抗sars‑cov‑2纤突糖蛋白抗体和抗原结合片段1.序列表2.序列表的正式文本作为ascii格式的序列表通过efs‑web以电子方式与本说明书同时提交，文件名为“10753wo01‑sequence.txt”，创建于2020年6月25日并且大小为922,462字节。此ascii格式文件中含有的序列表是本说明书的一部分，并且通过全文引用的方式并入本文中。
技术领域：
：3.本发明涉及与冠状病毒纤突蛋白特异性结合的抗体和抗原结合片段以及用于用所述抗体和片段治疗或预防冠状病毒感染的方法。
背景技术：
：：4.新鉴定的病毒(如冠状病毒)因其没有被充分表征而可能难以治疗。这些新鉴定的病毒的出现突出了对开发新型抗病毒策略的需要。严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars‑cov‑2)是引起严重急性呼吸疾病covid‑19的新出现的冠状病毒。截止2020年3月20日，世界卫生组织(worldhealthorganization)已经报告在168个国家、地区或区域中有209,839例确诊病例，导致8,778例死亡。covid‑19的临床特征包含发烧、干咳和疲劳，并且疾病可能会导致呼吸衰竭，从而导致死亡。5.迄今为止，还没有用于预防或治疗sars‑cov‑2感染的疫苗或治疗剂。鉴于对人类健康的持续威胁，迫切需要用于sars‑cov‑2控制的预防性和治疗性抗病毒疗法。因为这种病毒使用其纤突糖蛋白与细胞受体ace2和丝氨酸蛋白酶tmprss2相互作用以进入靶细胞中，所以这种纤突蛋白表示抗体治疗的有吸引力的靶标。具体地，以高亲和力与sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)特异性结合并抑制病毒感染性的完全人抗体在预防和治疗covid‑19中可能是重要的。技术实现要素：6.需要中和治疗性抗sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)抗体和其用于治疗或预防病毒感染的用途。本公开部分地通过提供人抗sars‑cov‑2‑s抗体(如表1的抗体)和其组合(包含例如与其它治疗剂(例如，抗炎剂、抗疟疾剂、抗病毒剂或其它抗体或抗原结合片段)的组合)和使用其以治疗病毒感染的方法来解决这个需要。7.本公开提供了与sars‑cov‑2‑s特异性结合的中和性人抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段。8.一方面，本公开提供了一种分离的重组抗体或其抗原结合片段，其与冠状病毒纤突蛋白(cov‑s)特异性结合，其中所述抗体具有以下特性中的一个或多个：(a)与ec50小于约10‑9m的cov‑s结合；(b)证实在施用于冠状病毒感染的动物之后，所述冠状病毒感染的动物的存活率与没有进行所述施用的相当的冠状病毒感染的动物相比有所增加；和/或(c)包括包含与表1的hcvr具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内含有的三个重链互补决定区(cdr)(cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3)；以及包含与表1的lcvr具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内含有的三个轻链cdr(cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3)。9.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包括表1的抗体的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3；和/或(b)免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包括表1的抗体的所述cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3。10.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包括与表1的hcvr序列具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和/或(b)轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包括与表1的lcvr序列具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。11.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括表1的单抗体的cdr‑h1、cdr‑h2、cdr‑h3、cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括表1的单抗体的hcvr和lcvr。12.一方面，本公开提供了一种抗原结合蛋白，其与上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段中的任何抗体或抗原结合片段竞争与cov‑s结合。13.一方面，本公开提供了一种抗原结合蛋白，其与和cov‑s相同的表位或与所述cov‑s上的重叠表位结合作为上文或本文所讨论的任何抗体或抗原结合片段。14.在各个实施例中的任何实施例中，所述抗体或抗原结合片段可以是多特异性的。15.在各个实施例中的任何实施例中，所述抗体或抗原结合片段可以包括以下性质中的一个或多个：a)抑制冠状病毒生长；b)与冠状病毒的表面结合；c)限制细胞的冠状病毒感染在体外传播；以及d)保护被工程化成表达人ace2或tmprss2蛋白的小鼠免于冠状病毒感染所引起的死亡和/或体重减轻。16.在各个实施例中的任何实施例中，cov‑s是sars‑cov‑2‑s。17.在一方面，本公开提供了一种包括如上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段的复合物，所述复合物与cov‑s多肽结合。在一些实施例中，所述cov‑s是sars‑cov‑2‑s。18.一方面，本公开提供了一种用于制备如上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：(a)将对所述抗体或抗原结合片段进行编码的一个或多个多核苷酸引入到宿主细胞中；(b)在有利于表达所述一个或多个多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞；以及(c)任选地从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长于的培养基中分离所述抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。19.在一方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，其是上文所讨论的方法的产物。20.一方面，本公开提供了一种多肽，其包括：(a)包括表1中所示的hcvr氨基酸序列的抗体或抗原结合片段的hcvr结构域的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3；或(b)包括表1中所示的lcvr氨基酸序列的免疫球蛋白链的lcvr结构域的cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3。21.一方面，本公开提供了一种多核苷酸，其对上文所讨论的多肽进行编码。22.一方面，本公开提供了一种载体，其包括上文所讨论的多核苷酸。23.一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包括如上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段或多肽或多核苷酸或载体。24.一方面，本公开提供了一种组合物或试剂盒，其包括上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段与另外的治疗剂的组合。25.一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括上文或本文所讨论的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体以及任选地另外的治疗剂。在一些实施例中，所述另外的治疗剂是抗病毒药或疫苗。在一些实施例中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：抗炎剂、抗疟疾剂、特异性结合tmprss2的抗体或其抗原结合片段以及与cov‑s特异性结合的抗体或抗原结合片段。在一些情况下，所述抗疟疾剂是氯喹或羟化氯喹。在一些情况下，所述抗炎剂是抗体，如萨瑞鲁单抗(sarilumab)、托珠单抗(tocilizumab)或吉西鲁单抗(gimsilumab)。在一些实施例中，所述另外的治疗剂是包括表1的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列的第二抗体或抗原结合片段。26.在一方面，本公开提供了一种器皿或注射装置，其包括如上文或本文所讨论的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段或组合物。27.一方面，本公开提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的冠状病毒感染的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如上文或本文所讨论的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述冠状病毒选自由sars‑cov‑2、sars‑cov和mers‑cov组成的组。28.在用于治疗或预防冠状病毒感染的方法的一些实施例中，向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些情况下，所述一种或多种另外的治疗剂是抗病毒药或疫苗。在一些情况下，所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：抗炎剂、抗疟疾剂、特异性结合tmprss2的抗体或其抗原结合片段以及与cov‑s特异性结合的抗体或抗原结合片段。在一些情况下，所述抗疟疾剂是氯喹或羟化氯喹。在一些情况下，所述抗炎剂是抗体，例如萨瑞鲁单抗、托珠单抗或吉西鲁单抗。在一些实施例中，所述另外的治疗剂是包括表1的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列的第二抗体或抗原结合片段。用于在本公开的方法的背景下使用的可以单独或彼此组合或与本文所公开的抗体中的一个或多个抗体组合使用的其它抗体包含例如ly‑cov555(礼来公司(elililly))；47d11(wang等人《自然通讯(naturecommunications)》文章编号：2251)；b38、h4、b5和/或h2(wu等人,10.1126/《科学(science).abc2241(2020))；sti‑1499(索伦托医疗公司(sorrentotherapeutics))；vir‑7831和vir‑7832(病毒生物医疗公司(virbiotherapeutics))。29.一方面，本公开提供了一种向受试者体内施用上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将所述抗体或抗原结合片段注射到所述受试者体内。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段皮下、静脉内或肌内注射到所述受试者体内。30.在上文或本文所讨论的各个实施例中的任何实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括vh3‑66或vk1‑33可变结构域序列。31.一方面，本公开提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白，其中所述分离的抗体或抗原结合片段包括包含seqidno:202中所示的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内含有的三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)以及包含seqidno:210中所示的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内含有的三个轻链互补决定区(cdr)(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。32.在一些实施例中，所述hcdr1包括seqidno:204中所示的氨基酸序列，所述hcdr2包括seqidno:206中所示的氨基酸序列，所述hcdr3包括seqidno:208中所示的氨基酸no:654中所示的氨基酸序列，所述轻链包括seqidno:656中所示的氨基酸序列。38.一方面，本公开提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白，其中所述分离的抗体或抗原结合片段包括包含seqidno:640中所示的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内含有的三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)以及包含seqidno:646中所示的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内含有的三个轻链互补决定区(cdr)(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。39.在一些实施例中，所述hcdr1包括seqidno:642中所示的氨基酸序列，所述hcdr2包括seqidno:499中所示的氨基酸序列，所述hcdr3包括seqidno:644中所示的氨基酸序列，所述lcdr1包括seqidno:648中所示的氨基酸序列，所述lcdr2包括seqidno:650中所示的氨基酸序列，并且所述lcdr3包括seqidno:652中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括hcvr，所述hcvr包括seqidno:640中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括lcvr，所述lcvr包括seqidno：646中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括hcvr和lcvr，所述hcvr包括seqidno:640中所示的氨基酸序列，所述lcvr包括seqidno:646中所示的氨基酸序列。40.一方面，本公开提供了一种分离的抗体，其结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白，其中所述分离的抗体包括免疫球蛋白恒定区、包含seqidno:640中所示的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内含有的三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)以及包含seqidno:646中所示的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内含有的三个轻链互补决定区(cdr)(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。41.在一些实施例中，所述hcdr1包括seqidno:642中所示的氨基酸序列，所述hcdr2包括seqidno:499中所示的氨基酸序列，所述hcdr3包括seqidno:644中所示的氨基酸序列，所述lcdr1包括seqidno:648中所示的氨基酸序列，所述lcdr2包括seqidno:650中所示的氨基酸序列，并且所述lcdr3包括seqidno:652中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体包括hcvr和lcvr，所述hcvr包括seqidno:640中所示的氨基酸序列，所述lcvr包括seqidno:646中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体包括：重链和轻链，所述重链包括seqidno:654中所示的氨基酸序列，所述轻链包括seqidno:656中所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述免疫球蛋白恒定区是igg1恒定区。在一些情况下，所述分离的抗体是重组抗体。在一些情况下，所述分离的抗体是多特异性的。42.一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括如上文或本文所讨论的分离的抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。43.在一些实施例中，所述药物组合物进一步包括第二治疗剂。在一些情况下，所述第二治疗剂选自由以下组成的组：结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白的第二抗体或其抗原结合片段、抗炎剂、抗疟疾剂以及结合tmprss2的抗体或其抗原结合片段。44.在一些实施例中，所述第二治疗剂是结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白的第二抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，所述第二抗体或其抗原结合片段包括包含seqidno:202中所示的氨基酸序列的hcvr内含有的三个重链cdr(hcdr1、hcdr2和hcdr3)以及包含seqidno:210中所示的氨基酸序列的lcvr内含有的三个轻链cdr(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。在一些情况下，所述第二抗体或其抗原结合片段包括：hcdr1，所述hcdr1包括seqidno:204中所示的氨基酸序列；hcdr2，所述hcdr2包括seqidno:206中所示的氨基酸序列；hcdr3，所述hcdr3包括seqidno:208中所示的氨基酸序列；lcdr1，所述lcdr1包括seqidno:212中所示的氨基酸序列；lcdr2，所述lcdr2包括seqidno:55中所示的氨基酸序列；以及lcdr3，所述lcdr3包括seqidno:214中所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第二抗体或其抗原结合片段包括hcvr和lcvr，所述hcvr包括seqidno:202中所示的氨基酸序列，所述lcvr包括seqidno:210中所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第二抗体或其抗原结合片段包括重链和轻链，所述重链包括seqidno:216中所示的氨基酸序列，所述轻链包括seqidno:218中所示的氨基酸序列。45.在各个实施例中，上文或本文所讨论的实施例的特征或组分中的任何特征或组分可以组合，并且此类组合涵盖在本公开的范围内。上文或本文所讨论的任何特定值可以与上文或本文所讨论的另一个相关值组合以列举具有表示范围的上端和下端的值的范围，并且此类范围涵盖在本公开的范围内。附图说明46.图1示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。47.图2示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。48.图3示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。49.图4示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。50.图5示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。51.图6示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。52.图7示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。53.图8示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。54.图9a和图9b显示了小鼠(图9a；n＝185)和恢复期人供体(图9b；n＝68)的针对sars‑cov‑2的分离的中和抗体的成对的重链(x轴)和轻链(y轴)的v基因频率。圆圈的阴影和大小对应于分离的中和抗体的受体中存在的重链和轻链对的数量。在vsv假颗粒中和测定中，中和被定义为在抗体的稀释度为1:4(～2μg/ml)的情况下>70％。55.图10a和图10b显示了中和效力。图10a显示了抗sars‑cov‑2纤突mab的中和效力。将抗纤突mab、igg1同种型对照和重组二聚ace2(hace2.hfc)的连续稀释液与pvsv‑sars‑cov‑2‑s‑mneon一起添加到vero细胞，并在感染后24小时以病毒感染性的读数对mneon表达进行测量。将数据绘制为仅相对于病毒感染对照中和的百分比。图10b显示了单独的抗纤突mab和针对veroe6细胞中的sars‑cov‑2‑s病毒的mab的组合的中和效力。56.图11显示了根据针对不同的抗sars‑cov‑2mab的预混合结合测定的矩阵进行的表位箱(bin)分析。针对如所描述的九个抗sars‑cov‑2mab进行表位分箱(binning)。每个图有三个阶段(i、ii和iii)。在阶段i中，将抗sars‑cov‑2mab(20ug/ml)装载到抗人fc探针。在阶段ii中，人igg1阻断mab溶液(100ug/ml)。在阶段iii中，每个600nm抗sars‑cov‑2mab结合位点的100nmsarscov‑2rbd‑mmh预混合复合物的溶液流动经过mab捕获探针。57.图12显示了纤突蛋白rbd结构域的结构的3d表面模型，其示出了ace2界面和hdx‑ms表位映射结果。用表示如通过hdx‑ms实验测定的保护程度的阴影来指示受抗sars‑cov2纤突抗体保护的rbd残基。根据pdb6m17重现rbd结构。58.图13a和图13b显示了mab10933和mab10987与sars‑cov‑2rbd的复合物。图13a显示了mab10933 rbd mab10987复合物的cryoem图，根据图13b的细化模型中的链对其进行阴影描绘。鉴定了rbd、mab10933重链和轻链以及mab10987重链和轻链。59.图14显示了cryoem数据统计。报告了针对图13a和图13b中所示出的mab10987 mab10933 sars‑cov‑2rbd复合物结构的数据收集和细化统计。具体实施方式60.在描述本发明方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。61.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文所提到的所有出版物均通过全文引用的方式并入本文中。62.术语“冠状病毒”或“cov”是指冠状病毒家族的任何病毒，包含但不限于sars‑cov‑2、mers‑cov和sars‑cov。sars‑cov‑2是指被鉴定为新出现的冠状病毒。sars‑cov‑2也被称为2019‑ncov。其通过病毒纤突蛋白与人宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合。纤突蛋白还与活化纤突蛋白以对病毒进行膜融合的tmprss2结合并由其切割。63.术语“cov‑s”(也被称为“s”或“s蛋白”)是指冠状病毒的纤突蛋白，并且可以是指特异性s蛋白，如sars‑cov‑2‑s、mers‑covs和sars‑covs。sars‑cov‑2纤突蛋白是组装成构成包膜冠状病毒颗粒的表面上的纤突或膜粒的三聚体的1273氨基酸类型i膜糖蛋白。蛋白质具有归因于s蛋白的n端(s1)部分和c端(s2)部分的两个重要功能：宿主受体结合和膜融合。cov‑s通过s1亚基中存在的受体结合结构域(rbd)与其同源受体结合。全长sars‑cov‑2纤突蛋白的氨基酸序列通过seqidno:832中提供的氨基酸序列来例示。术语“cov‑s”包含从不同的cov分离物分离的cov纤突蛋白的蛋白质变体以及重组cov纤突蛋白或其片段。所述术语还涵盖与例如组氨酸标签、小鼠或人fc或单个序列(ror1)偶联的cov纤突蛋白或其片段。64.如本文所使用的，术语“冠状病毒感染”或“cov感染”是指感染冠状病毒，如sars‑cov‑2、mers‑cov或sars‑cov。所述术语包含通常在下呼吸道中的冠状病毒呼吸道感染。症状可以包含高烧、干咳、呼吸短促、肺炎、胃肠道症状(如腹泻)、器官衰竭(肾衰竭和肾功能障碍)、脓毒性休克和严重病例的死亡。65.病毒66.本发明包含用于治疗或预防受试者的病毒感染的方法。术语“病毒”包含其在受试者体内的感染可通过施用抗cov‑s抗体或其抗原结合片段来治疗或预防的任何病毒(例如，其中病毒的感染性至少部分地依赖于cov‑s)。在本发明的实施例中，“病毒”是表达纤突蛋白(例如，cov‑s)的任何病毒。术语“病毒”还包含cov‑s依赖性呼吸道病毒，其是使受试者的呼吸组织(例如，上和/或下呼吸道、气管、细支气管、肺)感染并且可通过施用抗cov‑s抗体或其抗原结合片段治疗或预防的病毒。例如，在本发明的实施例中，病毒包含冠状病毒、sars‑cov‑2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)、sars‑cov(严重急性呼吸综合征冠状病毒)和mers‑cov(中东呼吸综合征(mers)冠状病毒)。冠状病毒可以包含α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒的属。在一些实施例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段可以与α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和/或δ冠状病毒结合和/或中和所述α冠状病毒、所述β冠状病毒、所述γ冠状病毒和/或所述δ冠状病毒。在某些实施例中，这种结合和/或中和可以对特定冠状病毒属或对属的特定亚群具有特异性。“病毒感染”是指病毒在受试者体内的侵袭和繁殖。67.冠状病毒是球形的，其直径为大约125nm。冠状病毒最显著的特征是从病毒体的表面产生的棒状纤突突出。这些纤突是病毒体的定义性特征并且给予其日冕的外观，这促使其具有冠状病毒这一名称。在病毒体的包膜内的是核衣壳。冠状病毒具有螺旋对称的核衣壳，这在正义rna病毒之间是不常见的，但对于负义rna病毒而言是更加常见的。sars‑cov‑2、mers‑cov和sars‑cov属于冠状病毒家族。病毒体到宿主细胞的初始附着是通过s蛋白与其受体之间的相互作用而引发的。受体结合结构域(rbd)在冠状病毒s蛋白的s1区内的位点取决于病毒而变化，其中一些病毒的rbd在s1的c端处。s蛋白/受体相互作用是冠状病毒使宿主物种感染的主要决定因素并且还控制病毒的组织向性。许多冠状病毒将肽酶用作其细胞受体。受体结合后，病毒接下来必须获得进入宿主细胞细胞质的途径。这通常通过组织蛋白酶、tmprrs2或另一种蛋白酶对s蛋白进行酸依赖性蛋白切割、然后将病毒和细胞膜融合来完成。68.抗cov‑s抗体和抗原结合片段69.本发明提供了与cov纤突蛋白或其抗原片段特异性结合的抗原结合蛋白，如抗体和其抗原结合片段。70.如本文所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其包括四个多肽链、通过二硫键(即，“全抗体分子”)互连的两个重链(hc)和两个轻链(lc)及其多聚体(例如，igm)。示例性抗体包含例如表1中所列的抗体。每个重链包括重链可变区(“hcvr”或“vh”)和重链恒定区(包含结构域ch1、ch2和ch3)。每个轻链包含轻链可变区(“lcvr”或“vl”)和轻链恒定区(cl)。vh区和vl区可以被进一步细分成被称作互补决定区(cdr)的高变区，其间散布着更保守的被称作构架区(fr)的区。每个vh和vl包括从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链cdr也可以被称作hcdr或cdr‑h，并且如上文所描述的进行编号(例如，hcdr1、hcdr2和hcdr3或cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3)。同样，轻链cdr可以被称作lcdr或cdr‑l，并编号lcdr1、lcdr2和lcdr3或cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3。在本发明的某些实施例中，抗体(或其抗原结合片段)的fr与人种系序列相同，或者是天然或人工修饰的。示例性人种系序列包含但不限于vh3‑66和vk1‑33。因此，本公开提供了抗cov‑s抗体或其抗原结合片段(例如，抗sars‑cov‑2‑s抗体或其抗原结合片段)，其包括vh3‑66或vk1‑33可变重链或轻链区内的表1的hcdr和lcdr序列。