个实施方案中，细胞因子选自il
‑
2或阿地白介素。
10.在一个特定实施方案中，将irgd和细胞因子共施用于受试者或患者。在另一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：(1)静脉内注射irgd；以及(2)施用静脉内il
‑
2。在一个特定实施方案中，将细胞因子以低累积剂量施用。
11.本文还提供了组合物，所述组合物包含irgd(cend
‑
1)；和细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：il
‑
1样、il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
1ra、il
‑
18、il
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2、il
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4、il
‑
7、il
‑
9、il
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13、il
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15、l
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3、il
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5、gm
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csf、il
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6、il
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12、lif、osm、il
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20、il
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14、il
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16、il
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β、ifn
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γ、tnf、cd154、lt
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β、tnf
‑
α、tnf
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‑
1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall
‑
1、trail、tweak、trance、epo、tpo、flt
‑
3l、scf、m
‑
csf、msp。在另一个实施方案中，细胞因子可选自由以下组成的组：il
‑
2、阿地白介素、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
13、il
‑
15。在一个特定实施方案中，细胞因子可选自il
‑
2或阿地白介素。在又一个实施方案中，irgd和细胞因子是重组融合蛋白或共价连接的化学缀合物的形式。
12.还提供了试剂盒，该试剂盒包含irgd(cend
‑
1)；和细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可选自由以下组成的组：il
‑
1样、il
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1α、il
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1β、il
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1ra、il
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18、il
‑
2、il
‑
4、il
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7、il
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9、il
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13、il
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15、l
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3、il
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5、gm
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6样、il
