一种痕量单链核酸样本制备方法与流程

技术特征：
1.一种痕量单链核酸样本制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）获取碎片化的，且经过5’端磷酸化和3’端羟基化处理的dna单链或者cdna；（2）步骤（1）得到的dna片段进行3’端辅助连接，延伸成dna双链；具体如下：体系中使用一种人工合成的核苷酸片段辅助子，以及dntp，且dntp是普通的dntp和热启动dntp的混合物，普通dntp选用四种dntp中的任一种、两种或者三种，热启动的dntp为选用的普通dntp对应剩余的三种、两种或者一种；在较低温度条件下利用所述的普通dntp进行dna片段的加尾反应；然后给体系一个较高的温度，使热启动的dntp进入到激活工作的状态；再给一个相对较低的温度，使辅助子与dna片段3’端加尾序列互补结合，最后由dna聚合酶分别以辅助子和dna片段为模板向前延伸，直至以辅助子为模板延伸出辅助子的互补链，并且以dna片段为模板延伸出dna片段的互补链，辅助子3’端含有与dna片段加尾互补的序列，且3’末端需要进行封闭，以防止体系中的加尾酶对辅助子进行3’加尾，延伸时解除3’末端的封闭；（3）步骤（2）得到的dna双链的5’端连接上接头，然后进行双模板底物扩增。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中得到的dna片段长度10bp
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1000bp。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中：辅助子长度15nt
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120nt，辅助子3’端至少第1个碱基采用rna碱基进行封闭；所述的rna碱基为ra、rg、rc或ru。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中：辅助子长度30nt
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60nt。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中：dna片段3’端加尾序列长度1
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20个碱基，辅助子3’端与dna片段加尾序列互补结合的碱基序列在辅助子3’端rna碱基之后直到第14个碱基中的任意部分。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中：dna片段3’端加尾序列长度3
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10个碱基。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，通过限制普通dntp的量和/或增加辅助子的量来控制dna片段3’端加尾碱基数目，随着普通dntp的浓度降低，则dna片段3’端加尾碱基数目会减少；随着辅助子的浓度增加，则dna片段3’端加尾碱基数目会减少。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，体系中辅助子浓度为10nm
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20um。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，体系中辅助子浓度为50nm
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10um。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，体系中辅助子浓度为100nm
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5um。11.根据权利要求1，8,9或10所述的方法，其特征在于，反应体系中dna片段量1fmol
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1nmol/50ul。12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，体系中普通dntp的浓度为2um
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2mm；体系中普通dntp浓度是每一种热启动dntp的1倍
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3倍。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，体系中普通dntp的浓度为10um
ꢀ‑
1mm。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，体系中普通dntp的浓度为30um
ꢀ‑
0.5mm。15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中：首先在20℃
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37℃条件下进行dna片段的加尾反应5
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30分钟；然后在90℃
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95℃反应1
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5分钟，使热启动的dntp进入到激活工作的状态,同时使辅助子3’端的rna碱基从辅助子上掉下来，激活辅助子的延伸功能；再在45℃
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72℃反应2
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30分钟，使辅助子与dna片段3’端加尾序列互补结合，之后由dna聚合酶
分别以辅助子和dna片段为模板向前延伸，直至以辅助子为模板延伸出辅助子的互补链，并且以dna片段为模板延伸出dna片段的互补链。16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，体系中对于dna片段加尾实现方式，包括：使用加尾酶，以体系中加入的普通datp、dttp、dgtp和dctp，4种dntp中的任一种、两种或者三种为材料进行dna片段的3’端加尾；体系中用于聚合的聚合酶包括taq聚合酶中的至少一种，或者高保真聚合酶中的至少一种；taq聚合酶包括：2g robust dna聚合酶、rtaq dna聚合酶、taqb dna聚合酶中的一种或几种，高保真聚合酶包括：kapa hifi热启动高保真聚合酶、pfu dna聚合酶、phusion dna聚合酶中的一种或几种。17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，体系中加尾酶的浓度为0.15u/ul
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15u/ul；体系中聚合酶的浓度为0.01u/ul
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2u/ul。

技术总结
本发明公开了一种痕量单链核酸样本制备方法。包括以下步骤：（1）获取碎片化的，且经过5’端磷酸化和3’端羟基化处理的DNA单链或者cDNA；（2）步骤（1）得到的DNA片段进行3’端辅助连接，延伸成DNA双链；（3）步骤（2）得到的DNA双链的5’端连接上接头，然后进行双模板底物扩增。本发明提高了制备痕量核酸样本的效率，并且减少了纯化步骤，对痕量的DNA起始原料测序前处理意义重大。前处理意义重大。前处理意义重大。


技术研发人员：王永利 贺田芬 鞠巍 汤链 徐根明 谢玲灵
受保护的技术使用者：湖南大地同年生物科技有限公司
技术研发日：2021.10.11
技术公布日：2021/12/7