本公开进一步提供了抗cov‑s抗体或其抗原结合片段(例如，抗sars‑cov‑2‑s抗体或其抗原结合片段)，其包括选自igkv4‑1、igkv1‑5、igkv1‑9、igkv1‑12、igkv3‑15、igkv1‑16、igkv1‑17、igkv3‑20、iglv3‑21、igkv2‑24、igkv1‑33、igkv1‑39、iglv1‑40、iglv1‑44、iglv1‑51、iglv3‑1、igkv1‑6、iglv2‑8、igkv3‑11、iglv2‑11、iglv2‑14、iglv2‑23或iglv6‑57的轻链和选自ighv1‑69、ighv3‑64、ighv4‑59、ighv3‑53、ighv3‑48、ighv4‑34、ighv3‑33、ighv3‑30、ighv3‑23、ighv3‑20、ighv1‑18、ighv3‑15、ighv3‑11、ighv3‑9、ighv1‑8、ighv3‑7、ighv2‑5、ighv1‑2、ighv2‑70、ighv3‑66、ighv5‑51、ighv1‑46、ighv4‑39、ighv4‑31、ighv3‑30‑3、ighv2‑26或ighv7‑4‑1的重链的组合内的表1的hcdr和lcdr序列。本公开进一步提供了抗cov‑s抗体或其抗原结合片段(例如，抗sars‑cov‑2‑s抗体或其抗原结合片段)，其包括选自igkv4‑1、igkv1‑5、igkv1‑9、igkv1‑12、igkv3‑15、igkv1‑16、igkv1‑17、igkv3‑20、iglv3‑21、igkv2‑24、igkv1‑33、igkv1‑39、iglv1‑40、iglv1‑44、iglv1‑51、iglv3‑1、igkv1‑6、iglv2‑8、igkv3‑11、iglv2‑11、iglv2‑14、iglv2‑23或iglv6‑57的轻链和选自ighv1‑69、ighv3‑64、ighv4‑59、ighv3‑53、ighv3‑48、ighv4‑34、ighv3‑33、ighv3‑30、ighv3‑23、ighv3‑20、ighv1‑18、ighv3‑15、ighv3‑11、ighv3‑9、ighv1‑8、ighv3‑7、ighv2‑5、ighv1‑2、ighv2‑70、ighv3‑66、ighv5‑51、ighv1‑46、ighv4‑39、ighv4‑31、ighv3‑30‑3、ighv2‑26或ighv7‑4‑1的重链的组合内的表1的hcvr和lcvr序列。71.通常，重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链两者的可变结构域包括三个高变区(也称为互补决定区(cdr))，其位于相对保守的构架区(fr)内。通常，从n端到c端，轻链可变结构域和重链可变结构域两者包括fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。在本发明的实施例中，将氨基酸分配给每个结构域是根据以下文献中的定义进行的：《免疫学目的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》,kabat等人；国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth),贝塞斯达,马里兰州；第5版；nih出版第91‑3242号(1991)；kabat(1978)《先进蛋白质化学(adv.prot.chem.)》,32:1‑75；kabat等人,(1977),《生物化学杂志(j.biol.chem.)》,252:6609‑6616；chothia等人,《分子生物学杂志(jmol.biol.)》(1987),196:901‑917或chothia等人,(1989),《自然》,342:878‑883。72.本发明包含单克隆抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)以及包括多个分离的单克隆抗原结合蛋白的单克隆组合物。如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体的群，即，除可以少量存在的可能的天然存在的突变之外，包括所述群的抗体分子的氨基酸序列相同。此类单克隆抗体和片段在组合物中的“多个”是指相同(即，如上文所讨论的，除可以少量存在的可能的天然存在的突变之外，氨基酸序列相同)的抗体和片段的浓度，所述浓度高于自然界中正常存在(例如，在如小鼠或人的宿主生物体的血液中)的浓度。73.在本发明的实施例中，抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)包括例如iga型(例如，iga1或iga2)、igd型、ige型、igg型(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)或igm型的重链恒定结构域。在本发明的实施例中，抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)包括例如κ型或λ型的轻链恒定结构域。74.如本文所使用的，术语“人”抗原结合蛋白(如抗体)包含具有衍生自人细胞中或移植到非人细胞(例如，小鼠细胞)中的人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。参见例如，us8502018、us6596541或us5789215。本发明的人mab可以包含并非由例如cdr(并且具体地，cdr3)中的人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不旨在包含其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系的cdr序列已经移植到人fr序列上的mab。所述术语包含在非人哺乳动物或非人哺乳动物细胞中重组产生的抗体。所述术语不旨在包含从人类受试者中分离或产生的抗体。参见下文。75.本发明包含抗cov‑s嵌合抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)和其使用方法。如本文所使用的，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。(us4816567；以及morrison等人,(1984),《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》,81:6851‑6855)。76.本发明包含抗cov‑s杂交抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)和其使用方法。如本文所使用的，“杂交抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种，或者其中可变结构域而不是恒定区来自第一物种。例如，可变结构域可以从从人分离的且用未从所述抗体分离的固定恒定区表达抗体中获取。在实例1中对示例性杂交抗体进行了描述，其是指分别克隆到含有重恒定区和轻恒定区的表达载体中的抗体重链可变区和轻链可变区衍生的pcr产物。因为杂交抗体含有的可变区和恒定区未从单个天然来源分离，所以所述杂交抗体是合成的且非天然存在的。77.术语“重组”抗原结合蛋白(如抗体或其抗原结合片段)是指通过本领域已知为重组dna技术(其包含例如dna剪接和转基因表达)的技术或方法而产生、表达、分离或获得的此类分子。所述术语包含在非人哺乳动物(包含转基因非人哺乳动物，例如转基因小鼠)或细胞(例如，cho细胞)表达系统或非人细胞表达系统中表达或从重组组合人抗体文库分离的抗体。在一些实施例中，重组抗体与从生物体(例如，小鼠或人)分离但已经通过重组dna技术表达的抗体共享序列。此类抗体的翻译后修饰(例如，糖基化)可能与如从生物体分离的抗体不同。78.本文所公开的重组抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)也可以在大肠杆菌(e.coli)/t7表达系统中产生。在这个实施例中，对本发明的抗cov‑s抗体免疫球蛋白分子(例如，如在表1中发现的)进行编码的核酸可以插入基于pet的质粒中并在大肠杆菌/t7系统中表达。例如，本发明包含用于在在细胞中包括表达t7rna聚合酶的宿主细胞(例如，细菌宿主细胞，如大肠杆菌，如bl21或bl21de3)中表达抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的方法，所述宿主细胞还包含对可操作地连接到t7启动子的免疫球蛋白链进行编码的多核苷酸。例如，在本发明的实施例中，细菌宿主细胞(如大肠杆菌)包含对可操作地连接到lac启动子的t7rna聚合酶基因进行编码的多核苷酸，并且聚合酶和链的表达是通过将宿主细胞与iptg(异丙基‑β‑d‑硫代吡喃半乳糖苷)一起温育而诱导的。参见us4952496和us5693489或studier和moffatt,“使用噬菌体t7rna聚合酶指导克隆基因的选择性高水平表达(useofbacteriophaget7rnapolymerasetodirectselectivehigh‑levelexpressionofclonedgenes)”,《分子生物学杂志》,1986年5月5日；189(1):113‑30。79.本领域具有几种已知的产生重组抗体的方法。在us4816567中公开了用于重组产生抗体的方法的一个实例。80.转化可以通过用于将多核苷酸(例如，dna或rna，包含mrna)引入宿主细胞中的任何已知方法。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域众所周知的，并且包含葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、多烯介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将一种或多种多核苷酸包封在脂质体中、脂质纳米颗粒技术、生物弹射以及直接将dna微量注射到细胞核中。另外，核酸分子可以通过病毒载体(如慢病毒或腺相关病毒)引入哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域公知的。参见例如，美国专利第4,399,216号；第4,912,040号；第4,740,461号和第4,959,455号。在一些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段可以以核酸形式(例如，dna或rna，包含mrna)引入到受试者，使得受试者的自身细胞产生抗体。本公开进一步提供对本文所描述的抗cov‑s抗体进行编码的核苷酸序列的修饰，所述修饰使得抗体表达增加、抗体稳定性增加、核酸(例如，mrna)稳定性增加或抗体对cov纤突蛋白的亲和力或特异性提高。81.因此，本发明包含用于制备本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白(如抗体或其抗原结合片段)或其免疫球蛋白链的重组方法，所述方法包括(i)引入对例如表1的抗原结合蛋白的轻和/或重免疫球蛋白链或cdr进行编码的一个或多个多核苷酸(例如，包含表2的序列中的任何一个或多个序列的核苷酸序列)，例如其中所述多核苷酸位于载体中；和/或整合到宿主细胞染色体中和/或可操作地连接到启动子；(ii)在有利于表达多核苷酸的条件下培养宿主细胞(例如，cho或毕赤酵母(pichia)或巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))，以及(iii)任选地从宿主细胞和/或宿主细胞生长于的培养基分离抗原结合蛋白(例如，抗体或片段)或链。例如，多核苷酸可以例如在使用基因编辑系统(例如，crispr(例如，crispr‑cas9)、talen、megatal、锌指或阿尔戈诺特(argonaute))对染色体进行切割之后通过用载体(如腺相关病毒(aav))进行的靶向插入整合到宿主细胞染色体中。靶向插入可以例如在宿主细胞基因座(白蛋白或免疫球蛋白基因组基因座)处发生。可替代地，插入可以例如使用载体(如慢病毒)位于随机基因座处。当制备包括多于一个免疫球蛋白链的抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)，例如包括两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的抗体时，如果此类链被分泌，则在单个宿主细胞中的共表达所述链会导致链例如在细胞中、在细胞表面或在细胞外缔合，以便形成抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。所述方法包含其中表达仅重免疫球蛋白链或仅轻免疫球蛋白链(例如，本文所讨论的任何重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链，包含其成熟片段和/或可变结构域)的方法。例如，在表达包含此类链的抗体或抗原结合片段时，此类链可用作中间体。例如，本发明还包含包括由包括表2中所示的核苷酸序列的多核苷酸编码的重链免疫球蛋白(或其可变结构域或包括其cdr)和由表2中所示的核苷酸序列编码的轻链免疫球蛋白(或其可变结构域或包括其cdr)的抗cov‑s抗原结合蛋白(如抗体和其抗原结合片段)，其是此类产生方法以及任选地本文所示的纯化方法的产物。例如，在一些实施例中，所述方法的产物是抗cov‑s抗原结合蛋白，其是包括包括表1中所示的氨基酸序列的hcvr和包括表1中所示的氨基酸序列的lcvr的抗体或片段，其中hcvr和lcvr序列选自表1中所列的单抗体。在一些实施例中，所述方法的产物是抗cov‑s抗原结合蛋白，其是包括包括表1中所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3和包括表1中所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3的抗体或片段，其中六个cdr序列选自表1中所列的单抗体。在一些实施例中，所述方法的产物是抗cov‑s抗原结合蛋白，其是包括包括表1中所示的hc氨基酸序列的重链和表1中所示的lc氨基酸序列的轻链的抗体或片段。82.真核和原核宿主细胞(包含哺乳动物细胞)可以用作用于表达抗cov‑s抗原结合蛋白的宿主。此类宿主细胞是本领域中众所周知的，并且许多可从美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)获得。这些宿主细胞尤其包含中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0、sp2细胞、海拉细胞(helacell)、小仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞(例如，hepg2)、a549细胞、3t3细胞、hek‑293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包含人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系(例如，草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)或粉纹夜蛾(trichoplusiani))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包含酵母和丝状真菌细胞，所述丝状真菌细胞包含例如，毕赤酵母、芬兰毕赤酵母(pichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichiatrehalophila)、科克拉马毕赤酵母(pichiakoclamae)、膜醭毕赤酵母(pichiamembranaefaciens)、微小毕赤酵母(pichiaminuta)(甲醇诱导型酵母(ogataeaminuta)、林氏毕赤酵母(pichialindneri))、仙人掌毕赤酵母(pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(pichiasalictaria)、松栎毕赤酵母(pichiaguercuum)、皮杰普毕赤酵母(pichiapijperi)、树干毕赤酵母(pichiastiptis)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、毕赤酵母菌(pichiasp.)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、酵母菌(saccharomycessp.)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母菌(kluyveromycessp.)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、白色念珠菌(candidaalbicans)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、里氏木霉(trichodermareesei)、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、镰刀菌(fusariumsp.)、禾谷镰刀菌(fusariumgramineum)、镰孢霉(fusariumvenenatum)、小立碗藓(physcomitrellapatens)以及粗糙脉孢菌(neurosporacrassa)。本发明包含分离的宿主细胞(例如，cho细胞)，其包括抗原结合蛋白，如表1的抗原结合蛋白；或对其多肽进行编码的多核苷酸。83.术语“特异性结合”是指与抗原(如cov‑s蛋白(例如，sars‑cov‑2‑s))具有结合亲和力的那些抗原结合蛋白(例如，mab)，所述结合亲和力表示为如例如通过在25℃或37℃下进行的实时无标记生物层干涉测定(例如，htx生物传感器)或通过表面等离振子体共振(例如，biacoretm)或通过溶液‑亲和力elisa测量为至少约10‑8m的kd。本发明包含与cov‑s蛋白特异性结合的抗原结合蛋白。84.如本文所使用的，术语抗体或抗原结合蛋白的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”等包含任何与抗原特异性结合以形成复合物的天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗原结合片段的非限制性实例包含：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(cdr)，如cdr3肽)或受约束的fr3‑cdr3‑fr4肽。其它工程化分子如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如，如wo08/020079或wo09/138519中定义的)(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(smip)和鲨鱼可变ignar结构域也涵盖在如本文所使用的表述“抗原结合片段”内。在本发明的实施例中，抗原结合片段包括表1的抗体的三个或更多个cdr(例如，cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3；或cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3)。85.在本发明的实施例中，抗体的抗原结合片段将包括至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包括至少一个与一个或多个构架序列相邻或在所述构架内的cdr。在具有与vl结构域相关联的vh结构域的抗原结合片段中，vh结构域和vl结构域可以以任何适合的布置相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有vh‑vh、vh‑vl或vl‑vl二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以含有单体vh或vl结构域。86.在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有共价连接到至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包含：(i)vh‑ch1；(ii)vh‑ch2；(iii)vh‑ch3；(iv)vh‑ch1‑ch2；(v)vh‑ch1‑ch2‑ch3；(vi)vh‑ch2‑ch3；(vii)vh‑cl；(viii)vl‑ch1；(ix)vl‑ch2；(x)vl‑ch3；(xi)vl‑ch1‑ch2；(xii)vl‑ch1‑ch2‑ch3；(xiii)vl‑ch2‑ch3；以及(xiv)vl‑cl。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中(包含上文所列的任何示例性构型)，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或连接子区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包括上文所列的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，其彼此非共价缔合和/或与一个或多个单体vh或vl结构域共价缔合(例如，通过一个或多个二硫键)。87.抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。多特异性抗原结合蛋白将在本文中进一步进行讨论。88.在具体实施例中，本发明的抗体或抗体片段可以与部分(如配体)或治疗性部分(“免疫缀合物”)(如抗病毒药、第二抗流感抗体或可用于治疗病毒感染(例如，流感病毒感染)的任何其它治疗性部分)缀合。参见下文。89.本发明还提供了一种复合物，所述复合物包括本文讨论的与与抗cov‑s抗体或片段特异性结合的cov‑s多肽或其抗原片段和/或第二抗体或抗原结合片段(例如，可检测地标记的第二抗体)复合的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。在本发明的实施例中，抗体或片段处于体外(例如，固定到固体基质)或处于受试者体内。在本发明的实施例中，cov‑s处于体外(例如，固定到固体基质)或处于病毒的表面上或处于受试者体内。共价连接到不溶性基质材料(例如，玻璃或多糖(如琼脂糖或琼脂糖凝胶)，例如，其珠粒或其它颗粒)的固定化抗cov‑s抗体和其抗原结合片段也是本发明的一部分；任选地，其中固定化抗体与cov‑s或其抗原片段或第二抗体或其片段复合。[0090]“分离的”抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段、多肽、多核苷酸和载体至少部分不含来自产生其的细胞或细胞培养物中的其它生物分子。此类生物分子包含核酸、蛋白质、其它抗体或抗原结合片段、脂质、碳水化合物或其它物质，如细胞碎片和生长培养基。分离的抗体的抗原结合片段可以进一步至少部分地不含表达系统组分(如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子)。通常，术语“分离的”并不旨在是指完全不存在此类生物分子，也不是指不存在水、缓冲液或盐或指包含抗体或片段的药物调配物的组分。[0091]术语“表位”是指与抗原结合蛋白的特定抗原结合位点(例如，称为互补位的抗体分子的可变区)相互作用的抗原决定簇(例如，cov‑s多肽)。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体可以与抗原上的不同区域结合，并且可以具有不同的生物学效应。术语“表位”还可以指b和/或t细胞对其应答的抗原上的位点。其还指抗体结合的抗原的区。表位可以定义为结构性或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接有助于相互作用的亲和力的那些残基。表位可以是线性或构象的(即，由非线性氨基酸构成)。在某些实施例中，表位可以包含决定簇，所述决定簇是分子的化学活性表面基团(如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，并且在某些实施例中，可以具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。[0092]用于确定抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)的表位的方法包含丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke,(2004),《分子生物学方法(methodsmol.biol.)》,248:443‑63)、肽切割分析、晶体学研究和nmr分析。另外，可以采用如抗原的表位切除、表位提取及化学修饰等方法(tomer,(2000),《蛋白质科学(prot.sci.)》,9:487‑496)。可以用于鉴定与抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对所关注蛋白质进行氘标记，然后将抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)与经氘标记的蛋白质结合。接下来，cov‑s蛋白/抗原结合蛋白复合物转移到水中，并且受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比并非是界面的一部分的氨基酸内的可交换质子慢的速率经历氢‑氘反交换。因此，形成蛋白质/抗原结合蛋白界面的一部分的氨基酸可以保留氘，并且因此表现出与并未包含在界面中的氨基酸相比相对较高的质量。在解离抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)后，靶蛋白经历蛋白酶切割和质谱法分析，由此揭示与抗原结合蛋白与之相互作用的特定氨基酸相对应的经氘标记的残基。参见例如，ehring(1999)《分析生物化学(analyticalbiochemistry)》267:252‑259；engen和smith(2001)《分析化学(anal.chem.》,73:256a‑265a。[0093]如本文所使用的，术语“竞争物”是指与抗原(例如，cov‑s)结合并且抑制或阻断另一种抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)与抗原的结合的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)。所述术语还包含两个方向上的两个抗原结合蛋白(例如，抗体)之间的竞争，即，结合并且阻断第二抗体结合的第一抗体，反之亦然。在某些实施例中，第一抗原结合蛋白(例如，抗体)和第二抗原结合蛋白(例如，抗体)可以与相同的表位结合。可替代地，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白(例如，抗体)可以与不同但例如重叠的表位结合，其中一个的结合例如通过空间位阻抑制或阻断第二抗体的结合。抗原结合蛋白(例如，抗体)之间的竞争可以通过本领域已知的方法来测量，例如，通过实时无标记生物层干涉测定。表位作图(例如，通过丙氨酸扫描或氢‑氘交换(hdx))可以用于测定两个或更多个抗体是否是非竞争的(例如，纤突蛋白受体结合结构域(rbd)单体)、竞争同一表位或者竞争但是与不同的微表位竞争(例如，通过hdx鉴定的)。在本发明的实施例中，第一抗cov‑s抗原结合蛋白与第二抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)之间的竞争是通过以下测定的：测量固定化第一抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)(最初未与cov‑s蛋白复合)与与第二抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)复合的可溶cov‑s蛋白结合的能力。第一抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)与复合的cov‑s蛋白结合的能力相对于未复合的cov‑s蛋白有所降低指示第一抗cov‑s抗原结合蛋白和第二抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)竞争。竞争程度可以表示为结合的降低的百分比。此类竞争可以使用实时无标记生物层干涉测定(例如，在octetred384生物传感器(颇尔富迪生物公司(pallfortebiocorp.)上)、elisa(酶联免疫吸附测定)或通过spr(表面等离振子共振)进行测量。[0094]抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，单克隆抗体(mab))之间的结合竞争可以在octetred384生物传感器(颇尔富迪生物公司)上使用实时无标记生物层干涉测定来测定。例如，为了测定两种抗cov‑s单克隆抗体之间的竞争，可以首先通过将尖端浸入抗cov‑smab的溶液中来将抗cov‑smab(后续称为“mab1”)捕获到抗hfc抗体涂覆的octet生物传感器尖端上(颇尔富迪生物公司，#18‑5060)。作为阻断的阳性对照，然后可以用已知的阻断同种型对照mab(后续称为“阻断mab”)使捕获抗体的生物传感器尖端通过浸入阻断mab的溶液中而饱和。为了测定mab2是否与mab1竞争，可以随后将生物传感器尖端浸入已经预温育一段时间的cov‑s多肽和第二抗cov‑smab(随后称为“mab2”)的共复合溶液中，并且可以测定mab1与cov‑s多肽的结合。在实验的每个步骤之间，可以将生物传感器尖端在缓冲液中洗涤。可以在实验过程期间监测实时结合应答，并且可以记录每个步骤结束时的结合应答。[0095]例如，在本发明的实施例中，竞争测定在25℃和约7(例如，7.4)的ph下、例如在存在缓冲液、盐、表面活性剂和非特异性蛋白质(例如，牛血清白蛋白)的情况下进行。[0096]通常，以某种方式修饰的本发明的抗体或抗原结合片段保留与cov‑s特异性结合的能力，例如，当以摩尔为基础表达其cov‑s结合活性时，保留所述活性的至少10％(在与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段与亲本抗体相比保留cov‑s结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多。