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6、il
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11、g
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csf、il
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10样、il
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10、il
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14、il
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16、il
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17ifn
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α、ifn
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β、ifn
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γ、tnf、cd154、lt
‑
β、tnf
‑
α、tnf
‑
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‑
1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall
‑
1、trail、tweak、trance、epo、tpo、flt
‑
3l、scf、m
‑
csf、msp。在另一个实施方案中，细胞因子可选自由以下组成的组：il
‑
2、阿地白介素、il
‑
4、il
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6、il
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7、il
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10、il
‑
12、il
‑
13、il
‑
15。在一个特定实施方案中，细胞因子选自il
‑
2或阿地白介素。
13.在阅读以下详细描述和附图之后，本发明的其他特征和优点对于本领域普通技术人员将变得更加显而易见。
附图说明
14.图1示出了肿瘤中的总t细胞(cd3)的百分比。
15.图2示出了肿瘤中的cd4 t细胞的百分比。
16.图3示出了treg占总t细胞的百分比。
17.图4示出了4t1肿瘤中的cd4 teff/treg比率。
18.图5示出了肿瘤中的cd4 t细胞的百分比。
19.图6示出了如表3所示的免疫细胞谱树。
具体实施方式
20.在阅读本说明书后，有关如何在各种替代实施方案和替代应用中实施本发明对于本领域技术人员将变得显而易见。然而，尽管本文将描述本发明的各种实施方案，但是应当理解，这些实施方案仅通过举例方式被展现，而不具限制性。由此，各种替代实施方案的这种详细描述不应被解释为限制如所附权利要求中阐述的本发明的范围或广度。
21.本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其中该方法包括向有需要的患者施用irgd(cend
‑
1)；和低累积剂量的细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可选自由以下组成的组：il
‑
1样、il
‑
1α、il
‑
1β、il
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1ra、il
‑
18、il
‑
2、il
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4、il
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7、il
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9、il
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13、il
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15、l
‑
3、il
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5、gm
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csf、il
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6样、il
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6、il
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11、g
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csf、il
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12、lif、osm、il
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10样、il
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10、il
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20、il
‑
14、il
‑
16、il
‑
17ifn
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α、ifn
‑
β、ifn
‑
γ、tnf、cd154、lt
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β、tnf
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α、tnf
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β、4
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1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall
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1、trail、tweak、trance、epo、tpo、flt
‑
3l、scf、m
‑
csf、msp。在另一个实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：il
‑
2、阿地白介素、il
‑
4、il
‑
6、il
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7、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
13、il
‑
15。在又一个实施方案中，细胞因子选自il
‑
2或阿地白介素。
22.根据本发明，已发现irgd与低累积剂量的细胞因子(例如，il
‑
2等)的组合治疗能够有利地改变il
‑
2的药理学，从而导致肿瘤免疫微环境的变化，使得免疫抑制性treg细胞减少，伴随着效应t细胞群增加。本文设想了使用irgd获得的肿瘤选择性白介素药理学益处，以为在实体瘤癌症患者中使用经过充分验证的il
‑
2和其他相关细胞因子提供新的选项，包括用于克服对pd
‑
1阻断的原发性耐药的策略。
23.不同类型的实体瘤和实体瘤癌症在本文中被设想通过本发明的方法进行治疗，并且通常以形成它们的细胞的类型命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。因此，用于通过本发明方法治疗的实体瘤癌症尤其包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、唇癌和口腔癌、肝癌(例如，肾细胞癌)、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、非黑素瘤皮肤癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、小细胞肺癌、甲状腺癌。
24.已经发现irgd分子模拟技术将通常难以进入的肿瘤微环境转变为药物导管，从而允许抗癌药剂有效进入肿瘤深处(ruoslahti,2017,adv drug deliv rev.110
‑
111:3
–
12)。根据本发明，共施用的抗癌药剂(例如，细胞因子，诸如il
‑
2等)变得更靶向肿瘤，具有更好的功效和/或减少的全身副作用。已发现irgd共施用对il
‑
2的效应实现了对剂量的足够减少以规避最严重的毒性。在一个实施方案中，已经出乎意料地发现，使用低且无毒剂量的il
‑
2可以实现肿瘤免疫谱的有利变化，没有irgd是药理学上无活性或免疫抑制的。特别值得注意的是低剂量il
‑
2的treg细胞促进活性逆转为抗treg活性。连同所获得的t效应细胞水平增加一起，il
‑
2/irgd组合将这种毒性细胞因子转化为活性且无毒的化合物。
25.在一个特定实施方案中，将irgd和细胞因子共施用于受试者或患者。如本文所用，“共施用”是指将irgd和相应细胞因子基本上同时施用，使得irgd起作用以活化
‘
cendr’转
作为以所耐受的600,000iu/kg或720,000iu/kg剂量每8小时一次的静脉内推注施用，其中在5天内至多连续14剂(1个疗法周期)。因此，对于1个疗法周期，5天累积剂量分别相当于8,400,000iu/kg或10,080,000iu/kg。与这些已知的高剂量癌症治疗方法一样，可以根据需要重复本发明低剂量方法的疗法周期，诸如在约9天的休息期后等。作为另一个实例，从表1指示的是用于治疗rcc和黑素瘤的il
‑
2的标准(“高剂量”)是126,000,000iu/天。