本发明的抗体或抗原结合片段还旨在可以包含基本上不改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。[0097]多肽(如免疫球蛋白链(例如，mab8021vh、vl、hc或lc、mab8028vh、vl、hc或lc或mab8029vh、vl、hc或lc))的“变体”是指包括与本文所示的(例如，seqidno:2、10、18、20、22、30、38、40、42、50、58或60中所示的)参考氨基酸序列至少约70‑99.9％(例如，70％、72％、74％、75％、76％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％)相同或类似的氨基酸序列的多肽；当通过blast算法进行比较时，其中算法的参数被选择成给出在相应参考序列的整个长度内的相应序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字号：3；查询范围内的最大匹配数：0；blosum62矩阵；空位罚分：存在11，扩展1；条件组成得分矩阵调整)。[0098]多核苷酸的“变体”是指包括与本文所示的(例如，seqidno:1、9、17、19、21、29、37、39、41、49、57或59中所示的)参考核苷酸序列至少约70‑99.9％(例如，至少约70％、72％、74％、75％、76％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)相同的核苷酸序列的多核苷酸；当通过blast算法执行比较时，其中算法的参数被选择成给出在相应参考序列的整个长度内的相应序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字号：28；查询范围内的最大匹配数：0；匹配/不匹配得分：1，‑2；空位罚分：线性)。[0099]在本发明的实施例中，本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)包含与表1中所示的hcvr氨基酸序列具有至少70％(例如，80％、85％、90％、91％、等人,(1992),《科学(science)》,256:144345中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。[0105]抗cov‑s抗体和其抗原结合片段的功能保守变体也是本发明的一部分。抗cov‑s抗体和其抗原结合片段(如本文所讨论的)的变体中的任何变体可以是“功能保守变体”。在一些情况下，此类功能保守变体也可以被表征为保守修饰的变体。如本文所使用的，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基在没有显著改变抗体或片段的一个或多个功能性质的情况下已经变化的抗cov‑s抗体或其抗原结合片段的变体。在本发明的实施例中，本发明的功能保守变体抗cov‑s抗体或其抗原结合片段包括变体氨基酸序列，并且表现出以下功能性质中的一个或多个功能性质：[0106]·抑制冠状病毒(例如，sars‑cov‑2、sars‑cov和/或mers‑cov)在表达ace2和/或tmprss2的细胞(例如，calu‑3细胞)中的生长；[0107]·不会与没有表达ace2和/或tmprss2的mdck/tet‑on细胞显著结合；[0108]·显示细胞(例如，calu‑3,)的冠状病毒感染(例如，通过sars‑cov‑2、sars‑cov和/或mers‑cov)的体外传播；和/或[0109]·任选地，当与第二治疗剂组合时，保护被工程化成表达人tmprss2和/或ace2蛋白的小鼠免于冠状病毒感染(例如，sars‑cov‑2、sars‑cov或mers‑cov)所引起的死亡，例如其中小鼠感染以其它方式致死的剂量的病毒。[0110]·任选地，当与第二治疗剂组合时，保护被工程化成表达人tmprss2和/或ace2蛋白的小鼠免于冠状病毒感染(例如，sars‑cov‑2、sars‑cov或mers‑cov)所引起的体重减轻，例如其中小鼠感染以其它方式引起体重减轻的剂量的病毒。[0111]“中和”或“拮抗剂”抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)是指以任何可检测的程度抑制cov‑s的活性(例如，抑制cov‑s与要被蛋白酶(如tmprss2)切割的受体(如ace2)结合或介导病毒进入宿主细胞中或病毒在宿主细胞中繁殖的活性)的分子。[0112]表1是指包括如下文所示的重链或vh(或其变体)和轻链或vl(或其变体)的抗原结合蛋白(如抗体和其抗原结合片段)；或者所述抗原结合蛋白包括：vh，其包括其cdr(cdr‑h1(或其变体)、cdr‑h2(或其变体)和cdr‑h3(或其变体))；和vl，其包括其cdr(cdr‑l1(或其变体)、cdr‑l2(或其变体)和cdr‑l3(或其变体))，例如，其中免疫球蛋白链、可变区和/或cdr包括如下所描述的特定氨基酸序列。[0113]本文所描述的抗体还包含其中vh与野生型igg4(例如，其中残基108为s)或与igg4变体(例如，其中残基108为p)融合的实施例。[0114]本发明的抗体和抗原结合片段包括包含本文所示的氨基酸序列的免疫球蛋白链以及对抗体的细胞和体外翻译后修饰。例如，本发明包含与cov‑s特异性结合的抗体和其抗原结合片段，其包括本文所示的重和/或轻链氨基酸序列(例如，cdr‑h1、cdr‑h2、cdr‑h3、cdr‑l1、cdr‑l2和/或cdr‑l3)以及其中一个或多个氨基酸残基被糖基化、一个或多个asn残基被脱去酰胺基、一个或多个残基(例如，met、trp和/或his)被氧化、n端gln是焦谷氨酸(pyroe)和/或c端赖氨酸缺失的抗体和片段。[0115]示例性抗sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)抗体的氨基酸序列和核苷酸序列在下文的示例性序列表中示出。[0116]示例性序列表[0117][0118][0119][0120][0121][0122][0123][0124][0125][0126][0127][0128]抗体的施用[0129]本发明提供了用于施用本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，表1的那些)的方法，所述方法包括将抗原结合蛋白引入受试者(例如，人)体内。例如，所述方法包括用注射器的针刺穿受试者的身体，并且将抗原结合蛋白注射到受试者的体内，例如，注射到受试者的静脉、动脉、肿瘤、肌肉组织或皮下组织。[0130]本发明提供了包括本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，表1的那些)的器皿(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱、空心孔针或注射器筒)。[0131]本发明还提供了包括与cov‑s特异性结合的一个或多个抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)(例如，表1的那些)或其药物组合物的注射装置。注射装置可以包装成试剂盒。注射装置是通过肠胃外途径(例如，肌内、皮下或静脉内)将物质引入受试者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预先填充有药物组合物，如自动注射器)，所述注射器例如包含用于保持要注射的流体(例如，包括抗体或其片段或药物组合物)的圆筒或针筒、用于将皮肤和/或血管穿刺以注射液体的针头；以及用于将流体推出圆筒并通过针孔的柱塞。在本发明的实施例中，包括来自本发明的组合的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或其药物组合物的注射装置是静脉内(iv)注射装置。此类装置可以在可以附接到管的套管或套管针/针中包含抗原结合蛋白或其药物组合物，所述管可以附接到用于保持通过套管或套管针/针引入受试者体内的流体(例如，生理盐水)的袋或储器。在本发明的实施例中，一旦套管针和套管插入受试者的静脉中，就可以将抗体或片段或其药物组合物引入装置中并将套管针从插入的套管去除。iv装置可以例如插入外周静脉(例如，在手或手臂中)中；上腔静脉或下腔静脉或在心脏的右心房(例如，中央iv)内；或到锁骨下静脉、颈内静脉或股静脉中，例如向心脏前进，直到其到达上腔静脉或右心房(例如，中央静脉线)为止。在本发明的实施例中，所述注射装置是自动注射器；喷射注射器或外部输注泵。喷射注射器使用穿透表皮以将抗体或片段或其药物组合物引入受试者体内的高压窄射流。外部输注泵是以控制量将抗体或片段或其药物组合物递送到受试者体内的医疗装置。外部输注泵可以电力地或机械地供以动力。不同的泵以不同的方式进行操作，例如，注射泵将流体保持在注射器的储器中，并且可移动活塞控制流体递送；弹性泵将流体保持在可伸缩球囊储器中，并且来自球囊的弹性壁的压力驱动流体递送。在蠕动泵中，一组辊向下压紧在一段柔性管上，从而推动流体前进。在多通道泵中，流体可以以多种速率从多个储器递送。[0132]人抗体的制备[0133]用于在转基因小鼠中产生人抗体的方法是本领域已知的。可将任何此类已知方法用于本发明中用于制备与cov‑s特异性结合的人抗体的上下文。包括以下任何一种的免疫原可以用于产生针对cov‑s的抗体。在本发明的某些实施例中，本发明的抗体从用全长cov‑s或用减毒或灭活的病毒或用对蛋白质或其片段进行编码的dna免疫的小鼠获得。可替代地，可以使用标准的生物化学技术产生cov‑s蛋白或其片段，并且对其进行修饰并且用作免疫原。在本发明的一个实施例中，免疫原是重组产生的cov‑s蛋白或其片段。在本发明的某些实施例中，免疫原可以是cov‑s多肽疫苗。在某些实施例中，可以施用一种或多种加强注射。在某些实施例中，免疫原可以是在大肠杆菌或在任何其它真核或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(cho)细胞)中表达的重组cov‑s多肽。[0134]使用技术(参见例如，us6,596,541，再生元制药公司(regeneronpharmaceuticals)，)或用于产生单克隆抗体的任何其它已知方法，可以初步分离具有人可变区和小鼠恒定区的针对cov‑s的高亲和力嵌合抗体。技术涉及具有基因组的转基因小鼠的产生，所述基因组包括可操作地连接到内源性小鼠恒定区基因座的人重链可变区和人轻链可变区，使得小鼠响应于抗原性刺激而产生包括人可变区和小鼠恒定区的抗体。对抗体的重链可变区和轻链可变区进行编码的dna被分离，并且可操作连接到对人重链恒定区和人轻链恒定区进行编码的dna。然后dna在能够表达完全人抗体的细胞中表达。[0135]通常，用所关注抗原攻击小鼠，并且从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(如b细胞)。可以将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生的杂交瘤细胞系，并且对此类杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定产生对所关注抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。对重链可变区和轻链可变区的进行编码dna可以被分离并且连接到重链和轻链的期望同种型恒定区。此类抗体蛋白可以在如cho细胞等细胞中产生。可替代地，对抗原特异性嵌合抗体或轻链可变结构域和重链可变结构域的进行编码dna可以直接从抗原特异性淋巴细胞分离。[0136]最初，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如在下文的实验部分中，表征并选择抗体以获得期望特性，包含亲和力、选择性、表位等。将小鼠恒定区替换为期望的人恒定区以产生本发明的完全人抗体，例如野生型或经修饰的igg1或igg4。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特性存在于可变区中。[0137]包括fc变体的抗冠状病毒纤突蛋白抗体[0138]根据本发明的某些实施例，提供了包括fc结构域的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)，所述fc结构域包括增强或减少抗体与fcrn受体例如在酸性ph下(如与中性ph相比)的结合的一个或多个突变。例如，本发明包含在fc结构域的ch2区或ch3区中包括突变的抗cov‑s抗体，其中一个或多个突变增加fc结构域在酸性环境中(例如，在ph范围为约5.5到约6.0的核内体中)对fcrn的亲和力。当施用于动物时，此类突变可以导致抗体的血清半衰期增加。此类fc修饰的非限制性实例包含例如以下位置处的修饰：第250位(例如，e或q)；第250位和第428位(例如，l或f)；第252位(例如，l/y/f/w或t)、第254位(例如，s或t)和第256位(例如，s/r/q/e/d或t)；或第428位和/或第433位(例如，h/l/r/s/p/q或k)和/或第434位(例如，a、w、h、f或y[n434a、n434w、n434h、n434f或n434y])；或第250位和/或第428位；或第307位或第308位(例如，308f、v308f)和第434位。在一个实施例中，修饰包括428l(例如，m428l)和434s(例如，n434s)修饰；428l、259i(例如，v259i)和308f(例如，v308f)修饰；433k(例如，h433k)和434(例如，434y)修饰；252、254和256(例如，252y、254t和256e)修饰；250q和428l(例如，t250q和m428l)修饰；以及307和/或308(例如，308f或308p)修饰。在又另一个实施例中，修饰包括265a(例如，d265a)和/或297a(例如，n297a)修饰。[0139]例如，本发明包含包括fc结构域的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)，所述fc结构域选自由以下组成的组的一对或多对突变或一组或多组突变：250q和248l(例如，t250q和m248l)；252y、254t和256e(例如，m252y、s254t和t256e)；428l和434s(例如，m428l和n434s)；257i和311i(例如，p257i和q311i)；257i和434h(例如，p257i和n434h)；376v和434h(例如，d376v和n434h)；307a、380a和434a(例如，t307a、e380a和n434a)；以及433k和434f(例如，h433k和n434f)。[0140]设想了包括本文所示的包括前述fc结构域突变的任何可能的组合的vh和/或vl的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)在本发明的范围内。[0141]本发明还包含抗cov‑s抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段，其包括本文所示的vh和嵌合重链恒定(ch)区，其中所述嵌合ch区包括衍生自多于一种的免疫球蛋白同种型的ch区的区段。例如，本发明的抗体可以包括嵌合ch区，其包括衍生自人igg1、人igg2或人igg4分子、与衍生自人igg1、人igg2或人igg4分子的ch3结构域的一部分或全部组合的ch2结构域的一部分或全部。根据某些实施例，本发明的抗体包括具有嵌合铰链区的嵌合ch区。例如，嵌合铰链可以包括衍生自人igg1、人igg2或人igg4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据eu编号来自第216位到第227位的氨基酸残基)，其与衍生自人igg1、人igg2或人igg4铰链区的“下铰链”序列(根据eu编号来自第228位到第236位的氨基酸残基)组合。根据某些实施例，嵌合铰链区包括衍生自人igg1或人igg4上铰链的氨基酸残基和衍生自人igg2下铰链的氨基酸残基。在某些实施例中，包括本文所述的嵌合ch区的抗体可以表现出不会不利地影响抗体的治疗或药代动力学性质的经过修饰的fc效应子功能。(参见例如，wo2014/022540)。[0142]免疫缀合物[0143]本发明涵盖与另一个部分(例如，治疗性部分(免疫缀合物)，如类毒素或治疗流感病毒感染的抗病毒药)缀合的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。在本发明的实施例中，将抗cov‑s抗体或片段与本文所示的任何另外的治疗剂缀合。如本文所使用的，术语“免疫缀合物”是指与放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告基因部分、酶、肽或蛋白质或治疗剂化学或生物连接的抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。抗原结合蛋白可以沿分子能够结合其靶标(cov‑s)的长度在任何位置处连接到放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告基因部分、酶、肽或蛋白质或治疗剂。免疫缀合物的实例包含抗体‑ꢀ药物缀合物和抗体‑毒素融合蛋白。在本发明的一个实施例中，药剂可以是与cov‑s特异性结合的第二不同抗体。可以与抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或片段)缀合的治疗性部分的类型将考虑要治疗的病状和要实现的期望的治疗效果。参见例如，arnon等人,“用于在癌症疗法中免疫靶向药物的单克隆抗体(monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy)”,《单克隆抗体和癌症疗法(monoclonalantibodiesandcancertherapy)》,reisfeld等人(编著),第243‑56页(alanr.liss公司(alanr.liss,inc.)1985)；hellstrom等人,“用于药物递送的抗体(antibodiesfordrugdelivery)”《受控药物递送(controlleddrugdelivery)》(第2版),robinson等人(编著),第623‑53页(马塞尔德克尔公司(marceldekker，inc.)1987)；thorpe,“癌症疗法中的细胞毒性剂的抗体载体：综述(antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview)”,单克隆抗体(monoclonalantibodies)1984:《生物学和临床应用(biologicalandclinicalapplications)》,pinchera等人(编著),第475‑506页(1985)；“放射标记抗体在癌症疗法中的治疗性用途的分析、结果和未来展望(analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy)”《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy)》,baldwin等人(编著),第303‑16页(学术出版社(academicpress)1985)以及thorpe等人,“抗体‑毒素缀合物的制备和细胞毒性性质(thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody‑toxinconjugates)”《免疫学综述(immunol.rev.)》，62:119‑58(1982)。[0144]多特异性抗体[0145]本发明包含抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)以及其使用方法和制备此类抗原结合蛋白的方法。术语“抗cov‑s”抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)包含多特异性(例如，双特异性或双互补位)分子，所述多特异性分子包含与cov‑s特异性结合的至少一个第一抗原结合结构域(例如，来自表1的抗体的抗原结合结构域)和与不同的抗原或与cov‑s中的与第一抗原结合结构域的表位不同的表位结合的至少一个第二抗原结合结构域。在一些实施例中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者选自表1的抗原结合结构域。在本发明的实施例中，第一表位和第二表位重叠。在本发明的另一个实施例中，第一表位和第二表位不重叠。例如，在本发明的实施例中，多特异性抗体是双特异性igg抗体(例如，igg1或igg4)，其包含与包含表1的抗体的重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链的cov‑s特异性结合的第一抗原结合结构域和与cov‑s的不同表位特异性结合的第二抗原结合结构域。在一些实施例中，双特异性igg抗体(例如，igg1或igg4)包含与cov‑s特异性结合的第一抗原结合结构域和与宿主细胞蛋白(例如，ace2或tmprss2)结合的第二结合结构域。[0146]表1的抗体包含多特异性分子(例如，抗体或抗原结合片段)，所述多特异性分子分别包含那些抗体的cdr‑h和cdr‑l、vh和vl或hc和lc(包含本文所示的其变体)。[0147]在本发明的实施例中，与cov‑s特异性结合的抗原结合结构域可以包含在多特异性分子中，所述抗原结合结构域包括：[0148](1)[0149](i)重链可变结构域序列，其包括表1中所示的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3氨基酸序列，以及[0150](ii)轻链可变结构域序列，其包括表1中所示的cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3氨基酸序列；[0151]或者[0152](2)[0153](i)重链可变结构域序列，其包括表1中所示的氨基酸序列，以及[0154](ii)轻链可变结构域序列，其包括表1中所示的氨基酸序列；[0155]或者[0156](3)[0157](i)重链免疫球蛋白序列，其包括表1中所示的氨基酸序列，以及[0158](ii)轻链免疫球蛋白序列，其包括表1中所示的氨基酸序列。[0159]在本发明的实施例中，多特异性抗体或片段包含多于两种不同的结合特异性(例如，三特异性分子)，例如，与第一和/或第二抗原结合结构域相同或不同的一个或多个另外的抗原结合结构域。[0160]在本发明的一个实施例中，双特异性抗原结合片段包括对第一表位(例如，cov‑s)具有结合特异性的第一scfv(例如，包括表1的vh和vl序列)和对第二不同表位具有结合特异性的第二scfv。例如，在本发明的实施例中，第一和第二scfv与接头(例如肽接头(例如，gs接头，如(ggggs)n(seqidno:834)))拴系在一起，其中n为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。其它双特异性抗原结合片段包含双特异性igg抗体的f(ab)2，其包括表1和与不同表位结合的另一个抗体的重和轻链cdr。[0161]治疗方法[0162]本发明提供用于通过向需要此类治疗或预防的受试者(例如，人)施用治疗有效量的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)来治疗或预防病毒感染(例如，冠状病毒感染)的方法。[0163]受试者体内的冠状病毒感染可以通过向受试者施用本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白来治疗或预防。[0164]有效或治疗有效剂量的(例如，表1的)用于治疗或预防病毒感染的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)指的是足以减轻所治疗受试者的感染的一种或多种体征和/或症状的抗体或片段的量，无论所述减轻是通过诱导此类体征和/或症状的消退或消除完成的还是通过抑制此类体征和/或症状的进展完成的。剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。在本发明的实施例中，用于治疗或预防病毒感染(例如，在成人受试者中)的本发明的抗体或其抗原结合片段的有效或治疗有效剂量为约0.01到约200mg/kg，例如多达约150mg/kg。在本发明的实施例中，剂量多达约10.8或11克(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11克)。根据感染的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施例中，本发明的抗原结合蛋白可以以初始剂量和随后的一个或多个二次剂量来施用。在某些实施例中，可以在初始剂量之后施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，所述第二或多个后续剂量的量可以近似于或小于初始剂量的量，其中后续剂量间隔至少1天到3天；至少一周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。[0165]如本文所使用的，术语“受试者”是指需要预防和/或治疗疾病或病症(如病毒感染或癌症)的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猫、狗、牛、猪、绵羊、马、山羊、兔子)，优选地例如人。受试者可以患有病毒感染(例如，流感感染)或易患上感染。易患上感染的受试者或感染上感染(例如，冠状病毒或流感病毒感染)的风险较高的受试者包含由于自身免疫性疾病导致的免疫系统受损的受试者、接受免疫抑制疗法(例如，器官移植后)的受试者、患有人类免疫缺陷症综合征(hiv)或获得性免疫缺陷综合征(aids)的受试者、患有会耗尽或破坏白细胞的贫血形式的受试者、接受放射或化学疗法的受试者或患有炎性病症的受试者。另外地，年龄非常年轻(例如，5岁或更小)或年龄较大(例如，65岁或更大)的受试者处于较高风险中。此外，受试者由于接近疾病的爆发(例如，受试者居住在人口密集城市中或接近已经确诊或疑似患有病毒感染的受试者)或职业选择(例如，医院工作者、药物研究者、到过感染区域的旅行者或经常乘飞机者)而处于感染上病毒感染的风险中。[0166]“治疗(treat)”或“治疗(treating)”意指向具有疾病或感染(例如，病毒感染)的一种或多种体征或症状的受试者施用本发明(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)，对于所述疾病或感染而言，所述抗原结合蛋白在以有效或治疗有效量或剂量(如本文所讨论的)施用于受试者时是有效的。[0167]本发明还涵盖向处于病毒感染风险中的受试者预防性地施用本发明(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)以便预防此类感染。已经证明基于被动抗体的免疫预防法是预防受试者患上病毒感染的有效策略。参见例如，berry等人,被动广谱流感免疫预防(passivebroad‑spectruminfluenzaimmunoprophylaxis).《流感研究和治疗(influenzarestreat.)》2014；2014:267594。电子版发布于2014年9月22日；以及jianqiang等人,预防和控制甲型流感感染的被动免疫中和策略(passiveimmuneneutralizationstrategiesforpreventionandcontrolofinfluenzaainfections),《免疫疗法(immunotherapy)》2012年2月；4(2):175–186；prabhu等人,《抗病毒素疗法(antivirther.)》2009；14(7):911‑21,对h5血凝素具有特异性的嵌合单克隆抗体对致命的h5n1型流感的预防和治疗功效(prophylacticandtherapeuticefficacyofachimericmonoclonalantibodyspecificforh5hemagglutininagainstlethalh5n1influenza)。“预防(prevent)”或“预防(preventing)”意指向受试者施用本发明(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)以抑制疾病或感染(例如，病毒感染)在受试者体内的表现，对于所述疾病或感染，所述抗原结合蛋白在以有效或治疗有效量或剂量(如本文所讨论的)施用于受试者时是有效的。[0168]在本发明的实施例中，受试者的病毒感染的体征或症状是例如通过病毒滴度测定(例如，将冠状病毒在鸡胚中繁殖或冠状病毒纤突蛋白测定)测定的病毒在受试者体内的存活或增殖。病毒感染的其它体征和症状在本文中进行了讨论。[0169]如上所述，在一些实施例中，受试者可以是非人动物，并且本文所讨论的抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)可以在治疗和/或预防非人动物(例如，猫、狗、猪、牛、马、山羊、兔子、绵羊等)的疾病的兽医情景中使用。[0170]本发明提供了用于治疗或预防病毒感染(例如，冠状病毒感染)或用于诱导病毒感染的至少一种体征或症状的消退或消除或抑制所述至少一种体征或症状的进展的方法，如：[0171]·发烧或感到发热/发冷；[0172]·咳嗽；[0173]·咽喉痛；[0174]·流鼻涕或鼻塞；[0175]·打喷嚏；[0176]·肌肉或身体疼痛；[0177]·头痛；[0178]·疲劳(疲倦)；[0179]·呕吐；[0180]·腹泻；[0181]·呼吸道感染；[0182]·胸闷；[0183]·呼吸短促；[0184]·支气管炎；和/或[0185]·肺炎，[0186](对于病毒感染而言次要的体征或症状)，对有需要的受试者(例如，人)进行的所述治疗或预防或所述诱导或抑制是通过向所述受试者施用治疗有效量的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，通过将蛋白质注射到受试者体内)进行的。