31.在一个特定实施方案中，采用为本领域中已知作为用于相应人类患者或动物模型的起始剂量(例如，高剂量)的剂量的量的约1/35。在其他实施方案中，低累积剂量可选自由以下组成的范围的组：为本领域中已知作为用于相应人类患者或动物模型的起始剂量的剂量的量的1/1000至约1/500、1/1000至约1/190、1/1000至约1/100、1/1000至约1/75、1/1000至约1/50、1/1000至约1/35、1/1000至约1/25、1/1000至约1/10、1/1000至约1/5、1/1000至约1/3、和1/1000至约1/2。在其他实施方案中，低累积剂量可选自由以下组成的范围的组：为本领域中已知作为用于相应人类患者或动物模型的起始剂量的剂量的量的约1/1000、1/500、1/190、1/120、1/100、1/75、1/50、1/35、1/25、1/10、1/5、1/3、和1/2。
32.在另一个实施方案中，“低剂量”或“低累积剂量”可以是大约以下：比在本领域已知(例如，诸如在fda批准的药物标签上，等等)作为用于相应的人类患者或动物模型的起始剂量(例如，高剂量)的剂量的量低2倍至约1000倍；3倍至约500倍、4倍至约300倍、5倍至约200倍、10倍至约190倍、10倍至约150倍、10倍至约125倍、和10倍至约100倍。在又一实施方案中，“低剂量”或“低累积剂量”可选自由以下组成的组：比本领域已知的(例如，诸如在fda批准的药物标签上，等等)作为用于相应人类患者或动物模型的起始剂量的剂量的量低约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、120倍、140倍、160倍、180倍、190倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍和1,000倍。
33.在另一个实施方案中，“低剂量”或“低累积剂量”可以是约1ng/kg直至约1mg/kg；1ng/kg直至约0.9mg/kg、1ng/kg直至约0.8mg/kg、1ng/kg直至约0.7mg/kg、1ng/kg直至约0.6mg/kg、1ng/kg直至约0.5mg/kg、1ng/kg直至约0.4mg/kg、1ng/kg直至约0.3mg/kg、1ng/kg直至约0.2mg/kg、1ng/kg直至约0.1mg/kg。在其他实施方案中，低累积剂量可选自由以下组成的组：约1ng/kg直至约10ug/kg、约100ng/kg直至约5ug/kg、约500ng/kg直至约3ug/kg、约750ng/kg直至约2ug/kg、约1ug/kg直至约1.5ug/kg。在其他实施方案中，低累积剂量可选自由以下组成的组：约0.1ng/kg直至约10ug/kg、约0.1ng/kg直至约5ug/kg、约0.1ng/kg直至约3ug/kg、约0.1ng/kg直至约2ug/kg、约0.1ng/kg直至约1.5ug/kg、以及约0.1ng/kg直至约0.1ug/kg等等。在其他实施方案中，低累积剂量可选自由以下组成的组：约0.01ng/kg直至约100ng/kg、约0.01ng/kg直至约90ng/kg、约0.01ng/kg直至约80ng/kg、约0.01ng/kg直至约70ng/kg、约0.01ng/kg直至约60ng/kg、0.01ng/kg直至约50ng/kg、约0.01ng/kg直至约40ng/kg、约0.01ng/kg直至约30ng/kg、约0.01ng/kg直至约20ng/kg、以及约0.01ng/kg直至约10ng/kg等等。
34.已经报道了几种用于改善阿地白介素的安全特性的方法。然而，这些方法涉及il
‑
2结构的修饰，通常旨在改变受体结合谱以减轻毒性。尽管这些修饰的il
‑
2化合物的毒性低于阿地白介素，但功效也有所降低。因此，先前的低剂量il
‑
2方法均未被证明在临床上有
效。il
‑
2的非天然版本的另一个缺点是免疫原性的风险更大。
35.根据本发明，与irgd共施用通过以下方式改变了低剂量il
‑
2的药理学：使平衡倾斜有利于cd8 t细胞超过treg细胞，这种变化有利于抗肿瘤免疫。这些免疫刺激谱变化是在没有任何可能不利地影响功效、安全性或免疫原性的重组蛋白结构变化的情况下获得的。根据本发明，提供了一种新治疗方法，其中细胞因子，诸如il
‑
2，当与irgd组合时以低累积剂量用于癌症免疫疗法中，从而在避免由通过当前所用剂量的细胞因子引起的暴发性全身免疫活化导致的毒性的同时实现疗效。
36.在其他实施方案中，在本文中设想在人类癌症患者中与irgd一起使用的细胞因子(例如，il
‑
2等)的低累积剂量选自由以下组成的组：不大于：1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.75mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.25mg/kg、0.2mg/kg和0.1mg/kg。在其他实施方案中，在本文中设想在人类癌症患者中与irgd一起使用的细胞因子(例如，il
‑
2等)的低累积剂量选自由以下组成的组：不大于：100ng/kg、90ng/kg、80ng/kg、70ng/kg、60ng/kg、50ng/kg、40ng/kg、30ng/kg、20ng/kg、17.5ng/kg、15ng/kg、12.5ng/kg、10ng/kg、9ng/kg、8ng/kg、7.5ng/kg、7ng/kg、6ng/kg、5ng/kg、4ng/kg、3ng/kg、2.5ng/kg、2ng/kg、1ng/kg、0.9ng/kg、0.8ng/kg、0.7ng/kg、0.6ng/kg、0.5ng/kg、0.4ng/kg、0.3ng/kg、0.2ng/kg和0.1ng/kg。