[0187]组合和药物组合物[0188]为了制备(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)的药物组合物，将抗原结合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如，《雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》和《美国药典：国家处方集(u.s.pharmacopeia:nationalformulary)》,麦克出版公司(mackpublishingcompany),伊斯顿,宾夕法尼亚州,(1984)；hardman等人,(2001),《古德曼,吉尔曼治疗学的药理学基础(goodmanandgilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics)》,麦格劳希尔出版公司(mcgraw‑hill),纽约市,纽约州；gennaro(2000)《雷明顿：药物科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)》,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(lippincott,williams,andwilkins),纽约市,纽约州；avis等人(编著),(1993),《药物剂型：胃肠外药物(pharmaceuticaldosageforms:parenteralmedications)》,马塞尔德克尔公司,纽约；lieberman等人(编著),(1990),《药物剂型：胃肠外药物(pharmaceuticaldosageforms:tablets)》,马塞尔·德克尔公司,纽约；lieberman等人(编著),(1990),《药物剂型：胃肠外药物(pharmaceuticaldosageforms:dispersesystems)》,马塞尔德克尔公司,纽约；weiner和kotkoskie(2000)《赋形剂毒性和安全性(excipienttoxicityandsafety)》,马塞尔德克尔公司,纽约市,纽约州)。在本发明的一个实施例中，药物组合物是无菌的。此类组合物是本发明的一部分。[0189]本发明的范围包含干燥的(例如，冻干的)组合物，所述组合物包括(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或包含药学上可接受的载体但基本上缺乏水的其药物组合物。[0190]在本发明的另外的实施例中，与本文所公开的(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)组合施用于受试者的另外的治疗剂是根据根据医师案头参考(physicians'deskreference)2003(汤姆森医疗保健(thomsonhealthcare)；第57版(2002年11月1日))向受试者施用的。[0191]施用模式可以变化。施用途径包含口服、直肠、透粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、真皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮或动脉内。[0192]本发明提供了用于施用(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的方法，所述方法包括将蛋白质引入受试者体内。例如，所述方法包括用注射器的针刺穿受试者的身体，并且将抗原结合蛋白注射到受试者的体内，例如，注射到受试者的静脉、动脉、肿瘤、肌肉组织或皮下组织。[0193]本发明提供了一种器皿(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱、空心孔针或注射器筒)，所述器皿包括以下中的任何一个：(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)、多肽(例如，表1的hc、lc、vh或vl)或(例如，表2的)多核苷酸或本文所示的载体或包括药学上可接受的载体的其药物组合物。[0194]在本公开的实施例中，本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)与一个或多个另外的治疗剂组合施用。另外的治疗剂包含但不限于：抗炎剂；抗疟疾剂；特异性结合tmprss2的第二抗体或其抗原结合片段；和与cov‑s特异性结合的第二抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗疟疾剂是氯喹或羟化氯喹。在一些实施例中，所述抗炎剂是抗体，如萨瑞鲁单抗、托珠单抗或吉西鲁单抗。在一些实施例中，另外的治疗剂是本文所公开的(例如，表1的)第二抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，表1的一个、两个、三个、四个或更多个抗体或其抗原结合片段可以组合(例如，同时或顺序地)施用。表1的抗体的具体组合在下文的示例性抗体组合表中列出(每个编号表示特定组合，例如mab10989和mab10987是组合1，mab10989和mab10934是组合2，以此类推)。在一些实施例中，抗体的组合可以选自与不同的表位簇结合的那些抗体。例如，本文所描述的某些抗体属于如下的表位簇：簇1，mab10987、mab10922、mab10936和mab10934；簇2，mab10989、mab10977和mab10933；簇3，mab10920；簇4、mab10954、mab10986和mab10964；和簇5，mab10984。因此，两个抗体的组合可以选自例如簇1和簇2、簇1和簇3、簇1和簇4、簇1和簇5、簇2和簇3、簇2和簇4、簇2和簇5、簇3和簇4、簇3和簇5以及簇4和簇5。在一些实施例中，特异性结合tmprss2的抗体是h1h7017n，如国际专利公开号wo/2019/147831号中所描述的。[0195]示例性抗体组合表[0196][0197][0198]在一些实施例中，来自不同人供体的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗sars‑cov‑2‑s抗体或其抗原结合片段)可以组合。本发明包含一种包括包括来自人受试者的可变结构域的两个(或更多个)抗sars‑cov‑2‑s抗体或抗原结合片段的组合物，其中所述两个(或更多个)抗体或抗原结合片段衍生自不同的受试者(例如，两个不同的人受试者)。衍生自人b细胞的抗体可变区在例如实例1和2(表3)中进行了讨论，其描述了克隆自此类b细胞的可变结构域与并非来自那些b细胞的恒定区组合以产生杂交抗体。此类抗体可变区的来源(供体)在下文的示例性人源性抗体可变区表中示出。在一些实施例中，组合物可以包括具有衍生自供体1的可变结构域的抗体或其抗原结合片段和具有衍生自供体2的可变结构域的抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施例中，组合物可以包括具有衍生自供体1的可变结构域的抗体或其抗原结合片段和具有衍生自供体3的可变结构域的抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施例中，组合物可以包括具有衍生自供体2的可变结构域的抗体或其抗原结合片段和具有衍生自供体3的可变结构域的抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施例中，组合物可以包括来自供体1的mab10987(例如，包括表1中所示出的cdr、可变区或重链和轻链序列的抗体)和来自供体3的mab10989(例如，包括表1中所示出的cdr、可变区或重链和轻链序列的抗体)的组合。[0199]示例性人源性抗体可变区表[0200][0201][0202]在一些实施例中，所述另外的治疗剂是抗病毒药和/或疫苗。如本文所使用的，术语“抗病毒药”是指用于治疗、预防或减轻受试者的病毒感染的任何抗感染药。术语“抗病毒药”包含但不限于阳离子类固醇抗菌剂、亮抑酶肽、抑肽酶、利巴韦林(ribavirin)或干扰素‑α2b。用于通过与作为本发明的一部分的另外的治疗剂组合施用表1的抗体或抗原结合片段来治疗或预防需要所述治疗或预防的受试者的病毒(例如，冠状病毒)感染的方法。[0203]例如，在本发明的实施例中，所述另外的治疗剂是疫苗，例如冠状病毒疫苗。在本发明的实施例中，疫苗是灭活/杀伤病毒疫苗、减毒活病毒疫苗或病毒亚基疫苗。[0204]例如，在本发明的实施例中，所述另外的治疗剂是：[0205][0206](卡莫他特甲磺酸盐)；[0207][0208](萘莫司他甲磺酸盐)；[0209][0210](盐酸溴己新(bhh))；[0211][0212](4‑(2‑氨基甲基)苯磺酰氟盐酸盐(aebsf))；[0213][0214][0215](聚酰胺)。参见shen等人《生物化学(biochimie)》142:1‑10(2017)。[0216]在本发明的实施例中，所述抗病毒药是与冠状病毒(例如，sars‑cov‑2、sars‑cov或mers‑cov)特异性结合的抗体或抗原结合片段。示例性抗cov‑s抗体包含但不限于：h4sh15188p；h1h15188p；h1h15211p；h1h15177p；h4sh15211p；h1h15260p2；h1h15259p2；h1h15203p；h4sh15260p2；h4sh15231p2；h1h15237p2；h1h15208p；h1h15228p2；h1h15233p2；h1h15264p2；h1h15231p2；h1h15253p2；h1h15215p；以及h1h15249p2(如国际专利申请公开号wo/2015/179535中所示的)或其抗原结合片段，例如其中所述抗体或片段包括包含cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3(例如，其vl或轻链)的轻链免疫球蛋白；以及包含任何前述抗cov‑s抗体的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3(例如，其vh或其重链)的重链。[0217]在本发明的某些实施例中，所述另外的治疗剂不是抑肽素、亮抑酶肽、阳离子类固醇抗菌剂、流感疫苗(例如，杀伤、活、减毒全病毒或亚基疫苗)或针对流感病毒的抗体(例如，抗血凝素抗体)。[0218]术语“与……组合”指示可以将本发明的组分、抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)与另一种试剂一起调配成单个组合物例如以进行同时递送，或单独地调配成两种或更多种组合物(例如，试剂盒)。可以在与施用其它组分不同的时间将每种组分施用于受试者；例如，每次施用可以在给定的时间间隔内非同时(例如，分别或按照顺序)给予。此外，单独的组分可以通过相同途径或通过不同途径施用于受试者(例如，其中抗cov‑s抗体或其抗原结合片段)。[0219]试剂盒[0220]另外提供了包括与包含但不限于如本文所讨论的另外的治疗剂的一个或多个另外的组分组合的包含但不限于如本文所讨论的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)的一个或多个组分的试剂盒。抗原结合蛋白和/或另外的治疗剂可以被调配为单个组合物或以两个或更多个组合物(例如，与药学上可接受的载体)单独地调配在药物组合物中。[0221]在本发明的一个实施例中，所述试剂盒在一个容器(例如，无菌玻璃或塑料小瓶)中包含本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或其药物组合物并且在另一个容器(例如，无菌玻璃或塑料小瓶)中包含另外的治疗剂。[0222]在另一个实施例中，所述试剂盒包括本发明的组合，所述组合在单个共用容器中包含任选地一起调配在药物组合物中的本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或其药物组合物以及一个或多个另外的治疗剂。[0223]如果试剂盒包含用于向受试者进行肠胃外施用的药物组合物，则所述试剂盒可以包含用于进行此类施用的装置(例如，注射装置)。例如，所述试剂盒可以包含一个或多个皮下注射针或如上文所讨论的含有本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的其它注射装置。[0224]试剂盒可以包含包装插入物(packageinsert)，所述包装插入物包含关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，此类信息帮助患者和医师有效地且安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，可以在插入物中提供关于本发明的组合的以下信息：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、注意事项、不良反应、过剂量、合适的剂量和施用、如何供应、合适的储存条件、参考资料、制造商/经销商信息和专利信息。[0225]抗体的诊断用途[0226]本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)可以用于检测和/或测量样品中的cov‑s。针对cov‑s的示例性测定可以包含例如使样品与本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白接触，其中所述抗cov‑s抗原结合蛋白标记有可检测标记或报告基因分子或用作捕获配体以选择性地将cov‑s从样品分离。与cov‑s复合的抗cov‑s抗原结合蛋白的存在指示cov‑s存在于样品中。可替代地，未经标记的抗cov‑s抗体可以与本身被可检测标记的第二抗体组合使用。可检测的标记或报告基因分子可以是如3h、14c、32p、35s或125i等放射性同位素；荧光或化学发光部分，如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或酶，如碱性磷酸酶、β‑半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可以用于检测或测量样品中的cov‑s的具体示例性测定包含中和测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)和荧光激活细胞分选(facs)。因此，本发明包含用于检测样品中的纤突蛋白多肽的存在的方法，所述方法包括使样品与抗cov‑s抗原结合蛋白接触以及检测cov‑s/抗cov‑s抗原结合蛋白的存在，其中复合物的存在指示cov‑s的存在。[0227]本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白可以在用于检测样品中的cov‑s或其片段的存在的蛋白质印迹或免疫蛋白质印迹程序中使用。此种程序形成本发明的一部分并且包含例如以下步骤：[0228](1)提供包括要针对cov‑s的存在进行测试的样品的膜或其它固体基质，例如任选地包含使用本领域已知的方法(例如，半干印迹或罐印迹)将来自要针对cov‑s的存在进行测试的样品(例如，来自对样品中的蛋白质进行page或sds‑page电泳分离)的蛋白质转移到膜或其它固体基质上；以及使要针对cov‑s的存在进行测试的膜或其它固体基质或其片段与本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白接触。[0229]此类膜可以采用要针对cov‑s在非变性page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或sds‑page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中的存在进行测试的蛋白质(例如，在凝胶中的电泳分离后)已经转移到其的基于硝化纤维或乙烯基(例如，聚偏二氟乙烯(pvdf))的膜的形式。在使所述膜与抗cov‑s抗原结合蛋白接触之前，任选地用例如无脂干奶等阻断膜，以便结合膜上的非特异性蛋白质结合位点。[0230](2)将所述膜洗涤一次或多次以将未结合的抗cov‑s抗原结合蛋白和其它未结合的物质去除；以及[0231](3)检测结合的抗cov‑s抗原结合蛋白。[0232]检测结合的抗原结合蛋白指示cov‑s蛋白在所述膜或基质上和在所述样品中呈递。检测结合的抗原结合蛋白可以通过使抗原结合蛋白与可检测地标记的第二抗体(抗免疫球蛋白抗体)结合、并且然后检测第二抗体标记的存在来进行。[0233]本文所公开的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)也可以用于进行免疫组织化学。此种方法形成本发明的一部分并且包括例如[0234](1)使要针对cov‑s蛋白的存在进行测试的组织与本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白接触；以及[0235](2)在所述组织上或中检测抗原结合蛋白。[0236]如果抗原结合蛋白自身可检测地标记，则可以直接检测到其。可替代地，抗原结合蛋白可以通过可检测地标记的第二抗体结合，其中然后检测所述标记。[0237]实例[0238]提出以下实例，以向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其发明的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，室温是约25℃，并且压力为大气压或接近大气压。[0239]实例1：针对sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)的人抗体的产生[0240]在包括对人免疫球蛋白重链可变区和κ轻链可变区或人免疫球蛋白重链可变区和λ轻链可变区的进行编码dna的小鼠中产生针对sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)的人抗体。用表达sars‑cov‑2‑s受体结合结构域(rbd)(ncbi登录号(mn908947.3)seqidno:832的氨基酸1‑1273)的载体、然后用带有sars‑cov‑2‑s载体或sars‑cov‑2‑s蛋白的增强剂使每个小鼠产生免疫。由sars‑cov‑2‑s特异性免疫测定来监测抗体免疫应答。当达到期望的免疫应答时，收获淋巴细胞并使其与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选并选择杂交瘤细胞系以鉴定产生sars‑cov‑2‑s特异性抗体的细胞系。如美国专利7582298所描述的，抗sars‑cov‑2‑s抗体直接从抗原阳性的小鼠b细胞中分离，而不与骨髓瘤细胞融合，所述专利通过全文引用的方式并入。使用这种方法，获得了完全人抗sars‑cov‑2‑s抗体(即，具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)。[0241]将抗体可变区从人血液样品分离。实验室确认sars‑cov‑2和症状性covid‑19疾病的pcr测试为阳性后3‑4周，采集患者全血。使用基于氯化铵的裂解缓冲液(生命技术公司(lifetechnologies))裂解红细胞，并通过阴性选择富集b细胞。通过荧光活化细胞分选(facs)分离结合sars‑cov‑2纤突蛋白的单个b细胞。将分离的b细胞单孔铺板并与抗体轻和重可变区域特异性pcr引物混合。每个b细胞的cdna通过逆转录酶(rt)反应合成。然后将每个所产生的rt产物分离并转移到两个对应的孔中以用于后续的抗体重链和轻链pcr。首先将一组所产生的rt产物通过使用对抗体重可变区前导序列具有特异性的5'简并引物或对抗体轻链可变区前导序列具有特异性的5'简并引物和对抗体恒定区具有特异性的3'引物的pcr进行扩增以形成扩增子。然后将扩增子通过使用对抗体重可变区构架1具有特异性的5'简并引物或对抗体轻链可变区构架1具有特异性的5'简并引物和对抗体恒定区具有特异性的3'引物的pcr再次进行扩增以产生用于进行克隆的扩增子。将抗体重链和轻链衍生的pcr产物分别克隆到含有重恒定区和轻恒定区的表达载体中，由此产生杂交抗体的表达载体。将表达全长重和轻链对的表达载体转染到cho细胞以产生抗体蛋白以进行测试。[0242]根据这个实例的方法产生的示例性抗体的生物学性质在下文所示的实例中详细描述。[0243]实例2：重链和轻链可变区氨基酸和核苷酸序列[0244]表1示出了示例性抗sars‑cov‑2‑s抗体的重链和轻链可变区和cdr以及重链和轻链序列的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符列于表2中。[0245]表1：氨基酸序列标识符[0246][0247][0248][0249]表2：核酸序列标识符[0250][0251][0252][0253]虽然本文所公开的抗体具有完全人可变区，但是可以具有小鼠恒定区(例如，小鼠igg1fc或小鼠igg2fc(a或b同种型))或人恒定区(例如，人igg1fc或人igg4fc)。如本领域普通技术人员所理解的，具有特定fc同种型的抗体可以转化为具有不同fc同种型的抗体(例如，具有小鼠igg1fc的抗体可以转化为具有人igg4的抗体等)，但无论如何，由表1和2中所示出的数字标识符指示的可变结构域(包含cdr)将保持相同，并且无论恒定结构域的性质如何，预期抗原的结合性质相同或基本上类似。[0254]通过下一代测序对衍生自小鼠和衍生自人样品的抗体的可变区进行测序，并鉴定重链和轻链对的组库(图10a和图10b)。vi抗体的主要谱系使用与vk1‑9、vk1‑33或vk1‑39配对的vh3‑53，而人源性抗体使用与vk1‑33配对的vh3‑66或与vk1‑39配对的vh2‑70。对重叠序列的进一步分析示出vi与人源性抗体之间的分离的κ链的组库中的较强重叠。尽管λ链的组库并没有很好地重叠，这可能是由于这个试验中仅包含两只λ小鼠。vi与人源性抗体的重链的平均cdr长度类似，平均长度分别为13个和14.5个氨基酸。vi和人源性抗体的平均κcdr长度同为9个氨基酸并且接近平均长度分别为11.1个和10.6个氨基酸的λ链。人源化小鼠和人源性抗体的可用性允许更多的v基因的多样性，并且使得能够随后对非竞争抗体进行鉴定。[0255]如上文所描述的，从以下来源获得抗体：从产生自小鼠的杂交瘤、通过从抗原阳性的小鼠b细胞直接分离或衍生自从抗原阳性人b细胞克隆的可变区。这些来源的总结在表3中示出。[0256]表3：抗体/可变区来源[0257][0258][0259][0260]实例3：通过结合elisa表征杂交瘤上清液[0261]进行elisa结合测定以鉴定与sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域(rbd)结合的抗体上清液。将由在c端处用6x组氨酸标签和两个myc表位标签(sars‑cov‑2‑s‑rbd‑mmh；另请参见ncbi登录号mn908947.3)表达的sars‑cov‑2的rbd(氨基酸319‑541)组成的蛋白质在4℃下在pbs缓冲液中以1μg/ml涂覆在96孔板上过夜。随后使用0.5％(w/v)的含bsa的pbs的溶液阻断非特异性结合位点。仅将抗体上清液或培养基在psa 0.5％bsa阻断缓冲液中以1:40或1:50稀释，并转移到经过洗涤的微量滴定板。在室温下温育一小时后，将孔洗涤，并用与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司(jacksonimmunoresearch))或与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗小鼠igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)检测板结合的上清液。然后根据制造商的建议使用tmb底物溶液(bd生物科学公司)对板进行显影，并在victorx5读板仪上测量450nm处的吸光度。[0262]如上文所描述的，在sars‑cov‑2‑s‑rbd‑mmh蛋白涂覆在微板的情况下，使用结合elisa法评估抗sars‑cov‑2‑s抗体结合sars‑cov‑2‑s的受体结合结构域(sars‑cov‑2‑s‑rbd)的能力。用hrp缀合的抗‑hfc或抗‑mfc抗体检测与涂覆在96孔微量滴定板上的sars‑cov‑2‑s‑rbd‑mmh结合的单点抗体上清液。[0263]三个试验的结合结果汇总于表4中。指示了sars‑cov‑2结合信号(吸光度450nm)，每个实验提供仅培养基背景作为阴性参考。标记有ic(不确定)的样品的板具有实验异常，并且因此所述样品报告为无值。如与仅培养基对照比较所示出的，测试的上清液显示出与sars‑cov‑2‑s‑rbd的大量结合。[0264]表4：上清液与sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域的结合[0265][0266][0267]实例4：抗体与表达sars‑cov‑2‑s的病毒样颗粒的结合[0268]为了研究一组抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体结合sars‑cov‑2纤突糖蛋白的能力，开发了在基于电化学发光的检测平台(msd)中使用表达sars‑cov‑2纤突蛋白的病毒样颗粒(vlp)进行体外结合测定。[0269]为了瞬时表达sars‑cov‑2纤突蛋白(ncbi登录号mn908947.3，氨基酸16‑1211；seqidno:833)，将缺乏糖蛋白g(vsvδg)的水泡性口炎病毒(vsv)用s‑cov‑2纤突蛋白进行假型化(vsv‑sars‑cov‑2‑s)并在hek293t细胞中产生。作为阴性结合对照，将vsvδg用vsvg蛋白(vsv‑g)进行假型化。[0270]根据以下程序进行实验。将上文所描述的两种类型的vlp稀释于pbs中，接种到96孔碳电极板(多阵列高结合板，msd)中，并在4℃下温育过夜，以允许vlp粘附。将非特异性结合位点在室温下用含2％bsa(w/v)的pbs阻断1小时。将含有从sarscov‑2免疫小鼠或受感染人血清产生的抗体的上清液以及在1xpbs 0.5％bsa缓冲液中以1:10或1:20稀释的仅培养基对照添加到板结合的颗粒。然后将板在室温下摇动温育1小时，然后使用aquamax2000洗板机(mds分析技术公司(mdsanalyticaltechnologies))将板用1xpbs洗涤以去除未结合的抗体。在室温下用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)或sulfo‑tagtm缀合的抗小鼠igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)对板结合的抗体进行1小时的检测。洗涤后，根据制造商建议的程序用读取缓冲液(msd)对板进行显影，并用sector成像仪600(mesoscaledevelopment)仪器记录发光信号。捕获直接结合信号(在rlu中)，并计算出表达sars‑cov‑2‑s的vlp与无关vlp的比率。[0271]如上文所描述的，使用免疫结合测定评估抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与表达sars‑cov‑2‑s的vlp的结合相较于与无关的表达vsv的vlp结合的能力。用稀释度为1:10或1:20的抗体上清液对96孔高结合平板(msd)上的固定的vlp进行单点结合，结合1小时，并使用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg或抗小鼠igg抗体进行检测。将来自电化学发光的结合信号记录在sector成像仪600(msd)上。测定抗体与vlp的结合的rlu值。比较表达sars‑cov‑2‑s的vlp结合信号与对照vlp来计算比率。[0272]来自三个实验的结合结果汇总于表5中。从表达sars‑cov‑2‑s的vlp观察到的信号指示结合，而与阴性vlp的比较则提供了相对背景。仅培养基样品提供了二级抗体与没有上清液的样品的结合的基线信号。在表达sars‑cov‑2‑s的vlp上，46种抗体的特异性结合比仅培养基样品(20‑35rlu)高出>4倍，结合信号的范围为85‑13,600rlu。表达sars‑cov‑2‑s的vsv:vsv‑vlp(阴性对照)的比率的范围为1.1‑22.7，其中许多在vsv‑vlp上具有高背景。mab11002的比率为0.9可能是由于上清液样品中的单克隆抗体的浓度较低。[0273]表5：sars‑cov‑2‑svlp结合vsv‑sars‑cov‑2‑s假病毒进行的体外中和测定。[0278]如上文所描述的，通过用对sars‑cov‑2纤突蛋白进行编码的质粒瞬时转染293t细胞来产生vsv假型化病毒。在使用125μllipofectamineltx、30μlplus试剂和高达3mlopti‑mem转染15μg/板纤突蛋白dna前一天，在dmem完全培养基中将细胞以每板1.2×107个细胞接种在15cm的板中。转染后24小时，将细胞用10mlpbs洗涤，然后在10ml的opti‑mem中用0.1vsvδg:mneon病毒的moi感染。将病毒在细胞上温育1小时，每10分钟轻轻摇动一次。将细胞用10mlpbs洗涤3次，然后用20ml感染培养基覆盖，然后在37℃、5％co2下温育24小时。将上清液收集在冰上的250ml离心管中，然后以3000rpm离心5分钟以沉淀任何细胞碎片，在冰上等分，然后冷冻到‑80℃。在用于中和测定中之前，在vero细胞上测试感染性。这个材料将被称为vsv‑sars‑cov‑2‑s。[0279]用vsv‑sars‑cov‑2‑s进行中和测定[0280]在第1天，将vero细胞以80％汇合度接种在t225烧瓶中。对于种子细胞，将培养基从细胞去除，将细胞用20mlpbs(gibco：20012‑043)洗涤，并添加5mltryple并在37℃下温育～5分钟，直到细胞脱落为止。添加5ml的完整dmem使胰蛋白酶失活，并上下移液以分配细胞。为了计数重悬细胞，将20,000个vero细胞平板接种在96孔黑色聚苯乙烯微板(康宁公司(corning)：3904)中的每孔100μl预热的完整dmem中。[0281]在第2天，将vsv‑sars‑cov‑2‑s在冰上解冻，并用感染培养基1:1稀释。[0282]在v型底96孔板中，在60ul感染培养基中产生每种上清液的稀释液。对于培养基(阴性)对照，将60μl的经过稀释的条件培养基添加到孔。除培养基对照孔外，向每个孔添加60μl的经过稀释的vsv‑sars‑cov‑2‑s。向这些孔添加60μl的感染培养基。然后将假病毒与上清液稀释液在室温下一起温育30分钟。将培养基从vero细胞板去除，将100μl的上清液/假病毒混合物转移到细胞，并将板在37℃、5％co2下温育24小时。1:4和1:20(并且针对一些样品，1:100)的最终上清液稀释度用于评估vsv‑sars‑cov‑2‑s假病毒的中和。[0283]在第3天，在温育24小时后，将上清液从细胞孔去除，并用100μl的pbs置换。然后在带有minimax成像细胞仪的spectramaxi3上对板进行读取。[0284]使用中和荧光聚焦测定评估抗sars‑cov‑2‑s抗体中和基于vsv的表达sars‑cov‑2‑s的假型化病毒的能力。三个测定的结合结果总结如下。与模拟上清液对照相比，每种稀释度下的抗体的中和效力表示为百分比。所有抗体展现出中和能力，并且特别是对于以1:100评价的一组抗体，示出较高中和的抗体可以表示更有效的中和能力。[0285]表6：vlp的中和[0286][0287][0288]*nt：未测试到[0289]实例6：抗体在抗体依赖性细胞介导的毒性替代测定中的表征[0290]在使用报告基因细胞和与抗体结合的靶细胞的替代生物测定中测量了靶向sars‑cov‑2纤突蛋白的抗体与fcγr3a(在自然杀伤(nk)细胞上显著表达的fc受体，其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc))相互作用的能力。这个测定使用的是被工程化成在转录因子nfat(nfat‑luc)以及高亲和力人fcγr3a176val同种异型受体(jurkat/nfat‑luc/hfcγr3a176val)的控制下表达报告基因萤光素酶的jurkatt细胞。靶细胞是工程化的表达人cd20的jurkatt细胞(用作与靶向cd20的人igg1抗体的阳性对照)和受强力霉素诱导型启动子控制的全长sars‑cov‑2纤突蛋白。将报告基因细胞与靶细胞一起温育，并且fcγr3a通过与靶细胞结合的人igg1抗体的fc结构域的结合导致报告基因细胞中的转录因子nfat活化并驱动荧光素酶的表达，然后通过发光读数对所述荧光素酶的表达进行测量。[0291]jurkatt细胞被工程化成组成型表达全长人cd20(ncbi登录号为np_690605.1的氨基酸m1‑p297)、tet3g反式活化蛋白(使用takarapef1α‑tet3g载体克隆的，目录号631167)以及强力霉素诱导型全长sars‑cov‑2纤突蛋白(ncbi登录号yp_009724390.1的氨基酸m1‑t1273)。对工程化的表达jurkat/tet3g/hcd20/sars‑cov2纤突蛋白的细胞进行分选以使纤突蛋白进行高表达，并且随后维持在rpmi 10％无tet的fbs p/s/g 500μg/mlg418 1μg/ml嘌呤霉素 250μg/ml潮霉素生长培养基中。[0292]jurkatt细胞被工程化成稳定表达经活化的t细胞的核因子(nfat)荧光素酶报告基因构建体以及高亲和力人fcγr3a176val同种异型受体(ncbi登记号p08637var_003960的氨基酸m1‑k254)。将工程化报告基因细胞维持在rpmi1640 10％fbs p/s/g 0.5μg/ml嘌呤霉素 500μg/mlg418生长培养基中。[0293]在开始替代adcc测定之前的36小时，在含1μg/ml强力霉素的rpmi 10％无tet的fbs p/s/g细胞培养基(西格玛公司(sigma))中诱导5×105个靶细胞/ml。实验前一天，将报告基因细胞在rpmi1640 10％fbs p/s/g 0.5μg/ml嘌呤霉素 500μg/mlg418生长培养基中分裂成7.5×105个细胞/ml的密度。[0294]简而言之，在实验当天，将靶细胞和报告基因细胞转移到测定培养基(rpmi 10％无tet的fbs p/s/g)中，并以3:2的比率(3×104个靶细胞/孔和2×104个报告基因细胞/孔)添加到384孔白色微量滴定板中，然后添加不同浓度的抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液。每个板上包含阳性对照(带有人igg1的cd20抗体)样品和不含抗体的阴性对照样品以使抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液的检测到的adcc活性归一化。将板在37℃/5％co2下温育5小时，然后添加等体积的one‑glotm(普洛麦格公司(promega))试剂以裂解细胞并检测荧光素酶活性。在多标签读板仪envision(珀金埃尔默公司(perkinelmer))上以相对光单位(rlu)捕获发射的光，并使用以下等式对数据进行分析和归一化：[0295][0296]抗sars‑cov‑2‑s抗体活化fcγr3a受体的能力在替代adcc测定中通过将jurkat/nfat‑luc/fcγr3a176val用作报告基因细胞并将jurkat/hcd20/sars‑cov2纤突用作靶细胞进行了评价。测试的每个抗体含有igg1结构域。[0297]表7汇总了结果，其示出了原始荧光素酶活性，并且指示了计算出的阳性对照的％。观察到一定范围的adcc活性％，这表明抗体上清液使fcγr3a活化。所有样品展现出替代adcc活性的某种度量，并且抗体上清液中的10个抗体上清液展现出的替代adcc活性比在阳性对照中观察到的更好。[0298]表7：抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液的adcc替代活性。[0299]mabadcc平均rluadcc(活性(％))mab1091311,480111.9mab1091421,960265.8mab1091514,280153mab1093213,020108.8mab109339,74068.5mab1093411,68092mab1093511,54090.4mab1093615,160133.8mab1093712,340100.1mab1092015,480137.8mab1092110,08067.7mab109229,14056.3mab1092313,340107.1mab109247,22033mab109308,90053.4mab1093812,960102.5mab109399,44059.7mab1094012,520106.2mab1094110,34077.2mab109827,90059.4mab1098467806.8mab1098558402.8mab1098662004.4mab109871202029.4mab1098872008.7mab109891020021.5mab109691050023.1mab10970764010.6mab10971748010mab1096463805.1mab1096567806.9mab10966708010.4mab1096767408.6mab1095469409.8mab1095567408.7mab1095667608.8mab10957712010.8mab109771298033.8[0300]实例7：抗sars‑cov‑2‑s抗体结合特异性测定[0301]进行luminex结合测定以测定抗sars‑cov‑2‑s抗体与一组抗原的结合。对于这个测定，将抗原通过链霉亲和素胺偶联或捕获到路明克斯(luminex)微球，如下：将大约1千万个magplex微球(路明克斯公司(luminexcorp.)，magplex微球，目录号mc10000和mc12000)通过在ph6.2的500μl0.1mnapo4(活化缓冲液)中涡旋而重新悬浮并且然后离心以去除上清液。因为微球对光敏感，所以使其避光。将微球重新悬浮于160μl的活化缓冲液中，并将羧酸酯基团(‑cooh)通过添加20μl的50mg/mln‑羟基琥珀酰亚胺(nhs，赛默飞世尔科技公司(thermoscientific)，目录号24525)、然后添加20μl的50mg/ml1‑乙基‑3‑[3‑ꢀ二甲基氨基丙基]碳二亚胺(edc，赛默飞世尔科技公司，目录号22980)在25℃下活化。10分钟后，通过添加ph5的600μl50mmmes(偶联缓冲液)将反应的ph降低到5.0，并将微球涡旋并离心以去除上清液。将经活化的微球立即与500μl的含25μg/ml的蛋白质抗原或链霉亲和素的偶联缓冲液混合，并在25℃下温育两小时。将偶联反应通过添加ph8.0的50μl的1mtris‑hcl淬灭，并将微球涡旋、离心并用800μl的0.005％pbs(吐温(tween)200.05％)洗涤三次，以去除未偶联的蛋白质和其它反应组分。将微球以1千万个微球/ml重新悬浮于1ml的pbs2％bsa0.05％叠氮化钠中。为了对抗原进行链霉亲和素捕获，将500μl的含12.5μg/ml的生物素化蛋白的pbs溶液添加到链霉亲和素偶联的微球并在25℃下温育一小时。将微球涡旋、离心并用800μl的pbs洗涤三次，并且然后使用500μl的含30mm生物素(密理博西格玛公司(millipore‑sigma)，目录号b4501)的ph8.0的0.15mtris阻断。将微球温育30分钟，然后涡旋、离心并用800μl的pbs洗涤三次。将微球以1千万个微球/ml重新悬浮于1ml的pbs2％bsa0.05％叠氮化钠中。[0302]将用于不同蛋白质和生物素化蛋白的微球以2700个珠粒/ml混合，并将75μl的微球平板接种在96孔procartaplex平底板(赛默飞世尔科技公司，目录号：epx‑44444‑000)的每个板中，并与25μl的含有抗体的单独的抗sars‑cov‑2上清液混合。将样品和微球在25℃下温育两小时，并且然后用200μl的含有0.05％吐温20的dpbs洗涤两次。为了检测抗体与单独的微球结合的水平，添加100μl的含2.5μg/mlr‑藻红蛋白偶联的山羊f(ab')2抗人κ(南方生物技术公司(southernbiotech)，目录号2063‑09)的阻断缓冲液(用于含有鼠fc区的抗体)或100μl的含1.25μg/mlf(ab')2片段特异性的r‑藻红蛋白亲和纯化f(ab')2片段山羊抗小鼠igg(杰克逊免疫研究实验室有限公司，目录号：115‑116‑072)的阻断缓冲液(用于含有人fc区的抗体)，并将其在25℃下温育30分钟。30分钟后，将样品用200μl的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮于150μl的洗涤缓冲液中。在路明克斯flexmap(路明克斯公司)和路明克斯软件版本4.3(路明克斯公司)中对板进行读取。测定中使用的sars‑cov‑2蛋白如下：[0303]rbd_(r319‑f541).mmh：seqidno:829[0304]rbd_(r319‑f541).mfc：seqidno:830[0305]rbd_(r319‑f541).hfc：seqidno:831[0306]路明克斯结合的结果在表8和表9中示出为中值荧光强度(mfi)信号强度。结果示出46个抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液与sars‑cov‑2‑srbd蛋白特异性结合。这些结果还示出这些抗体中的五个抗体与sars冠状病毒纤突rbd蛋白交叉反应，其结合信号大于1000mfi。[0307]表8：sars‑cov‑2纤突rbd、sars‑cov‑2纤突s1、sarsrbd、sars纤突s1、mers纤突和mersrbd蛋白与抗sars‑cov‑2单克隆抗体(含有hfc)的结合信号(mfi)[0308][0309][0310]表8(续)[0311][0312]表9：sars‑cov‑2rbd、sars‑cov‑2纤突s1、sarsrbd、sars纤突s1、mers纤突和mersrbd蛋白与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体(含有mfc)的结合信号(mfi)[0313][0314]表9(续)[0315][0316]实例8：抗sars‑cov‑2‑s抗体多样性测定[0317]进行结合测定以测定抗sars‑cov‑2‑s抗体的结合曲线。对于这个测定，如上文针对路明克斯结合测定所描述的，抗原是胺偶联的。简而言之，将用于16个不同珠粒区的大约9百万个magplex微球(路明克斯公司，magplex微球，目录号magplexmc10000和mc12000)通过在ph6.2的500μl0.1mnapo4中涡旋而重新悬浮并且然后离心以去除上清液。将微球重新悬浮于160μl的活化缓冲液中，并将羧酸酯基团(‑cooh)通过添加20μl的50mg/mln‑羟基琥珀酰亚胺(nhs，赛默飞世尔科技公司，目录号24525)、然后添加20μl的50mg/ml1‑乙基‑3‑[3‑二甲基氨基丙基]碳二亚胺(edc，赛默飞世尔科技公司，目录号22980)在25℃下活化。10分钟后，通过添加ph5的600μl的50mmmes(偶联缓冲液)将反应的ph降低到5.0，并将微球涡旋并离心以去除上清液。将经活化的微球立即与500μl的含20μg/ml的sars‑cov‑2纤突蛋白(rbd)(r319‑f541)‑mmh的偶联缓冲液混合，并在25℃下温育两小时。将偶联反应通过添加ph8.0的50μl的1mtris‑hcl淬灭，并将微球涡旋、离心并用1000μl的pbs洗涤三次。将微球以9百万个微球/ml重新悬浮于250μl的pbs中。[0318]对16个含有胺偶联的蛋白质的微球区中的15个微球区进行如下修饰以进行结合测定：将微球用pbs5％dmso洗涤两次，并将500μl的化学品或酶按照制造建议溶解并以10nm添加到上文所描述的胺偶联的微球。随后将其涡旋并在室温下旋转温育2小时。用pbs2％bsa洗涤微球3次。将微球以9百万个微球/ml重新悬浮于1ml的pbs中。[0319]将经蛋白质修饰的微球和未经蛋白质修饰的(完整的)微球以2700个珠粒/ml混合，并将75μl的微球平板接种在96孔procartaplex96孔平底板(赛默飞世尔科技公司，目录号：epx‑44444‑000)的每个板中，并与25μl的含有抗体的单独的抗sars‑cov‑2‑s上清液混合。将样品和微球在25℃下温育两小时，并且然后用200μl的含有0.05％吐温20的dpbs洗涤两次。为了检测抗体与单独的微球结合的水平，添加100μl的含2.5μg/mlr‑藻红蛋白偶联的山羊f(ab')2抗人κ(南方生物技术公司，目录号2063‑09)的阻断缓冲液(用于含有hfc的抗体)或100μl的含1.25μg/mlf(ab')2片段特异性的r‑藻红蛋白亲和纯化f(ab')2片段山羊抗小鼠igg(杰克逊免疫研究实验室有限公司，目录号115‑116‑072)的阻断缓冲液(用于含有mfc的抗体)或100μl的含1.25μg/mlr‑藻红蛋白抗his(生物传奇公司(biolegend)，目录号362603)的阻断缓冲液(用于ace‑2对照，r&d，目录号933‑zn)，并将其在25℃下温育30分钟。30分钟后，将样品用200μl的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮于150μl的洗涤缓冲液中。在flexmap(路明克斯公司)和路明克斯软件版本4.3(路明克斯公司)中对板进行读取。[0320]路明克斯分箱的结果在表10中示出为中值荧光强度(mfi)信号强度。为了确定簇，相对于完整蛋白质(未经修饰的微球)对数据进行归一化并聚类。将46种抗sars‑cov‑2抗体分类为含有2种或更多种抗体的9个簇，并将11种抗体分类为单个节点。基于层次聚类和树状图的这些结果来分配簇。这些结果示出46种抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液具有不同的结合特性和曲线，这表明收集了与sars‑cov‑2纤突蛋白上的不同表位结合的抗体。[0321]表10：抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与sars‑cov‑2‑srbd.mmh(未经修饰的和经化学或酶修饰的)结合信号(mfi)和簇分配[0322][0323][0324]表10(续)[0325][0326][0327]实例9：抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体的biacore结合动力学[0328]使用基于实时表面等离振子共振的biacoret200/biacore8k生物传感器测定来自来自chot细胞或来自杂交瘤的初级上清液的不同sars‑cov‑2‑s抗体的平衡解离常数(kd)。所有结合研究在25℃下在10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph为7.4的(hbs‑et)运行缓冲液中进行。首先将biacorecm5传感器芯片表面通过与小鼠抗人fc特异性mab或兔抗小鼠fcγ单克隆抗体(ge，目录号br‑1008‑38)进行胺偶联来衍生化以捕获抗sars‑cov‑2抗体。对用c端myc‑myc‑六组氨酸标签表达的人sars‑cov‑2rbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mmh)、用c端小鼠igg2a表达的sars‑cov‑2rbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mfc)或用c端人igg1(sars‑cov‑2rbd‑hfc)表达的sars‑cov‑2rbd细胞外结构域进行结合研究。将在hbs‑et运行缓冲液中制备的单一浓度的sars‑cov‑2rbd‑mmh(100nm)；sars‑cov‑2rbd‑mfc(50nm)或sars‑cov‑2rbd‑hfc(50nm)以30微升/分钟的流动速率注射1.5分钟，同时在hbs‑et运行缓冲液中监测抗体结合的不同sars‑cov‑2rbd试剂的解离2分钟。在每个循环结束时，使用10秒注射20mm磷酸的小鼠抗人fc特异性单克隆抗体表面或40秒注射ph1.5的10mm甘氨酸、hcl的兔抗小鼠fcγ特异性多克隆抗体再生sars‑cov‑2rbd抗体捕获表面。缔合率(ka)和解离率(kd)通过使用bia评价软件v3.1或biacore洞察评价软件v2.0或曲线拟合软件将实时结合传感图拟合到具有质量传输限制的1:1结合模型来测定。结合解离平衡常数(kd)和解离半衰期(t1/2)是根据动力学速率如下计算的：[0329]并且[0330]不同的sars‑cov‑2单克隆抗体与本发明的不同的抗sars‑cov‑2rbd试剂在25℃下结合的结合动力学参数示出于表11和12中。[0331]表11：sars‑cov‑2rbd‑mmh与抗sars‑cov‑2单克隆抗体在25℃下结合的结合动力学[0332][0333][0334]表12：sars‑cov‑2rbd‑mfc或sars‑cov‑2rbd‑hfc与抗sars‑cov‑2单克隆抗体在25℃下结合的结合动力学[0335][0336][0337]*：在实验条件下基于对解离速率常数和解离半衰期进行的测量的极限的估计值。[0338]实例10：通过阻断elisa来表征抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体[0339]开发了基于elisa的阻断测定以测定抗sars‑cov2‑s抗体阻断sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域(rbd)与人血管紧张素转化酶2(hace2)结合的能力。[0340]实验中使用的sars‑cov‑2蛋白包含在c端处用人igg1的fc部分表达的sars‑cov‑2纤突蛋白(氨基酸arg319到phe541)的受体结合结构域(rbd)部分(sars‑cov‑2rbd‑hfc；参见ncbi登录号mn908947.3)。实验中使用的人ace2蛋白购自r&d系统公司(r&dsystems)并包含具有c端10x组氨酸标签的氨基酸谷氨酰胺18到丝氨酸740(hace2‑his；ncbi登录号q9byf1)。[0341]使用以下程序进行实验。将单克隆抗五‑his抗体(凯杰公司(qiagen))在pbs中以1μg/ml在4℃下涂覆在96孔微量滴定板上过夜。将hace2‑his受体以0.2μg/ml添加到pbs中并在室温下结合2小时。随后使用0.5％(w/v)的含bsa的pbs的溶液阻断非特异性结合位点。在其它微量滴定板中，将恒定量的10pm或15pm(如表13中所指示的)的sars‑cov‑2rbd‑hfc蛋白与在pbs 0.5％bsa中1:10或1:20稀释的抗体结合。在一小时温育后，将这些抗体‑蛋白质复合物转移到涂覆有hace2‑his的微量滴定板。在室温下温育1.5小时后，将孔洗涤，并用与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗人igg抗体(杰克森)检测板结合的sars‑cov‑2rbd‑hfc蛋白。然后根据制造商的建议使用tmb底物溶液(bd生物科学公司，目录号555214)对板进行显影，并在victorx5读板仪上测量450nm处的吸光度。[0342]通过计算在存在抗体的情况下与不存在抗体的情况下的固定的sars‑cov‑2‑srbd‑hfc浓度的信号的减少％来进行数据分析。在计算中，将每个板的恒定sars‑cov‑2‑srbd‑hfc的样品在不存在抗体的情况下的结合信号称为100％结合或0％阻断；并将仅培养基的样品在不存在sars‑cov‑2rbd‑hfc的情况下的基线信号称为0％结合或100％阻断。[0343]使用阻断elisa形式评估抗sars‑cov‑2‑s抗体阻断sars‑cov‑2‑srbd与人ace2结合的能力。用hrp缀合的抗‑hfc抗体检测到单点测试抗体上清液阻断了10pm或15pmsars‑cov‑2‑srbd‑hfc与在涂覆在96孔微量滴定板上的抗his抗体上呈递的hace2‑his的结合。[0344]三个测定的阻断结果汇总于表13中。指示了sars‑cov‑2‑s结合信号(450nm)和g计算的阻断％。对于测试样品，观察到一定范围的阻断。对于在第6列和第7列中指示na的样品，在第4列和第5列中包含板校正值，因为数据与那些样品发生的单板切换一致。46个抗体上清液中的43个抗体上清液阻断大于50％的sars‑cov‑2‑srbd‑hfc与板涂覆的人ace2的结合，其中所述抗体上清液中的16个抗体上清液阻断>90％的信号。[0345]表13：阻断elisa结果[0346][0347][0348]实例11：通过氢‑氘交换质谱法对针对纤突糖蛋白的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体进行表位作图[0349]进行氢‑氘交换质谱法(hdx‑ms)以测定与mab10989、mab10987、mab10934、mab10933、mab10920、mab10922、mab10936、mab10954、mab10964、mab10977、mab10984和mab10986相互作用的sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域(rbd(氨基酸r319‑f541))的氨基酸残基。对hdx‑ms方法的一般描述在例如以下文献中示出：ehring(1999)《分析生物化学》267(2):252‑259；以及engen和smith(2001)《分析化学》73:256a‑265a。[0350]在集成的hdx/ms平台上进行hdx‑ms实验，所述平台由用于氘标记和淬灭的leaptechdxpal系统、用于样品消化和装载的沃特斯(waters)acquityi级(binary溶剂管理器)、用于分析梯度的沃特斯acquityi级(二元溶剂管理器)以及用于肽质量测量的赛默qexactivehf质谱仪组成。[0351]在pd7.0下，将标记溶液制备为d2o中的pbs缓冲液(10mm磷酸盐缓冲液、140mmnacl和3mmkcl，在25℃下相当于ph7.4)。为了进行氘标记，在各个时间点一式两份地将10μl的rbd蛋白或与上文所列出的12种抗体中的每种抗体预混合的rbd蛋白与90μl的d2o标记溶液在20℃下一起温育。对于mab10989、mab10987、mab10934和mab10933，时间点分别为0分钟(非氘代对照)、5分钟和10分钟。对于mab10920、mab10922、mab10936、mab10954、mab10964、mab10977、mab10984和mab10986，时间点分别为0分钟(非氘代对照)和10分钟。通过向每份样品添加90μl的预冷却的淬灭缓冲液(0.5mtcep‑hcl，4m尿素和0.5％甲酸)以在20℃下温育90秒钟来淬灭氘化反应。然后将淬灭的样品注射到leaptechdxpal系统以进行在线胃蛋白酶/蛋白酶xiii消化。将消化的肽通过c18柱(2.1mmꢀ×5mm，沃特斯)俘获，并通过另一个c18柱(2.1mm×50mm，沃特斯)在‑5℃下以20分钟梯度(对于mab10989、mab10987、mab10934和mab10933)或以10分钟梯度(对于mab10920、mab10922、mab10936、mab10954、mab10956、mab10964、mab10977和mab10984)与0％到90％的流动相b溶液(流动相a溶液：含0.5％甲酸和4.5％乙腈的水，流动相b溶液：含0.5％甲酸的乙腈)分离。通过赛默qexactivehf质谱法以lc‑ms/ms或lc‑ms模式对洗脱的肽进行分析。[0352]使用byonic搜索引擎(proteinmetrics)针对包含rbd蛋白、胃蛋白酶、蛋白酶xiii的氨基酸序列和其反向序列的数据库搜索来自未氘化rbd蛋白样品的lc‑ms/ms数据。使用非特异性酶消化和人糖基化作为常见的变量修饰，将搜索参数设置为默认值。然后将鉴定的肽的列表输入到hdexaminer软件(版本3.1)以计算所有氘化样品的氘摄取(d‑摄取)和氘摄取百分比的差异(δ％d)。氘摄取百分比的差异(δ％d)如下计算。[0353]氘摄取的差异(δd)＝d‑摄取(rbd‑mab)‑d‑摄取(单独的rbd)[0354][0355]从单独的rbd和与mab10989样品复合的rbd两者中鉴定出总共190种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为86.06％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸467‑513(disteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvl)(seqidno:835)的肽显著受mab10989保护。[0356]从单独的rbd和与mab10987样品复合的rbd两者中鉴定出总共187种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为86.06％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸432‑452(cviawnsnnldskvggnynyl)(seqidno:836)的肽显著受mab10987保护。[0357]从单独的rbd和与mab10934样品复合的rbd两者中鉴定出总共188种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为86.06％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸432‑452(cviawnsnnldskvggnynyl)(seqidno:836)、467‑474(disteiyq)(seqidno:837)和480‑513(cngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvl)(seqidno:838)的肽显著受mab10934保护。[0358]从单独的rbd和与mab10933样品复合的rbd两者中鉴定出总共188种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为86.06％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸467‑510(disteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrv)(seqidno:839)的肽显著受mab10933保护。[0359]从单独的rbd和与mab10920样品复合的rbd两者中鉴定出总共75种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为83.27％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸471‑486(eiyqagstpcngvegf)(seqidno:840)和491‑515(plqsygfqptngvgyqpyrvvvlsf)(seqidno:841)的肽显著受mab10920保护。[0360]从单独的rbd和与mab10922样品复合的rbd两者中鉴定出总共86种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸432‑452(cviawnsnnldskvggnynyl)(seqidno:836)的肽显著受mab10922保护。[0361]从单独的rbd和与mab10936样品复合的rbd两者中鉴定出总共81种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为82.07％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸351‑360(yawnrkrisn)(seqidno:842)、432‑452(cviawnsnnldskvggnynyl)(seqidno:836)、467‑486(disteiyqagstpcngvegf)(seqidno:843)和491‑513(plqsygfqptngvgyqpyrvvvl)(seqidno:844)的肽显著受mab10936保护。