37.本文还提供了组合物，所述组合物包含irgd(cend
‑
1)；和细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：il
‑
1样、il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
1ra、il
‑
18、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
13、il
‑
15、l
‑
3、il
‑
5、gm
‑
csf、il
‑
6样、il
‑
6、il
‑
11、g
‑
csf、il
‑
12、lif、osm、il
‑
10样、il
‑
10、il
‑
20、il
‑
14、il
‑
16、il
‑
17ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
γ、tnf、cd154、lt
‑
β、tnf
‑
α、tnf
‑
β、4
‑
1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall
‑
1、trail、tweak、trance、epo、tpo、flt
‑
3l、scf、m
‑
csf、msp。在另一个实施方案中，细胞因子可选自由以下组成的组：il
‑
2、阿地白介素、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
13、il
‑
15。在一个特定实施方案中，细胞因子可选自il
‑
2或阿地白介素。在又一个实施方案中，irgd和细胞因子组合物是重组融合蛋白或共价连接的化学缀合物的形式。
38.除了细胞因子例如il
‑
2与irgd的共施用之外，还设想细胞因子(例如il
‑
2)/irgd的融合蛋白或缀合物，将导致更有效和更靶向的肿瘤靶向。例如，以下il
‑
2/irgd重组融合体被设想用于本文，其中氨基酸1
‑
133对应于分泌的il
‑
2，以及信号肽；并且氨基酸138
‑
147对应于被4氨基酸接头结构域(加下划线的)分隔的irgd：
39.aptssstkktqlqlehllldlqnilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfnceyadetativeflnrwitfsqsiistltggsscrgdkgpdca(seq id no:1)
40.还设想用于本文的是在融合蛋白的氨基末端处的irgd序列，其通过相同的4氨基酸接头结构域(加下划线的)与il
‑
2分开，如下所示：
41.crgdkgpdcaggssaptssstkktqlqlehllldlqnilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfnceyadetativeflnrwitfsqsiistlt(seq id no:2)
42.本领域中众所周知的许多其他氨基酸或多肽接头结构域在本文中被设想用于细胞因子(例如，il
‑
2)/irgd重组融合蛋白。在其他实施方案中，本发明的融合蛋白可以采用
一个或多个“接头结构域”，诸如多肽接头。如本文所用，术语“接头结构域”是指以线性序列连接两个或更多个结构域的序列。如本文所用，术语“多肽接头”是指连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个或更多个结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。例如，多肽接头可用于将细胞因子结构域连接至irgd结构域。此类多肽接头可为融合蛋白提供柔性。在某些实施方案中，多肽接头可用于连接(例如，遗传融合)一个或多个细胞因子结构域和/或一个或多个irgd结构域。本发明的融合蛋白可包含多于一个接头结构域或肽接头。
43.如本文所用，术语“gly
‑
ser多肽接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。另一个例示性gly/ser多肽接头包含氨基酸序列ser(gly4ser)n，其中n是1
‑
20。例如，在一个实施方案中，n＝3，即，ser(gly4ser)3。在另一个实施方案中，n＝4，即ser(gly4ser)4，等等。
44.除了细胞因子(例如，il
‑
2)/irgd的重组融合蛋白、化学缀合物之外，本文还设想了用于本发明方法的多肽。这些细胞因子/irgd缀合物可以用下式表示：
45.cl
‑
irgd；
46.其中c是细胞因子(例如，il
‑
2，l是化学接头，并且irgd是内化
‑
精氨酰甘氨酰天冬氨酸环肽或cend
‑
1(参见美国专利8,367,621；usp 9,115,170等；该等专利中的每一者出于所有目的整体以引用方式并入)。在一个实施方案中，本文提供的细胞因子/irgd缀合物是il
‑
2(或阿地白介素)
‑
l
‑
irgd。
47.用于本文的例示性化学接头官能团是本领域中众所周知的，并且包括氨基(
‑
nrh)、羧酸(
‑
c(o)oh)和衍生物、磺酸(
‑
s(0)2
‑
oh)和衍生物、碳酸根(
‑
oc(o)
‑
o
‑
)和衍生物、羟基(
‑
oh)、醛(
‑
cho)、酮(
‑
cro)、异氰酸根(
‑
nco)、异硫氰酸根(
‑