[0362]从单独的rbd和与mab10954样品复合的rbd两者中鉴定出总共84种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸400‑422(fvirgdevrqiapgqtgkiadyn)(seqidno:845)、453‑486(yrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegf)(seqidno:846)和490‑515(fplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsf)(seqidno:847)的肽显著受mab10954保护。[0363]从单独的rbd和与mab10964样品复合的rbd两者中鉴定出总共109种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为83.67％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸401‑424(virgdevrqiapgqtgkiadynyk)(seqidno:848)和471‑513(eiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvl)(seqidno:849)的肽显著受mab10964保护。[0364]从单独的rbd和与mab10977样品复合的rbd两者中鉴定出总共78种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸351‑364(yawnrkrisncvad)(seqidno:850)和471‑486(eiyqagstpcngvegf)(seqidno:840)的肽显著受mab10977保护。[0365]从单独的rbd和与mab10984样品复合的rbd两者中鉴定出总共88种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸400‑422(fvirgdevrqiapgqtgkiadyn)(seqidno:845)和453‑486(yrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegf)(seqidno:846)的肽显著受mab10984保护。[0366]从单独的rbd和与mab10986样品复合的rbd两者中鉴定出总共84种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸400‑422(fvirgdevrqiapgqtgkiadyn)(seqidno:845)、453‑486(yrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegf)(seqidno:846)和490‑515(fplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsf)(seqidno:847)的肽显著受mab10986保护。[0367]总而言之，所测试的大多数中和抗体以覆盖包括ace2界面的rbd残基的方式接触rbd；此外，如图15中所示出的，可以基于其接触rbd表面的模式对抗体进行分组。上述数据也汇总于表14‑25中。[0368]表14：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab时显著受保护的纤突蛋白受体结合结构域(rbd)肽[0369][0370][0371]表15：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10987复合物时显著受保护的纤突蛋白rbd肽[0372][0373]表16：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10934复合物时显著受保护的rbd肽[0374][0375][0376]表17：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10933复合物时显著受保护的rbd肽[0377][0378]表18：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10920复合物时显著受保护的rbd肽[0379][0380][0381]表19：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10922复合物时显著受保护的rbd肽[0382][0383]表20：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10936复合物时显著受保护的rbd肽[0384][0385]表21：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10954复合物时显著受保护的rbd肽[0386][0387][0388]表22：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10964复合物时显著受保护的rbd肽[0389][0390]表23：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10977复合物时显著受保护的rbd肽[0391][0392]表24：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10984复合物时显著受保护的rbd肽[0393][0394][0395]表25：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10986复合物时显著受保护的rbd肽[0396][0397]实例12：sars‑cov‑2野生型和变体纤突蛋白的中和[0398]为了测试抗sars‑cov‑2纤突蛋白抗体是否能够中和sars‑cov‑2变体，针对表达野生型和变体纤突蛋白的一组vsv假型化病毒对这些抗体进行了筛选。通过用对sars‑cov‑2纤突蛋白进行编码的质粒或含有对sars‑cov‑2纤突蛋白氨基酸序列进行编码的已知变体的核苷酸变异的相同质粒瞬时转染293t细胞来产生vsv假型化病毒。通过sanger测序来确认所有质粒。在使用125μllipofectamineltx、30μlplus试剂和高达3mlopti‑mem转染15μg/板纤突dna前一天，在dmem完全培养基(1000mldmem，gibco；100mlfbs，gibco；10mlpsg，gibco)中将细胞以每板1.2×107个细胞接种在15cm的板中。转染后24小时，将细胞用10mlpbs洗涤，然后在10ml的opti‑mem中用0.1vsvδg:mneon病毒的moi感染。将病毒在细胞上温育1小时，每10分钟轻轻摇动一次。将细胞用10mlpbs洗涤3次，然后用20ml感染培养基(1000mldmem，gibco；10ml丙酮酸钠，gibco；7mlbsa，西格玛公司；5ml庆大霉素，gibco)覆盖，然后在37℃、5％co2下温育24小时。将假病毒上清液收集在冰上的250ml离心管中，然后以3000rpm离心5分钟以沉淀任何细胞碎片，在冰上等分，然后冷冻到‑80℃。在用于中和测定中之前，在vero细胞上测试感染性。这个材料将被称为vsvδg:mneon/纤突假病毒或vsvδg:mneon/纤突_(变体氨基酸突变)(例如，vsvδg:mneon/纤突_h49y)。[0399]在第1天，将vero细胞以80％汇合度接种在t225烧瓶中，将细胞用pbs(gibco：20012‑043)洗涤，添加tryple以使细胞从烧瓶脱落，并添加完整dmem以灭活胰蛋白酶。将20,000个vero细胞平板接种在96孔黑色聚苯乙烯微板(康宁公司：3904)中的每孔100μl的预热的完整dmem中。在第2天，将vsvδg:mneon/纤突假病毒在冰上融化并用感染培养基稀释。将抗体在u型底96孔板中稀释，从而在210μl感染培养基中以2倍测定浓度产生每种抗体的稀释液。将120μl的经过稀释的抗体转移到新鲜的u型底板，并向每个板添加培养基和igg1对照抗体。将120μl的经过稀释的假病毒添加到除培养基对照孔之外的每个孔。向这些孔添加120μl的感染培养基。将带有抗体的假病毒在室温下温育30分钟，然后将培养基从vero细胞去除。将100μl的抗体/假病毒混合物添加到细胞，并且然后在37℃、5％co2下温育24小时。在第3天，将上清液从细胞孔去除，并用100μl的pbs置换。在带有minimax成像细胞仪的spectramaxi3上对板进行读取。[0400]除使用非复制型vsv‑sars‑cov‑2‑s病毒测试中和能力之外，还使用sars‑cov‑2病毒测试抗体。将单克隆抗体和抗体组合在dmem(质量生物有限公司(qualitybiological))中连续稀释，补充10％(v/v)热灭活胎牛血清(西格玛公司)，1％(v/v)青霉素/链霉素(孪连生物制品公司(geminibio‑products))和1％(v/v)l‑谷氨酰胺(2mm最终浓度，gibco)(veroe6培养基)到250μl的最终体积。接下来，将250μl的含sars‑cov‑2(wa‑1)(1000pfu/ml)的veroe6培养基添加到每个血清稀释液并添加到250μl培养基作为未经处理的对照。将病毒‑抗体混合物在37℃下温育60分钟。温育后，通过噬菌斑测定来测定混合物的病毒滴度。最后，使用4参数对数曲线拟合到中和百分比数据(graphpad软件，加利福尼亚州拉荷亚)来计算50％噬菌斑减少中和滴度(prnt50)值(相对于未经处理的对照的噬菌斑形成，噬菌斑形成减少50％的血清稀释度)。[0401]在vero细胞中测定对纤突蛋白(s‑wt)的武汉‑hu‑1(ncbi登录号mn908947.3)序列进行编码的表达vsv‑sars‑cov‑2纤突蛋白(s)的假病毒的单独的单克隆抗体的半数最大抑制浓度(ic50)(表26)。大多数抗体在皮摩尔范围(pm)内显示出中和效力，其中有些抗体在纳摩尔(nm)范围内表现出中和效力。[0402]虽然重组ace2能够介导vsv‑纤突假颗粒的中和，但是如先前所报道的，其效力远低于单克隆抗体的效力，相对于最佳中和mab，其效力下降多于1000倍(图10a)。另外，mab10987、mab10989、mab10933和mab10934的有效中和活性在中和测定中得到证实，包含中和veroe6细胞中的sars‑cov‑2(图10b)。所有中和测定跨四个mab(mab10987、mab10989、mab10933和mab10934)产生类似的效力，并且没有组合显示出协同中和活性(图10b)。[0403]表26：针对vero细胞中的vsv‑sars‑cov‑2‑s假颗粒的野生型菌株的mab中和效力(ic50(m))[0404][0405][0406]从表示全球循环菌株的7000多个公开可用的sars‑cov‑2序列鉴定了纤突(s)蛋白中的氨基酸变体，并将其克隆到vsv假颗粒中。用对变体进行编码的假颗粒进行中和测定以评估每种变体对单克隆抗体的中和效力的影响。表27展示了针对对变体进行编码的假颗粒的单克隆抗体相对于单一浓度为5μg/ml的sars‑cov‑2纤突(s‑wt)的相对中和效力。对于每个单独的抗体和变体，捕获相对于s‑wt的中和百分比。除mab10985和r408i变体以外，没有抗体在5μg/ml浓度下展示出中和效力丧失。这些数据证实了针对全球循环sars‑cov‑2纤突变体的单克隆抗体的广泛的功能性中和覆盖率。[0407]为了进一步询问s蛋白变体对单克隆抗体的中和效力的影响，运行了完整中和曲线以测定针对位于s蛋白的受体结合结构域(rbd)内的变体的亚群的最有效的中和抗体的ic50值。表28示出了每种变体假颗粒的ic50中和值。在假颗粒中和测定之间可以观察到高达3倍的固有变异性，并且其并非指示中和效力的变化。这些数据证实了抗体保留其针对一组不同的s蛋白rbd变体的中和效力。[0408]表27.vero细胞中的抗体浓度为5μg/ml的对s蛋白进行编码的vsv‑sars‑cov‑2变体的相对中和[0409][0410][0411]表27(续)[0412][0413][0414]表28.vero细胞中vsv‑sars‑cov‑2‑srbd变体的中和ic50(m)[0415][0416]表28(续)[0417][0418]实例13：经纯化的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体的biacore结合动力学[0419]使用基于实时表面等离振子共振的biacoret200/biacore8k生物传感器测定与经过纯化的chot抗sars‑cov‑2单克隆抗体(mab)结合的不同的sars‑cov‑2rbd试剂的平衡解离常数(kd)。所有结合研究在25℃和37℃下在10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph为7.4的(hbs‑et)运行缓冲液中进行。首先将biacorecm5传感器芯片表面通过与小鼠抗人fc特异性mab(再生元公司(regeneron)，mab2567)进行胺偶联来衍生化以捕获抗sars‑cov‑2bmab。对用c端myc‑myc‑六组氨酸表达的人sars‑cov‑2rbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mmh)和用c端小鼠igg2a表达的sars‑cov‑2rbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mfc)进行结合研究。使用这些试剂允许对抗体分别结合单体和二聚体rbd肽的能力进行测试。[0420]在hbs‑et运行缓冲液中制备不同浓度的hsars‑cov‑2rbd‑mmh(90nm‑3.33nm，3倍稀释度)和sars‑cov‑2rbd‑mfc(30nm‑1.11nm，3倍稀释度)，并将其以50微升/分钟的流动速率注射3分钟，同时在hbs‑et运行缓冲液中监测mab结合的不同sars‑cov‑2rbd试剂的解离6‑10分钟。在每个循环结束时，使用12秒注射20mm磷酸的小鼠抗人fc特异性mab表面再生sars‑cov‑2rbdmab捕获表面。缔合率(ka)和解离率(kd)通过使用bia评价软件v3.1或biacore洞察评价软件v2.0或曲线拟合软件将实时结合传感图拟合到具有质量传输限制的1:1结合模型来测定。结合解离平衡常数(kd)和解离半衰期(t1/2)是根据动力学速率如下计算的：[0421]并且[0422]不同的sars‑cov‑2mab与本发明的不同的抗sars‑cov‑2rbd试剂在25℃和37℃下结合的结合动力学参数分别示出于表29到32中。[0423]表29：sars‑cov‑2rbd‑mmh与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在25℃下结合的结合动力学参数。[0424][0425][0426]表30：sars‑cov‑2rbd‑mmh与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在37℃下结合的结合动力学参数。[0427][0428][0429]表31：sars‑cov‑2rbd‑mfc与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在25℃下结合的结合动力学参数。[0430][0431][0432]表32：sars‑cov‑2rbd‑mfc与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在37℃下结合的结合动力学参数[0433][0434][0435]实例14：如通过elisa测定的，抗sars‑cov‑2抗体阻断rbd与hace2的结合[0436]使用基于elisa的阻断测定以测定抗sars‑cov‑2抗体阻断sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域(rbd)与其受体、人血管紧张素转化酶2(hace2)结合的能力。[0437]这个测定中使用的sars‑cov‑2蛋白包含在c端处用人igg1的fc部分表达的sars‑cov‑2纤突蛋白(氨基酸arg319‑phe541)的受体结合结构域(rbd)部分(sars‑cov‑2rbd‑hfc)。实验中使用的人ace2蛋白购自r&d系统公司并由具有c端10x组氨酸标签的氨基酸gln18‑ser740组成(hace2‑his；ncbi登录号q9byf1)。[0438]使用以下程序进行实验。将单克隆抗五‑his抗体(凯杰公司)在pbs中以1μg/ml在4℃下涂覆在96孔微量滴定板上过夜。将hace2‑his受体以0.2μg/ml添加到pbs中并在室温(rt)下结合两小时。随后使用0.5％(w/v)的含bsa的pbs的溶液阻断非特异性结合位点。在其它微量滴定板中，将恒定量的100pm的sars‑cov‑2rbd‑hfc蛋白与抗sars‑cov‑2抗体和同种型igg1抗体对照在pbs 0.5％bsa中以0.0008nm到50nm的稀释度结合。温育一小时后，将混合物溶液转移到微量滴定板涂覆的hace2‑his。在室温下温育1.5小时后，将孔洗涤，并用与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗人igg抗体(杰克森)检测板结合的sars‑cov2。然后根据制造商的建议使用tmb底物溶液(bd生物科学公司，#555214)对板进行显影，并在victorx5读板仪上测量450nm处的吸光度。[0439]使用prismtm软件(graphpad)内的s形剂量应答模型分析结合数据。计算出的ic50值被定义为阻断50％的sars‑cov‑2rbd‑hfc与板涂覆的hace2‑his结合所需的抗体浓度，将其用作阻断效力的指标。阻断百分比是基于使用这个公式测试的最高抗体浓度下观察到的背景校正结合信号定义的，并且针对所有测试的抗体进行了报告：[0440][0441]在最高测试浓度下阻断小于或等于50％的结合的抗体被分类为非阻断剂，并且未报告那些抗体的ic50值。[0442]使用阻断elisa评估抗sars‑cov‑2抗体阻断sars‑cov‑2rbd与人ace2结合的能力。在这个测定中，用各种浓度的抗sars‑cov‑2‑s抗体滴定100pmsars‑cov‑2rbd‑hfc，并且评估了抗体的存在对rbd与hace2‑his结合的抑制。用hrp缀合的抗‑hfc抗体检测板结合的rbd‑hfc。[0443]抗sars‑cov‑2‑s抗体在最高测试浓度下的阻断ic50和最大阻断汇总于表33中，并且阻断曲线在图1‑8中示出。在所测试的46种抗体中，44种抗体显示出对rbd.hfc与hace‑2结合的抗体浓度依赖性阻断。在最高测试抗体浓度下，ic50值的范围为41pm到4.5nm，并且最大阻断范围为55％到约100％。在所测试的46种抗体中，两种抗体在测定条件下未示出阻断活性。如所期望的，无关的同种型对照抗体未示出阻断活性。[0444]表33：抗sar‑cov‑2抗体对纤突rbd‑hfc与固定的人ace‑2结合的阻断效力[0445][0446][0447]注意：将100pm的rbd‑hfc用抗sars‑cov‑2‑s抗体以从50nm开始的系列稀释度滴定，并将rbd‑hfc结合在具有10x组氨酸标签的固定的hace2上，并用hrp缀合的抗hfc抗体进行检测。nbd；未检测到阻断。[0448]实例15：mab10987、mab10989、mab10933和mab10934之间的交叉竞争[0449]在交叉竞争结合测定中检查了mab10987、mab10989、mab10933和mab10934(图11)，从而鉴定出几对具有皮摩尔中和效力的非竞争性mab，其可能潜在地组合以形成抗体混合物，例如mab10987和mab0933。[0450]抗sars‑cov‑2‑smab的表位分箱使用具有10mmhepes、150mmnacl、0.05％(v/v)吐温‑20、ph7.4、1mg/mlbsa的运行缓冲液的富迪(fortebio)octethtx生物层干涉仪(富迪生物分子装置公司(moleculardevicesfortebiollc)，加利福尼亚州菲蒙)以预混合夹心形式进行，所述预混合夹心形式涉及mab以成对组合方式相互竞争与sars‑cov‑2rbd‑mmh蛋白结合。在30℃下以1000rpm连续搅拌进行测定。在运行缓冲液中获得初始基线后，将20μg/ml的抗covid19mab捕获到抗人fc(ahc)生物传感器尖端上持续300秒。为了阻断ahc生物传感器尖端上剩余的游离不饱和结合位点，将所有传感器暴露于含有100μg/ml无关igg1的阻断溶液持续240秒。这个过程之后，将生物传感器浸入含有100nmsarscov‑2rbd‑mmh蛋白和600nm的第二mab的抗covid19mab结合位点的预混合溶液的孔中持续300秒。记录每个步骤处的结合应答，并通过将自阻断mab竞争性对照从数据集中减去来使特定信号归一化。用使用表位分箱的octet数据分析ht10.0软件进行数据分析。[0451]将交叉竞争结合测定与上文所描述的hdx‑ms结果进行比较深入了解了非竞争性抗体对可以同时结合rbd并且可以因此成为治疗性抗体混合物的理想配体的机制。mab10987和mab10933表示此类抗体对。mab10933靶向ace2界面的一个边缘上的纤突状环区。在所述区内，显示出最显著受mab10933hdx保护的残基面朝上，这表明mab10933的fab区从顶部方向与rbd结合，其中mab10933将与ace2发生显著碰撞。为了避免与mab10933竞争，mab10987仅从正面或左下侧(在图12中的mab10987的前视图中)与hdx定义的受保护区结合。这与上文所描述的中和数据一致，因为mab10987会将其定向成处于极有可能干扰ace2的位置。[0452]实例16：抗体结合的纤突蛋白的结构测定[0453]为了更好地了解mab10933和mab10987与纤突蛋白rbd的结合，通过低温电子显微镜(cryoem)进行了结构分析。使用fabalactica试剂盒(genovis)分离mab10933和mab10987的fab片段。将600μg的mab10933fab和600μg的mab10987fab与300μg的sars‑cov‑2‑srbd混合并在冰上温育～1小时，然后注射到平衡到50mmtrisph7.5、150mmnacl的superdex200增加凝胶过滤柱中。收集含有mab10933fab‑mab10987fab‑rbd复合物的峰级分，并将其使用10kdamwco离心过滤器浓缩。对于cryoem网格制备，将蛋白质样品稀释到1.5mg/ml，并添加0.15％pmal‑c8amphipol。将3.5μl的蛋白质沉积到刚用等离子体清洁的ultraufoil网格(1.2/1.3，300目)上。使用滤纸将多余溶液吸干，并使用vitrobotmarkiv将其速冻成液态乙烷。将cryoem网格转移到配备有k3检测器(加坦公司(gatan))的titankrios(赛默飞世尔公司)。使用epu(赛默飞世尔公司)以对应于的像素大小的105,000倍的放大率收集影片。使用每秒每像素15个电子的剂量速率，并且每个影片为2秒，对应于每个电子的总剂量。[0454]所有cryoem数据处理均使用cryosparcv2.14.2进行。使用补丁运动校正和补丁ctf估计将2,821个影片对齐。基于估计的散焦值和ctf拟合分辨率，选择2,197张对齐的显微照片进行进一步处理。使用斑点拾取器拾取的一组初始颗粒经过2d分类以生成用于模板拾取的模板。通过模板拾取而拾取的989,553个颗粒经过多轮2d分类以去除未结合的fab和含有不完整复合物的颗粒。从头进行三类重建产生含有对应于mab10933fab‑mab10987fab‑rbd复合物的61,707个颗粒的单个类别。这个类别中的颗粒的异质性细化、然后非均匀细化导致含有用于模型构建的含有48,140个颗粒的分辨率(fsc＝0.143)图。将rbd(获取自pdb代码6m17)和两个fab(获取自先前的抗体结构，除来自pdb代码5u15的mab10987的λ轻链之外)的模型手动放置到这个图中。然后使用coot手动重建这些模型，并使用phenix根据图对实际空间进行细化。[0455]确认上文所描述的数据后，sars‑cov‑2纤突rbd与mab10933和mab10987的fab片段结合的复合物的单颗粒cryoem示出了这个混合物中的两种抗体可以与rbd的不同区同时结合(图13a、图13b和图14)。复合物的标称分辨率为的3d重构图示出了两个fab片段在rbd的不同表位处结合，从而证实其是非竞争性抗体。mab10933在rbd的顶部结合，从而与ace2的结合位点广泛重叠。另一方面，mab10987的表位位于rbd的一侧，充分远离mab10933表位，并且与ace2结合位点几乎没有重叠。[0456]实例17：抗sars‑cov‑2‑smab之间的交叉竞争[0457]在octethtx生物传感器平台(颇尔富迪生物公司)上使用实时、无标记生物层干涉(bli)测定来测定抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体(mab)之间的结合竞争。实验是在板以1000rpm的速度摇动的情况下在25℃下在10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、1mg/mlbsa、ph为7.4的(hbs‑ebt)缓冲液中进行的。为了评估两种mab是否能够彼此竞争与用c端myc‑myc‑六组氨酸表达的sars‑cov‑2‑srbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mmh)上的其相应的表位结合，首先通过将生物传感器尖端浸没在含有10μg/mlsars‑cov‑2‑srbd‑mmh溶液的孔中1分钟将约～0.51nm的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh捕获到抗penta‑his抗体涂覆的octet生物传感器尖端(富迪生物公司，#18‑5122)上。然后通过浸入含有50μg/mlmab‑1溶液的孔中5分钟用第一种抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体(随后称为mab‑1)使sars‑cov‑2‑srbd‑mmh捕获的生物传感器尖端饱和。然后将生物传感器尖端浸入含有50μg/ml第二种抗sars‑cov‑2单克隆抗体(随后称为mab‑2)溶液的孔中5分钟。在实验的每一步之间将生物传感器的尖端在hbs‑etb缓冲液中清洗。在整个实验过程中对实时结合反应进行监测，并记录每个步骤结束时的结合反应。比较了mab‑2与预先与mab‑1复合的sars‑cov‑2rbd‑mmh的结合的应答，并测定了不同抗sars‑cov‑2单克隆抗体的竞争/非竞争行为，如表34中所示出的。[0458]表34：抗sars‑cov‑2‑s抗体之间的交叉竞争[0459][0460][0461][0462][0463][0464][0465][0466][0467][0468][0469][0470][0471][0472][0473][0474][0475][0476][0477][0478][0479][0480][0481][0482][0483][0484][0485][0486][0487][0488][0489][0490][0491]实例18：在37℃下测量的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与单体sars‑cov‑2‑srbd试剂结合的ph敏感性[0492]使用基于实时表面等离振子共振(spr)的biacoret200生物传感器测定ph7.4、ph6.0和ph5.0的缓冲液中的不同的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体的解离速率常数(kd)。所有结合研究均在37℃下使用三种运行缓冲液进行，(i)pbs、0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph7.4(pbs‑t‑ph7.4)，(ii)pbs、0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph6.0(pbs‑t‑ph6.0)和(iii)pbs、0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph5.0(pbs‑t‑ph5.0)。首先将biacorecm5传感器芯片表面通过与小鼠抗人fc特异性mab(再生元公司)进行胺偶联来衍来生化以捕获抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体。对用c端myc‑myc‑六组氨酸表达的人sars‑cov‑2‑srbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mmh)进行结合研究。将在pbs‑t‑ph7.4缓冲液中制备的单一浓度的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh(90nm)以25微升/分钟的流动速率注射3分钟，然后将结合的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh在pbs‑t‑ph7.4、pbs‑t‑ph6.0或pbs‑tpbs‑t‑ph5.0运行缓冲液中解离5分钟。[0493]四种ph运行缓冲液中的解离速率常数(kd)通过使用scrubber2.0c曲线拟合软件将实时结合传感图拟合到1:1结合模型来确定。根据kd值计算出解离半衰期(t1/2)为：[0494][0495]表35中示出了在pbs‑t‑ph7.4中与不同的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体结合、然后在37℃下在pbs‑t‑ph7.4和pbs‑t‑ph6.0中解离的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh的kd值和t1/2值。表36中示出了在pbs‑t‑ph7.4中与不同的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体结合、然后在37℃下在pbs‑t‑ph7.4和pbs‑t‑ph5.0中解离的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh的kd值和t1/2值。对ph7.4、ph6.0和ph5.0的缓冲液的sars‑cov‑2rbd‑mmh的解离半衰期(t1/2)的比较。[0496]表35：sars‑cov‑2‑srbd‑mmh与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在pbs‑t‑ph7.4缓冲液中的结合和在37℃在pbs‑t‑ph7.4和ph6.0缓冲液中的解离。[0497][0498][0499]表36：sars‑cov‑2‑srbd‑mmh与抗sars‑cov‑2单克隆抗体在pbs‑t‑ph7.4缓冲液中的结合和在37℃在pbs‑t‑ph7.4和ph5.0缓冲液中的解离。[0500][0501][0502]实例19：抗sars‑cov‑2‑s抗体与病毒样颗粒的结合[0503]为了研究一组抗sars‑cov‑2单克隆抗体结合sars‑cov‑2纤突糖蛋白的能力，开发了在基于电化学发光的检测平台(msd)中使用用sars‑cov‑2纤突蛋白进行假型化的水疱性口炎病毒(vsv)进行体外结合测定。[0504]从hek293t细胞产生假型化水泡性口炎病毒(vsv)病毒样颗粒(vlp)以瞬时表达sars‑cov‑2纤突蛋白(登录号mn908947.3，氨基酸16‑1211)。也产生仅表达vsv的vlp作为阴性结合对照。[0505]根据以下程序进行实验。将来自上文所描述的两种来源的vlp稀释于pbs中，接种到96孔碳电极板(多阵列高结合板，msd)中，并在4℃下温育过夜，以允许vlp粘附。将非特异性结合位点在室温下用含2％bsa(w/v)的pbs阻断1小时。向板结合的颗粒一式两份地添加稀释于浓度范围为0.0008nm到50nm的pbs 0.5％bsa中的抗sars‑cov‑2抗体和非结合人igg1对照以及无抗体的缓冲液，并将板在室温下摇动温育1小时。然后使用aquamax2000洗板机(mds分析技术公司)将板用1xpbs洗涤以去除未结合的抗体。在室温下用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)对板结合的抗体进行1小时的检测。洗涤后，根据制造商建议的程序用读取缓冲液(msd)对板进行显影，并用sector成像仪600(mesoscaledevelopment)仪器记录发光信号。捕获表达sars‑cov‑2的vlp和仅vsv的vlp的直接结合信号(在rlu中)。[0506]使用免疫结合测定评估抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与表达sars‑cov‑2‑s的vlp的结合相较于与无关的表达vsv的vlp结合的能力。用一系列抗体稀释液进行与96孔高结合板(msd)上的固定的vlp的结合，并使用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg检测结合的抗体。将来自电化学发光的结合信号记录在sector成像仪600(msd)上。测定抗体与vlp的结合的rlu值。所有抗体均显示出浓度依赖性结合，并在5.5nm和0.20nm下对表达sars‑cov‑2‑s的vlp上的结合与仅vsv上的结合的比率进行分析。[0507]两种浓度下的抗sars‑cov‑2‑smab与vsv/纤突和仅vsv的vlp的结合结果汇总于表37中。在所测试的46种抗体中，44种抗体在任一浓度下以相对于vsv为3或更高的比率与vsv/纤突特异性结合。在0.2nm抗体下，vsv/纤突与vsv的比率的范围为3到56，并且在5nm下，比率的范围为3到303。尽管两种抗体(mab10998和mab11002)显示出与vsv/纤突vlp的结合较弱，相对于vsvvlp的比率小于3，但是5nm下的信号在vsv/纤突上高于vsv。如预期的那样，无关的igg1同种型抗体显示出最小结合。[0508]表37：通过电化学发光，抗sars‑cov‑2‑s抗体与表达纤突蛋白的vsvvlp对vsv结合的特异性[0509][0510][0511]实例20：抗sars‑cov‑2‑s抗体与表达纤突蛋白的细胞的结合[0512]为了研究一组抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与表达sars‑cov‑2‑s的细胞结合的能力，开发了在基于电化学发光的检测平台(msd)中使用表达sars‑cov‑2‑s的细胞进行体外结合测定。[0513]jurkat/tet3g/hcd20/tet‑3g诱导型细胞被工程化成瞬时表达sars‑cov‑2纤突蛋白(登录号mn908947.3，氨基酸16‑1211，jurkat/tet3g/hcd20/tet‑on3g诱导型covid‑19纤突蛋白高分选的)并被流式细胞术分选以选择sars‑cov‑2蛋白的高表达。实验中还包含亲本jurkat/tet3g/hcd20/tet‑3g作为阴性结合对照。[0514]根据以下程序进行实验。在收获前将来自上文所描述的两个系的细胞在37℃下用1μg/ml强力霉素诱导36小时，向下旋转，用pbs洗涤，然后在pbs中稀释，接种到96孔碳电极板(多阵列高结合板，msd)中，并在4℃下温育过夜，以允许细胞粘附。将非特异性结合位点在室温下用含2％bsa(w/v)的pbs阻断一小时。向板结合的细胞一式两份地添加稀释于浓度范围为0.0008nm到50nm的pbs 0.5％bsa中的抗sars‑cov‑2抗体和非结合人igg1对照以及无抗体的缓冲液，并将板在室温下摇动温育一小时。然后使用aquamax2000洗板机(mds分析技术公司)将板用1xpbs洗涤以去除未结合的抗体。在室温下用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)对板结合的抗体进行一小时的检测。洗涤后，根据制造商建议的程序用读取缓冲液(msd)对板进行显影，并用sector成像仪600(mesoscaledevelopment)仪器记录发光信号。捕获表达sars‑cov‑2‑s的细胞和阴性对照细胞系的直接结合信号(在rlu中)。[0515]使用免疫结合测定评估抗sars‑cov‑2单克隆抗体与表达sars‑cov‑2纤突蛋白的细胞的结合相较于与亲本细胞结合的能力。用一系列抗体稀释液进行与96孔高结合板(msd)上的固定的细胞的结合，并使用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg检测结合的抗体。将来自电化学发光的结合信号记录在sector成像仪600(msd)上。所有抗体均显示出浓度依赖性结合，并在5.5nm和0.20nm的浓度下对表达纤突的细胞上的结合与亲本细胞上的结合的比率进行分析。[0516]抗sars‑cov‑2‑smab在两种浓度下与表达纤突蛋白的细胞和亲本jurkat细胞的结合结果汇总于表38中。在所测试的46种抗体中，44种抗体在任一浓度下以相对于亲本细胞为4或更高的比率与jurkat/纤突细胞(jurkat/tet3g/hcd20/tet‑on3g诱导型sars‑cov‑2纤突蛋白高分选的细胞)特异性结合。在0.2nm下，jurkat/纤突细胞与亲本细胞上的结合信号的比率的范围为4到36，并且在5nm下，比率的范围为4到63。尽管两种抗体(mab10998和mab11002)显示出与jurkat/纤突细胞的结合较弱，相对于亲本细胞的结合比率小于4，但是在5nm下，jurket/纤突上的结合信号高于亲本细胞上的结合信号。如预期的那样，无关的igg1同种型抗体显示出最小结合。[0517]表38：通过电化学发光，抗sars‑cov‑2‑s抗体与表达纤突蛋白的jurkat细胞对亲本细胞的结合的特异性[0518][0519][0520][0521]*****************[0522]本文引用的所有参考文献均通过引用并入，达到如同每个单独的出版物、数据库条目(例如，genbank序列或geneid条目)、专利申请或专利被专门且单独地指示通过引用并入的相同程度。申请人意图通过引用将这一并入声明与每一个单独的出版物、数据库条目(例如，genbank序列或geneid条目)、专利申请或所标识的专利相关联，即使这样的引用不直接与通过引用并入的专用声明相邻。在说明书中包含通过引用并入的专有说明(如果有的话)并不以任何方式削弱通过引用并入的一般性声明。本文引用参考文献并非旨在承认所述参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：3.本发明涉及与冠状病毒纤突蛋白特异性结合的抗体和抗原结合片段以及用于用所述抗体和片段治疗或预防冠状病毒感染的方法。
背景技术：
：：4.新鉴定的病毒(如冠状病毒)因其没有被充分表征而可能难以治疗。这些新鉴定的病毒的出现突出了对开发新型抗病毒策略的需要。严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars‑cov‑2)是引起严重急性呼吸疾病covid‑19的新出现的冠状病毒。截止2020年3月20日，世界卫生组织(worldhealthorganization)已经报告在168个国家、地区或区域中有209,839例确诊病例，导致8,778例死亡。covid‑19的临床特征包含发烧、干咳和疲劳，并且疾病可能会导致呼吸衰竭，从而导致死亡。5.迄今为止，还没有用于预防或治疗sars‑cov‑2感染的疫苗或治疗剂。鉴于对人类健康的持续威胁，迫切需要用于sars‑cov‑2控制的预防性和治疗性抗病毒疗法。因为这种病毒使用其纤突糖蛋白与细胞受体ace2和丝氨酸蛋白酶tmprss2相互作用以进入靶细胞中，所以这种纤突蛋白表示抗体治疗的有吸引力的靶标。具体地，以高亲和力与sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)特异性结合并抑制病毒感染性的完全人抗体在预防和治疗covid‑19中可能是重要的。技术实现要素：6.需要中和治疗性抗sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)抗体和其用于治疗或预防病毒感染的用途。本公开部分地通过提供人抗sars‑cov‑2‑s抗体(如表1的抗体)和其组合(包含例如与其它治疗剂(例如，抗炎剂、抗疟疾剂、抗病毒剂或其它抗体或抗原结合片段)的组合)和使用其以治疗病毒感染的方法来解决这个需要。7.本公开提供了与sars‑cov‑2‑s特异性结合的中和性人抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段。8.一方面，本公开提供了一种分离的重组抗体或其抗原结合片段，其与冠状病毒纤突蛋白(cov‑s)特异性结合，其中所述抗体具有以下特性中的一个或多个：(a)与ec50小于约10‑9m的cov‑s结合；(b)证实在施用于冠状病毒感染的动物之后，所述冠状病毒感染的动物的存活率与没有进行所述施用的相当的冠状病毒感染的动物相比有所增加；和/或(c)包括包含与表1的hcvr具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内含有的三个重链互补决定区(cdr)(cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3)；以及包含与表1的lcvr具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内含有的三个轻链cdr(cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3)。9.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包括表1的抗体的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3；和/或(b)免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包括表1的抗体的所述cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3。10.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)重链免疫球蛋白可变区，所述重链免疫球蛋白可变区包括与表1的hcvr序列具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和/或(b)轻链免疫球蛋白可变区，所述轻链免疫球蛋白可变区包括与表1的lcvr序列具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。11.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括表1的单抗体的cdr‑h1、cdr‑h2、cdr‑h3、cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括表1的单抗体的hcvr和lcvr。12.一方面，本公开提供了一种抗原结合蛋白，其与上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段中的任何抗体或抗原结合片段竞争与cov‑s结合。13.一方面，本公开提供了一种抗原结合蛋白，其与和cov‑s相同的表位或与所述cov‑s上的重叠表位结合作为上文或本文所讨论的任何抗体或抗原结合片段。14.在各个实施例中的任何实施例中，所述抗体或抗原结合片段可以是多特异性的。15.在各个实施例中的任何实施例中，所述抗体或抗原结合片段可以包括以下性质中的一个或多个：a)抑制冠状病毒生长；b)与冠状病毒的表面结合；c)限制细胞的冠状病毒感染在体外传播；以及d)保护被工程化成表达人ace2或tmprss2蛋白的小鼠免于冠状病毒感染所引起的死亡和/或体重减轻。16.在各个实施例中的任何实施例中，cov‑s是sars‑cov‑2‑s。17.在一方面，本公开提供了一种包括如上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段的复合物，所述复合物与cov‑s多肽结合。在一些实施例中，所述cov‑s是sars‑cov‑2‑s。18.一方面，本公开提供了一种用于制备如上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：(a)将对所述抗体或抗原结合片段进行编码的一个或多个多核苷酸引入到宿主细胞中；(b)在有利于表达所述一个或多个多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞；以及(c)任选地从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长于的培养基中分离所述抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。19.在一方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，其是上文所讨论的方法的产物。20.一方面，本公开提供了一种多肽，其包括：(a)包括表1中所示的hcvr氨基酸序列的抗体或抗原结合片段的hcvr结构域的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3；或(b)包括表1中所示的lcvr氨基酸序列的免疫球蛋白链的lcvr结构域的cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3。21.一方面，本公开提供了一种多核苷酸，其对上文所讨论的多肽进行编码。22.一方面，本公开提供了一种载体，其包括上文所讨论的多核苷酸。23.一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包括如上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段或多肽或多核苷酸或载体。24.一方面，本公开提供了一种组合物或试剂盒，其包括上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段与另外的治疗剂的组合。25.一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括上文或本文所讨论的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体以及任选地另外的治疗剂。在一些实施例中，所述另外的治疗剂是抗病毒药或疫苗。在一些实施例中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：抗炎剂、抗疟疾剂、特异性结合tmprss2的抗体或其抗原结合片段以及与cov‑s特异性结合的抗体或抗原结合片段。在一些情况下，所述抗疟疾剂是氯喹或羟化氯喹。在一些情况下，所述抗炎剂是抗体，如萨瑞鲁单抗(sarilumab)、托珠单抗(tocilizumab)或吉西鲁单抗(gimsilumab)。在一些实施例中，所述另外的治疗剂是包括表1的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列的第二抗体或抗原结合片段。26.在一方面，本公开提供了一种器皿或注射装置，其包括如上文或本文所讨论的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段或组合物。27.一方面，本公开提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的冠状病毒感染的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如上文或本文所讨论的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述冠状病毒选自由sars‑cov‑2、sars‑cov和mers‑cov组成的组。28.在用于治疗或预防冠状病毒感染的方法的一些实施例中，向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些情况下，所述一种或多种另外的治疗剂是抗病毒药或疫苗。在一些情况下，所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：抗炎剂、抗疟疾剂、特异性结合tmprss2的抗体或其抗原结合片段以及与cov‑s特异性结合的抗体或抗原结合片段。在一些情况下，所述抗疟疾剂是氯喹或羟化氯喹。在一些情况下，所述抗炎剂是抗体，例如萨瑞鲁单抗、托珠单抗或吉西鲁单抗。在一些实施例中，所述另外的治疗剂是包括表1的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列的第二抗体或抗原结合片段。用于在本公开的方法的背景下使用的可以单独或彼此组合或与本文所公开的抗体中的一个或多个抗体组合使用的其它抗体包含例如ly‑cov555(礼来公司(elililly))；47d11(wang等人《自然通讯(naturecommunications)》文章编号：2251)；b38、h4、b5和/或h2(wu等人,10.1126/《科学(science).abc2241(2020))；sti‑1499(索伦托医疗公司(sorrentotherapeutics))；vir‑7831和vir‑7832(病毒生物医疗公司(virbiotherapeutics))。29.一方面，本公开提供了一种向受试者体内施用上文或本文所讨论的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将所述抗体或抗原结合片段注射到所述受试者体内。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段皮下、静脉内或肌内注射到所述受试者体内。30.在上文或本文所讨论的各个实施例中的任何实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括vh3‑66或vk1‑33可变结构域序列。31.一方面，本公开提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白，其中所述分离的抗体或抗原结合片段包括包含seqidno:202中所示的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内含有的三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)以及包含seqidno:210中所示的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内含有的三个轻链互补决定区(cdr)(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。32.在一些实施例中，所述hcdr1包括seqidno:204中所示的氨基酸序列，所述hcdr2包括seqidno:206中所示的氨基酸序列，所述hcdr3包括seqidno:208中所示的氨基酸no:654中所示的氨基酸序列，所述轻链包括seqidno:656中所示的氨基酸序列。38.一方面，本公开提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白，其中所述分离的抗体或抗原结合片段包括包含seqidno:640中所示的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内含有的三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)以及包含seqidno:646中所示的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内含有的三个轻链互补决定区(cdr)(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。39.在一些实施例中，所述hcdr1包括seqidno:642中所示的氨基酸序列，所述hcdr2包括seqidno:499中所示的氨基酸序列，所述hcdr3包括seqidno:644中所示的氨基酸序列，所述lcdr1包括seqidno:648中所示的氨基酸序列，所述lcdr2包括seqidno:650中所示的氨基酸序列，并且所述lcdr3包括seqidno:652中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括hcvr，所述hcvr包括seqidno:640中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括lcvr，所述lcvr包括seqidno：646中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括hcvr和lcvr，所述hcvr包括seqidno:640中所示的氨基酸序列，所述lcvr包括seqidno:646中所示的氨基酸序列。40.一方面，本公开提供了一种分离的抗体，其结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白，其中所述分离的抗体包括免疫球蛋白恒定区、包含seqidno:640中所示的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)内含有的三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)以及包含seqidno:646中所示的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)内含有的三个轻链互补决定区(cdr)(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。41.在一些实施例中，所述hcdr1包括seqidno:642中所示的氨基酸序列，所述hcdr2包括seqidno:499中所示的氨基酸序列，所述hcdr3包括seqidno:644中所示的氨基酸序列，所述lcdr1包括seqidno:648中所示的氨基酸序列，所述lcdr2包括seqidno:650中所示的氨基酸序列，并且所述lcdr3包括seqidno:652中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体包括hcvr和lcvr，所述hcvr包括seqidno:640中所示的氨基酸序列，所述lcvr包括seqidno:646中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述分离的抗体包括：重链和轻链，所述重链包括seqidno:654中所示的氨基酸序列，所述轻链包括seqidno:656中所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述免疫球蛋白恒定区是igg1恒定区。在一些情况下，所述分离的抗体是重组抗体。在一些情况下，所述分离的抗体是多特异性的。42.一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括如上文或本文所讨论的分离的抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。43.在一些实施例中，所述药物组合物进一步包括第二治疗剂。在一些情况下，所述第二治疗剂选自由以下组成的组：结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白的第二抗体或其抗原结合片段、抗炎剂、抗疟疾剂以及结合tmprss2的抗体或其抗原结合片段。44.在一些实施例中，所述第二治疗剂是结合包括seqidno:832中所示的氨基酸序列的sars‑cov‑2纤突蛋白的第二抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，所述第二抗体或其抗原结合片段包括包含seqidno:202中所示的氨基酸序列的hcvr内含有的三个重链cdr(hcdr1、hcdr2和hcdr3)以及包含seqidno:210中所示的氨基酸序列的lcvr内含有的三个轻链cdr(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。在一些情况下，所述第二抗体或其抗原结合片段包括：hcdr1，所述hcdr1包括seqidno:204中所示的氨基酸序列；hcdr2，所述hcdr2包括seqidno:206中所示的氨基酸序列；hcdr3，所述hcdr3包括seqidno:208中所示的氨基酸序列；lcdr1，所述lcdr1包括seqidno:212中所示的氨基酸序列；lcdr2，所述lcdr2包括seqidno:55中所示的氨基酸序列；以及lcdr3，所述lcdr3包括seqidno:214中所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第二抗体或其抗原结合片段包括hcvr和lcvr，所述hcvr包括seqidno:202中所示的氨基酸序列，所述lcvr包括seqidno:210中所示的氨基酸序列。在一些情况下，所述第二抗体或其抗原结合片段包括重链和轻链，所述重链包括seqidno:216中所示的氨基酸序列，所述轻链包括seqidno:218中所示的氨基酸序列。45.在各个实施例中，上文或本文所讨论的实施例的特征或组分中的任何特征或组分可以组合，并且此类组合涵盖在本公开的范围内。上文或本文所讨论的任何特定值可以与上文或本文所讨论的另一个相关值组合以列举具有表示范围的上端和下端的值的范围，并且此类范围涵盖在本公开的范围内。附图说明46.图1示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。47.图2示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。48.图3示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。49.图4示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。50.图5示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。51.图6示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。52.图7示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。53.图8示出了防止纤突蛋白与其受体ace2结合的针对sars‑cov‑2纤突蛋白的所选择的抗sars‑cov‑2‑s抗体的elisa阻断数据。54.图9a和图9b显示了小鼠(图9a；n＝185)和恢复期人供体(图9b；n＝68)的针对sars‑cov‑2的分离的中和抗体的成对的重链(x轴)和轻链(y轴)的v基因频率。圆圈的阴影和大小对应于分离的中和抗体的受体中存在的重链和轻链对的数量。在vsv假颗粒中和测定中，中和被定义为在抗体的稀释度为1:4(～2μg/ml)的情况下>70％。55.图10a和图10b显示了中和效力。图10a显示了抗sars‑cov‑2纤突mab的中和效力。将抗纤突mab、igg1同种型对照和重组二聚ace2(hace2.hfc)的连续稀释液与pvsv‑sars‑cov‑2‑s‑mneon一起添加到vero细胞，并在感染后24小时以病毒感染性的读数对mneon表达进行测量。将数据绘制为仅相对于病毒感染对照中和的百分比。图10b显示了单独的抗纤突mab和针对veroe6细胞中的sars‑cov‑2‑s病毒的mab的组合的中和效力。56.图11显示了根据针对不同的抗sars‑cov‑2mab的预混合结合测定的矩阵进行的表位箱(bin)分析。