ncs)、卤代乙酰基、烷基卤化物、马来酰亚胺、丙烯酰基、芳基化剂如芳基氟化物、二硫化物如吡啶基二硫化物、乙烯基砜、乙烯基酮、重氮烷烃、重氮乙酰化合物、环氧化物、环氧乙烷、和/或氮丙啶。r的非限制性实例包括h、直链、支链或环状烷基基团，所述烷基基团可包含另外的官能团或杂原子或芳基。
48.如本文所用，“化学接头”是用于通过共价或非共价相互作用将其他原子、分子或官能团接合在一起的分子。us 8,546,309；us8,461,117；8,399,403；10,550,190；10,557,644；10,519,265中阐述了本文可用于缀合生物分子的示例性单体、聚合和其他适合接头，所述专利中的每一者出于所有目的而以引用方式整体并入。
49.鉴于本文根据本发明提供的数据，本文中还设想测试il
‑
2/irgd与其他免疫疗法的组合。例如，当与检查点抑制剂抗体(诸如pd
‑
1抑制剂)组合使用时，il
‑
2已显示出前景。目前，在40个参与地点使用阿地白介素进行了一系列正在进行的研究(用于评估恶性肿瘤的治疗模式和临床反应的阿地白介素观察性研究；nct01415167)。因此，本文中设想了本发明的方法以提供阿地白介素当与检查点抑制剂(例如抗ctla
‑
4；伊匹单抗、)和pd
‑
1抑制剂(派姆单抗和纳武单抗)组合时的治疗增强活性。因此，在特定实施方案中，本发明的方法还包括施用低累积剂量的细胞因子(例如，il
‑
2)和irgd，联合施用选自由以下组成的组的检查点抑制剂：伊匹单抗派姆单抗纳武单抗阿特珠单抗阿维鲁单抗度伐利尤单抗和西米普利单抗
50.il
‑
2是经临床验证的抗癌药物，并且irgd正在癌症患者中进行临床测试，这将极
大地促进将il
‑
2/irgd组合引入临床。
51.还提供了试剂盒，该试剂盒包含irgd(cend
‑
1)；和细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可选自由以下组成的组：il
‑
1样、il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
1ra、il
‑
18、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
13、il
‑
15、l
‑
3、il
‑
5、gm
‑
csf、il
‑
6样、il
‑
6、il
‑
11、g
‑
csf、il
‑
12、lif、osm、il
‑
10样、il
‑
10、il
‑
20、il
‑
14、il
‑
16、il
‑
17ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
γ、tnf、cd154、lt
‑
β、tnf
‑
α、tnf
‑
β、4
‑
1bbl、april、cd70、cd153、cd178、gitrl、light、ox40l、tall
‑
1、trail、tweak、trance、epo、tpo、flt
‑
3l、scf、m
‑
csf、msp。在另一个实施方案中，细胞因子可选自由以下组成的组：il
‑
2、阿地白介素、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
13、il
‑
15。在一个特定实施方案中，细胞因子选自il
‑
2或阿地白介素。
52.还提供了用于实践主题方法的试剂盒。虽然主题试剂盒在所包含的部件方面可能有很大差异，但是通常，试剂盒至少包含至少一种细胞因子(例如，il
‑
2)和合适形式的irgd。主题试剂盒还可包含一种或多种其他药理学试剂。试剂盒中提供的一种或多种细胞因子和irgd和/或其他药剂的剂量可足以用于单次应用或多次应用。因此，在主题试剂盒的某些实施方案中，存在单剂量量的细胞因子(例如，il
‑
2)、irgd和/或单剂量的至少一种另外的不同药剂。
53.在某些其他实施方案中，试剂盒中可以存在多剂量量的细胞因子(例如，il
‑
2)、irgd和/或另一种药剂。在具有多个剂量量的例如至少一种此类细胞因子(例如il
‑
2)和/或irgd的那些实施方案中，可以包装在单个容器，例如单个管、瓶、小瓶等中，或者一个或多个剂量量可以单独包装，使得某些试剂盒可以具有多于一个具有细胞因子(例如，il
‑
2)和/或irgd的容器。
54.主题试剂盒中还可以提供用于将一种或多种细胞因子(例如，il
‑
2)、irgd和/或其他药剂递送至受试者的合适装置。试剂盒中提供的特定递送装置取决于所采用的特定细胞因子(例如，il
‑
2)、irgd和/或药剂，如上所述，例如特定形式的细胞因子(例如，il
‑
2)、irgd和/或其他药剂，诸如细胞因子(例如，il
‑
2)、irgd和/或其他药剂是否被制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂等；以及药剂的具体施用方式，例如，是否为口服、经颊、经直肠、肠胃外、阴道内、宫颈内、鞘内、鼻内、囊内、眼睛上、耳道内、围内(intraperiactivityal)、皮内、经皮、气管内等。因此，某些系统可包括栓剂涂抹器、注射器、静脉内输液袋和管道、电极、透皮贴剂或膜剂等。
55.主题试剂盒还包括关于如何实践主题方法，特别是如何施用试剂盒中提供的至少一种细胞因子(例如，il
‑
2)和/或irgd来治疗受试者的使用说明。使用说明通常记录在适合的记录介质或衬底上。例如，可在衬底如纸或塑料等上印刷使用说明。因此，使用说明可作为包装插入物存在于试剂盒中，在试剂盒容器的标签或其部件(即，与包装或分装相关)等中。在其它实施方案中，使用说明作为存在于适合的计算机可读存储介质例如cd
‑
rom、磁盘等上的电子存储数据文档存在。在其它实施方案中，实际的使用说明不存在于试剂盒中，但提供了用于例如经过互联网从远程资源获得使用说明的装置。此实施方案的实例为包括网址的试剂盒，在所述网址中可查看说明书和/或从所述网址可下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的此装置记录在适合的衬底上。
56.实施例
57.本发明的一个实施方案涉及(尤其)一种向患有实体瘤的患者施用irgd的方法，该方法包括以下步骤：(1)静脉内注射irgd(也称为内化
‑
精氨酰甘氨酰天冬氨酸环肽或cend
‑
1)；(2)低累积剂量的静脉内il
‑
2以激活患者的免疫系统，而没有与常规il
‑
2疗法相关的副作用。
58.高剂量的重组il
‑
2是用于各种类型实体瘤的有效免疫疗法治疗，但是其临床效用已经受到严重的基于机制的副作用的限制。临床阶段irgd肽专门靶向肿瘤，并通过激活
‘
cendr’转胞吞作用和跨组织转运途径增加各种类型的共施用药物的肿瘤渗透和积累。根据本发明，通过允许使用低、无毒剂量的il
‑
2；以及通过选择性增加il
‑
2递送到肿瘤中而非到正常组织，与irgd共施用降低了非靶组织中由il
‑
2和其他细胞因子引起的毒性。
59.在具有4t1小鼠乳腺癌细胞的免疫活性小鼠中产生皮下乳腺肿瘤。将荷瘤小鼠用媒介物对照、irgd、il
‑
2、或il
‑
2 irgd处理5天。在最后一次给药后16小时，对肿瘤进行酶促消化以进行荧光激活细胞分选(facs)。使用facs和ihc来检测总t细胞、cd4和cd8t细胞以及treg细胞的百分比。
60.与媒介物处理相比，发现低累积剂量的单独il
‑
2会增加肿瘤内treg细胞的水平，但对cd4或cd8效应t细胞没有影响。令人惊讶的是，将低累积剂量的il
‑
2与irgd共施用对treg细胞具有相反效应；在肿瘤中观察到了显著较低的treg细胞百分比。相比之下，与低剂量的单独il
‑
2相比，cd8/treg细胞比率增加了至少10倍。irgd组合还导致了cd4效应t细胞增加。重要的是，在这些实验中没有观察到不良副作用。
61.材料和方法
62.细胞培养：将4t1肿瘤细胞作为单层培养物在空气中5％co2的气氛中在37℃下于补充有10％热灭活胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640培养基中体外维持。将肿瘤细胞通过胰蛋白酶
‑
edta处理每周常规传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞并计数用于肿瘤接种。
63.动物及给药信息：将6
‑
8周龄、重约18
‑
22g的共21只雌性balb/c小鼠用于研究。动物购自上海slac实验动物有限公司(shanghai slac laboratory animal co.,ltd)，并且在接种4t1癌细胞前进行打耳标记。每只小鼠在没有麻醉的情况下在右侧腹皮下接种在0.1ml pbs中的细胞(1
×
105个)以用于肿瘤发展。当肿瘤体积超过100mm3时，开始每天用含有或不含irgd(cend
‑
1)的阿地白介素静脉内给药，并且该治疗方案持续5天(治疗信息参见表2)。
64.表2.
[0065][0066]
免疫细胞谱分析—在治疗开始后6天(最后一剂后24小时)收获肿瘤。将肿瘤机械分散并酶促消化。设计facs抗体组以用于测定肿瘤中cd45 活细胞中t、cd4 t、cd8 t和treg
的百分比(表3)。数据表示为分离的总免疫细胞的百分比。
[0067]
表3.
[0068][0069][0070]
数据分析—使用anova和图基事后检验(tukey’s post
‑
test)执行统计分析。
[0071]
结果
[0072]
本研究中使用的低il
‑
2剂量被良好耐受，并且与任何不良临床病征、食物消耗变化或体重增加无关。所分析的临床化学或血液学参数没有变化。
[0073]
用0.25mg/kg(含有或不含irgd)或1mg/kg阿地白介素治疗的肿瘤小鼠中的cd3 t细胞的定量显示，与媒介物对照组相比，每组中cd3 细胞的百分比显著增加(图1；图中未指示统计显著性)。
[0074]
0.25mg/kg阿地白介素 cend1组合组中的cd4 t百分比显著低于使用相同剂量的单独阿地白介素处理的组(图2)。
[0075]
与媒介物对照相比，0.25mg/kg阿地白介素(单独)组中的treg细胞百分比显著增加，而相对于对照组，阿地白介素 cend1组合显著降低了treg细胞计数(图3)。此外，cd4效应t细胞(teff)与treg细胞的比率在0.25mg/kg和1mg/kg阿地白介素组中显著降低，而cd4teff/treg比率在阿地白介素 cend
‑
1组合组中增加(图4；cd4 teff＝总cd4t
‑
treg)。此外，在组合组中观察到了cd8 t/treg比率增加趋势。
[0076]
提供所公开的实施方案的以上描述以使得本领域的任何技术人员能够采取或者使用本发明。本领域技术人员将易于知晓对这些实施方案的各种修改，且在不脱离本发明的精神或范围的情况下，本文描述的基本原理可应用于其他实施方案。因此，应理解，本文所呈现的说明书和附图代表本发明的当前优选实施方案，且因此代表由本发明所广泛地考虑的主题。还应理解，本发明的范围完全涵盖对于本领域技术人员可能明显的其他实施方案，并且本发明的范围相应地不限于此。