针对如所描述的九个抗sars‑cov‑2mab进行表位分箱(binning)。每个图有三个阶段(i、ii和iii)。在阶段i中，将抗sars‑cov‑2mab(20ug/ml)装载到抗人fc探针。在阶段ii中，人igg1阻断mab溶液(100ug/ml)。在阶段iii中，每个600nm抗sars‑cov‑2mab结合位点的100nmsarscov‑2rbd‑mmh预混合复合物的溶液流动经过mab捕获探针。57.图12显示了纤突蛋白rbd结构域的结构的3d表面模型，其示出了ace2界面和hdx‑ms表位映射结果。用表示如通过hdx‑ms实验测定的保护程度的阴影来指示受抗sars‑cov2纤突抗体保护的rbd残基。根据pdb6m17重现rbd结构。58.图13a和图13b显示了mab10933和mab10987与sars‑cov‑2rbd的复合物。图13a显示了mab10933 rbd mab10987复合物的cryoem图，根据图13b的细化模型中的链对其进行阴影描绘。鉴定了rbd、mab10933重链和轻链以及mab10987重链和轻链。59.图14显示了cryoem数据统计。报告了针对图13a和图13b中所示出的mab10987 mab10933 sars‑cov‑2rbd复合物结构的数据收集和细化统计。具体实施方式60.在描述本发明方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。61.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文所提到的所有出版物均通过全文引用的方式并入本文中。62.术语“冠状病毒”或“cov”是指冠状病毒家族的任何病毒，包含但不限于sars‑cov‑2、mers‑cov和sars‑cov。sars‑cov‑2是指被鉴定为新出现的冠状病毒。sars‑cov‑2也被称为2019‑ncov。其通过病毒纤突蛋白与人宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合。纤突蛋白还与活化纤突蛋白以对病毒进行膜融合的tmprss2结合并由其切割。63.术语“cov‑s”(也被称为“s”或“s蛋白”)是指冠状病毒的纤突蛋白，并且可以是指特异性s蛋白，如sars‑cov‑2‑s、mers‑covs和sars‑covs。sars‑cov‑2纤突蛋白是组装成构成包膜冠状病毒颗粒的表面上的纤突或膜粒的三聚体的1273氨基酸类型i膜糖蛋白。蛋白质具有归因于s蛋白的n端(s1)部分和c端(s2)部分的两个重要功能：宿主受体结合和膜融合。cov‑s通过s1亚基中存在的受体结合结构域(rbd)与其同源受体结合。全长sars‑cov‑2纤突蛋白的氨基酸序列通过seqidno:832中提供的氨基酸序列来例示。术语“cov‑s”包含从不同的cov分离物分离的cov纤突蛋白的蛋白质变体以及重组cov纤突蛋白或其片段。所述术语还涵盖与例如组氨酸标签、小鼠或人fc或单个序列(ror1)偶联的cov纤突蛋白或其片段。64.如本文所使用的，术语“冠状病毒感染”或“cov感染”是指感染冠状病毒，如sars‑cov‑2、mers‑cov或sars‑cov。所述术语包含通常在下呼吸道中的冠状病毒呼吸道感染。症状可以包含高烧、干咳、呼吸短促、肺炎、胃肠道症状(如腹泻)、器官衰竭(肾衰竭和肾功能障碍)、脓毒性休克和严重病例的死亡。65.病毒66.本发明包含用于治疗或预防受试者的病毒感染的方法。术语“病毒”包含其在受试者体内的感染可通过施用抗cov‑s抗体或其抗原结合片段来治疗或预防的任何病毒(例如，其中病毒的感染性至少部分地依赖于cov‑s)。在本发明的实施例中，“病毒”是表达纤突蛋白(例如，cov‑s)的任何病毒。术语“病毒”还包含cov‑s依赖性呼吸道病毒，其是使受试者的呼吸组织(例如，上和/或下呼吸道、气管、细支气管、肺)感染并且可通过施用抗cov‑s抗体或其抗原结合片段治疗或预防的病毒。例如，在本发明的实施例中，病毒包含冠状病毒、sars‑cov‑2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)、sars‑cov(严重急性呼吸综合征冠状病毒)和mers‑cov(中东呼吸综合征(mers)冠状病毒)。冠状病毒可以包含α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒的属。在一些实施例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段可以与α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和/或δ冠状病毒结合和/或中和所述α冠状病毒、所述β冠状病毒、所述γ冠状病毒和/或所述δ冠状病毒。在某些实施例中，这种结合和/或中和可以对特定冠状病毒属或对属的特定亚群具有特异性。“病毒感染”是指病毒在受试者体内的侵袭和繁殖。67.冠状病毒是球形的，其直径为大约125nm。冠状病毒最显著的特征是从病毒体的表面产生的棒状纤突突出。这些纤突是病毒体的定义性特征并且给予其日冕的外观，这促使其具有冠状病毒这一名称。在病毒体的包膜内的是核衣壳。冠状病毒具有螺旋对称的核衣壳，这在正义rna病毒之间是不常见的，但对于负义rna病毒而言是更加常见的。sars‑cov‑2、mers‑cov和sars‑cov属于冠状病毒家族。病毒体到宿主细胞的初始附着是通过s蛋白与其受体之间的相互作用而引发的。受体结合结构域(rbd)在冠状病毒s蛋白的s1区内的位点取决于病毒而变化，其中一些病毒的rbd在s1的c端处。s蛋白/受体相互作用是冠状病毒使宿主物种感染的主要决定因素并且还控制病毒的组织向性。许多冠状病毒将肽酶用作其细胞受体。受体结合后，病毒接下来必须获得进入宿主细胞细胞质的途径。这通常通过组织蛋白酶、tmprrs2或另一种蛋白酶对s蛋白进行酸依赖性蛋白切割、然后将病毒和细胞膜融合来完成。68.抗cov‑s抗体和抗原结合片段69.本发明提供了与cov纤突蛋白或其抗原片段特异性结合的抗原结合蛋白，如抗体和其抗原结合片段。70.如本文所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其包括四个多肽链、通过二硫键(即，“全抗体分子”)互连的两个重链(hc)和两个轻链(lc)及其多聚体(例如，igm)。示例性抗体包含例如表1中所列的抗体。每个重链包括重链可变区(“hcvr”或“vh”)和重链恒定区(包含结构域ch1、ch2和ch3)。每个轻链包含轻链可变区(“lcvr”或“vl”)和轻链恒定区(cl)。vh区和vl区可以被进一步细分成被称作互补决定区(cdr)的高变区，其间散布着更保守的被称作构架区(fr)的区。每个vh和vl包括从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链cdr也可以被称作hcdr或cdr‑h，并且如上文所描述的进行编号(例如，hcdr1、hcdr2和hcdr3或cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3)。同样，轻链cdr可以被称作lcdr或cdr‑l，并编号lcdr1、lcdr2和lcdr3或cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3。在本发明的某些实施例中，抗体(或其抗原结合片段)的fr与人种系序列相同，或者是天然或人工修饰的。示例性人种系序列包含但不限于vh3‑66和vk1‑33。因此，本公开提供了抗cov‑s抗体或其抗原结合片段(例如，抗sars‑cov‑2‑s抗体或其抗原结合片段)，其包括vh3‑66或vk1‑33可变重链或轻链区内的表1的hcdr和lcdr序列。本公开进一步提供了抗cov‑s抗体或其抗原结合片段(例如，抗sars‑cov‑2‑s抗体或其抗原结合片段)，其包括选自igkv4‑1、igkv1‑5、igkv1‑9、igkv1‑12、igkv3‑15、igkv1‑16、igkv1‑17、igkv3‑20、iglv3‑21、igkv2‑24、igkv1‑33、igkv1‑39、iglv1‑40、iglv1‑44、iglv1‑51、iglv3‑1、igkv1‑6、iglv2‑8、igkv3‑11、iglv2‑11、iglv2‑14、iglv2‑23或iglv6‑57的轻链和选自ighv1‑69、ighv3‑64、ighv4‑59、ighv3‑53、ighv3‑48、ighv4‑34、ighv3‑33、ighv3‑30、ighv3‑23、ighv3‑20、ighv1‑18、ighv3‑15、ighv3‑11、ighv3‑9、ighv1‑8、ighv3‑7、ighv2‑5、ighv1‑2、ighv2‑70、ighv3‑66、ighv5‑51、ighv1‑46、ighv4‑39、ighv4‑31、ighv3‑30‑3、ighv2‑26或ighv7‑4‑1的重链的组合内的表1的hcdr和lcdr序列。本公开进一步提供了抗cov‑s抗体或其抗原结合片段(例如，抗sars‑cov‑2‑s抗体或其抗原结合片段)，其包括选自igkv4‑1、igkv1‑5、igkv1‑9、igkv1‑12、igkv3‑15、igkv1‑16、igkv1‑17、igkv3‑20、iglv3‑21、igkv2‑24、igkv1‑33、igkv1‑39、iglv1‑40、iglv1‑44、iglv1‑51、iglv3‑1、igkv1‑6、iglv2‑8、igkv3‑11、iglv2‑11、iglv2‑14、iglv2‑23或iglv6‑57的轻链和选自ighv1‑69、ighv3‑64、ighv4‑59、ighv3‑53、ighv3‑48、ighv4‑34、ighv3‑33、ighv3‑30、ighv3‑23、ighv3‑20、ighv1‑18、ighv3‑15、ighv3‑11、ighv3‑9、ighv1‑8、ighv3‑7、ighv2‑5、ighv1‑2、ighv2‑70、ighv3‑66、ighv5‑51、ighv1‑46、ighv4‑39、ighv4‑31、ighv3‑30‑3、ighv2‑26或ighv7‑4‑1的重链的组合内的表1的hcvr和lcvr序列。71.通常，重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链两者的可变结构域包括三个高变区(也称为互补决定区(cdr))，其位于相对保守的构架区(fr)内。通常，从n端到c端，轻链可变结构域和重链可变结构域两者包括fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。在本发明的实施例中，将氨基酸分配给每个结构域是根据以下文献中的定义进行的：《免疫学目的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》,kabat等人；国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth),贝塞斯达,马里兰州；第5版；nih出版第91‑3242号(1991)；kabat(1978)《先进蛋白质化学(adv.prot.chem.)》,32:1‑75；kabat等人,(1977),《生物化学杂志(j.biol.chem.)》,252:6609‑6616；chothia等人,《分子生物学杂志(jmol.biol.)》(1987),196:901‑917或chothia等人,(1989),《自然》,342:878‑883。72.本发明包含单克隆抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)以及包括多个分离的单克隆抗原结合蛋白的单克隆组合物。如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体的群，即，除可以少量存在的可能的天然存在的突变之外，包括所述群的抗体分子的氨基酸序列相同。此类单克隆抗体和片段在组合物中的“多个”是指相同(即，如上文所讨论的，除可以少量存在的可能的天然存在的突变之外，氨基酸序列相同)的抗体和片段的浓度，所述浓度高于自然界中正常存在(例如，在如小鼠或人的宿主生物体的血液中)的浓度。73.在本发明的实施例中，抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)包括例如iga型(例如，iga1或iga2)、igd型、ige型、igg型(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)或igm型的重链恒定结构域。在本发明的实施例中，抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)包括例如κ型或λ型的轻链恒定结构域。74.如本文所使用的，术语“人”抗原结合蛋白(如抗体)包含具有衍生自人细胞中或移植到非人细胞(例如，小鼠细胞)中的人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。参见例如，us8502018、us6596541或us5789215。本发明的人mab可以包含并非由例如cdr(并且具体地，cdr3)中的人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不旨在包含其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系的cdr序列已经移植到人fr序列上的mab。所述术语包含在非人哺乳动物或非人哺乳动物细胞中重组产生的抗体。所述术语不旨在包含从人类受试者中分离或产生的抗体。参见下文。75.本发明包含抗cov‑s嵌合抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)和其使用方法。如本文所使用的，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。(us4816567；以及morrison等人,(1984),《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》,81:6851‑6855)。76.本发明包含抗cov‑s杂交抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)和其使用方法。如本文所使用的，“杂交抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种，或者其中可变结构域而不是恒定区来自第一物种。例如，可变结构域可以从从人分离的且用未从所述抗体分离的固定恒定区表达抗体中获取。在实例1中对示例性杂交抗体进行了描述，其是指分别克隆到含有重恒定区和轻恒定区的表达载体中的抗体重链可变区和轻链可变区衍生的pcr产物。因为杂交抗体含有的可变区和恒定区未从单个天然来源分离，所以所述杂交抗体是合成的且非天然存在的。77.术语“重组”抗原结合蛋白(如抗体或其抗原结合片段)是指通过本领域已知为重组dna技术(其包含例如dna剪接和转基因表达)的技术或方法而产生、表达、分离或获得的此类分子。所述术语包含在非人哺乳动物(包含转基因非人哺乳动物，例如转基因小鼠)或细胞(例如，cho细胞)表达系统或非人细胞表达系统中表达或从重组组合人抗体文库分离的抗体。在一些实施例中，重组抗体与从生物体(例如，小鼠或人)分离但已经通过重组dna技术表达的抗体共享序列。此类抗体的翻译后修饰(例如，糖基化)可能与如从生物体分离的抗体不同。78.本文所公开的重组抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)也可以在大肠杆菌(e.coli)/t7表达系统中产生。在这个实施例中，对本发明的抗cov‑s抗体免疫球蛋白分子(例如，如在表1中发现的)进行编码的核酸可以插入基于pet的质粒中并在大肠杆菌/t7系统中表达。例如，本发明包含用于在在细胞中包括表达t7rna聚合酶的宿主细胞(例如，细菌宿主细胞，如大肠杆菌，如bl21或bl21de3)中表达抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的方法，所述宿主细胞还包含对可操作地连接到t7启动子的免疫球蛋白链进行编码的多核苷酸。例如，在本发明的实施例中，细菌宿主细胞(如大肠杆菌)包含对可操作地连接到lac启动子的t7rna聚合酶基因进行编码的多核苷酸，并且聚合酶和链的表达是通过将宿主细胞与iptg(异丙基‑β‑d‑硫代吡喃半乳糖苷)一起温育而诱导的。参见us4952496和us5693489或studier和moffatt,“使用噬菌体t7rna聚合酶指导克隆基因的选择性高水平表达(useofbacteriophaget7rnapolymerasetodirectselectivehigh‑levelexpressionofclonedgenes)”,《分子生物学杂志》,1986年5月5日；189(1):113‑30。79.本领域具有几种已知的产生重组抗体的方法。在us4816567中公开了用于重组产生抗体的方法的一个实例。80.转化可以通过用于将多核苷酸(例如，dna或rna，包含mrna)引入宿主细胞中的任何已知方法。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域众所周知的，并且包含葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、多烯介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将一种或多种多核苷酸包封在脂质体中、脂质纳米颗粒技术、生物弹射以及直接将dna微量注射到细胞核中。另外，核酸分子可以通过病毒载体(如慢病毒或腺相关病毒)引入哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域公知的。参见例如，美国专利第4,399,216号；第4,912,040号；第4,740,461号和第4,959,455号。在一些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段可以以核酸形式(例如，dna或rna，包含mrna)引入到受试者，使得受试者的自身细胞产生抗体。本公开进一步提供对本文所描述的抗cov‑s抗体进行编码的核苷酸序列的修饰，所述修饰使得抗体表达增加、抗体稳定性增加、核酸(例如，mrna)稳定性增加或抗体对cov纤突蛋白的亲和力或特异性提高。81.因此，本发明包含用于制备本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白(如抗体或其抗原结合片段)或其免疫球蛋白链的重组方法，所述方法包括(i)引入对例如表1的抗原结合蛋白的轻和/或重免疫球蛋白链或cdr进行编码的一个或多个多核苷酸(例如，包含表2的序列中的任何一个或多个序列的核苷酸序列)，例如其中所述多核苷酸位于载体中；和/或整合到宿主细胞染色体中和/或可操作地连接到启动子；(ii)在有利于表达多核苷酸的条件下培养宿主细胞(例如，cho或毕赤酵母(pichia)或巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))，以及(iii)任选地从宿主细胞和/或宿主细胞生长于的培养基分离抗原结合蛋白(例如，抗体或片段)或链。例如，多核苷酸可以例如在使用基因编辑系统(例如，crispr(例如，crispr‑cas9)、talen、megatal、锌指或阿尔戈诺特(argonaute))对染色体进行切割之后通过用载体(如腺相关病毒(aav))进行的靶向插入整合到宿主细胞染色体中。靶向插入可以例如在宿主细胞基因座(白蛋白或免疫球蛋白基因组基因座)处发生。可替代地，插入可以例如使用载体(如慢病毒)位于随机基因座处。当制备包括多于一个免疫球蛋白链的抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)，例如包括两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的抗体时，如果此类链被分泌，则在单个宿主细胞中的共表达所述链会导致链例如在细胞中、在细胞表面或在细胞外缔合，以便形成抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。所述方法包含其中表达仅重免疫球蛋白链或仅轻免疫球蛋白链(例如，本文所讨论的任何重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链，包含其成熟片段和/或可变结构域)的方法。例如，在表达包含此类链的抗体或抗原结合片段时，此类链可用作中间体。例如，本发明还包含包括由包括表2中所示的核苷酸序列的多核苷酸编码的重链免疫球蛋白(或其可变结构域或包括其cdr)和由表2中所示的核苷酸序列编码的轻链免疫球蛋白(或其可变结构域或包括其cdr)的抗cov‑s抗原结合蛋白(如抗体和其抗原结合片段)，其是此类产生方法以及任选地本文所示的纯化方法的产物。例如，在一些实施例中，所述方法的产物是抗cov‑s抗原结合蛋白，其是包括包括表1中所示的氨基酸序列的hcvr和包括表1中所示的氨基酸序列的lcvr的抗体或片段，其中hcvr和lcvr序列选自表1中所列的单抗体。在一些实施例中，所述方法的产物是抗cov‑s抗原结合蛋白，其是包括包括表1中所示的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3和包括表1中所示的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3的抗体或片段，其中六个cdr序列选自表1中所列的单抗体。在一些实施例中，所述方法的产物是抗cov‑s抗原结合蛋白，其是包括包括表1中所示的hc氨基酸序列的重链和表1中所示的lc氨基酸序列的轻链的抗体或片段。82.真核和原核宿主细胞(包含哺乳动物细胞)可以用作用于表达抗cov‑s抗原结合蛋白的宿主。此类宿主细胞是本领域中众所周知的，并且许多可从美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)获得。这些宿主细胞尤其包含中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0、sp2细胞、海拉细胞(helacell)、小仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞(例如，hepg2)、a549细胞、3t3细胞、hek‑293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包含人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系(例如，草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)或粉纹夜蛾(trichoplusiani))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包含酵母和丝状真菌细胞，所述丝状真菌细胞包含例如，毕赤酵母、芬兰毕赤酵母(pichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichiatrehalophila)、科克拉马毕赤酵母(pichiakoclamae)、膜醭毕赤酵母(pichiamembranaefaciens)、微小毕赤酵母(pichiaminuta)(甲醇诱导型酵母(ogataeaminuta)、林氏毕赤酵母(pichialindneri))、仙人掌毕赤酵母(pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(pichiasalictaria)、松栎毕赤酵母(pichiaguercuum)、皮杰普毕赤酵母(pichiapijperi)、树干毕赤酵母(pichiastiptis)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、毕赤酵母菌(pichiasp.)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、酵母菌(saccharomycessp.)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母菌(kluyveromycessp.)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、白色念珠菌(candidaalbicans)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、里氏木霉(trichodermareesei)、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、镰刀菌(fusariumsp.)、禾谷镰刀菌(fusariumgramineum)、镰孢霉(fusariumvenenatum)、小立碗藓(physcomitrellapatens)以及粗糙脉孢菌(neurosporacrassa)。本发明包含分离的宿主细胞(例如，cho细胞)，其包括抗原结合蛋白，如表1的抗原结合蛋白；或对其多肽进行编码的多核苷酸。83.术语“特异性结合”是指与抗原(如cov‑s蛋白(例如，sars‑cov‑2‑s))具有结合亲和力的那些抗原结合蛋白(例如，mab)，所述结合亲和力表示为如例如通过在25℃或37℃下进行的实时无标记生物层干涉测定(例如，htx生物传感器)或通过表面等离振子体共振(例如，biacoretm)或通过溶液‑亲和力elisa测量为至少约10‑8m的kd。本发明包含与cov‑s蛋白特异性结合的抗原结合蛋白。84.如本文所使用的，术语抗体或抗原结合蛋白的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”等包含任何与抗原特异性结合以形成复合物的天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗原结合片段的非限制性实例包含：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(cdr)，如cdr3肽)或受约束的fr3‑cdr3‑fr4肽。其它工程化分子如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如，如wo08/020079或wo09/138519中定义的)(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(smip)和鲨鱼可变ignar结构域也涵盖在如本文所使用的表述“抗原结合片段”内。在本发明的实施例中，抗原结合片段包括表1的抗体的三个或更多个cdr(例如，cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3；或cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3)。85.在本发明的实施例中，抗体的抗原结合片段将包括至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包括至少一个与一个或多个构架序列相邻或在所述构架内的cdr。在具有与vl结构域相关联的vh结构域的抗原结合片段中，vh结构域和vl结构域可以以任何适合的布置相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有vh‑vh、vh‑vl或vl‑vl二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以含有单体vh或vl结构域。86.在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有共价连接到至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包含：(i)vh‑ch1；(ii)vh‑ch2；(iii)vh‑ch3；(iv)vh‑ch1‑ch2；(v)vh‑ch1‑ch2‑ch3；(vi)vh‑ch2‑ch3；(vii)vh‑cl；(viii)vl‑ch1；(ix)vl‑ch2；(x)vl‑ch3；(xi)vl‑ch1‑ch2；(xii)vl‑ch1‑ch2‑ch3；(xiii)vl‑ch2‑ch3；以及(xiv)vl‑cl。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中(包含上文所列的任何示例性构型)，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或连接子区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包括上文所列的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，其彼此非共价缔合和/或与一个或多个单体vh或vl结构域共价缔合(例如，通过一个或多个二硫键)。87.抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。多特异性抗原结合蛋白将在本文中进一步进行讨论。88.在具体实施例中，本发明的抗体或抗体片段可以与部分(如配体)或治疗性部分(“免疫缀合物”)(如抗病毒药、第二抗流感抗体或可用于治疗病毒感染(例如，流感病毒感染)的任何其它治疗性部分)缀合。参见下文。89.本发明还提供了一种复合物，所述复合物包括本文讨论的与与抗cov‑s抗体或片段特异性结合的cov‑s多肽或其抗原片段和/或第二抗体或抗原结合片段(例如，可检测地标记的第二抗体)复合的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。在本发明的实施例中，抗体或片段处于体外(例如，固定到固体基质)或处于受试者体内。在本发明的实施例中，cov‑s处于体外(例如，固定到固体基质)或处于病毒的表面上或处于受试者体内。共价连接到不溶性基质材料(例如，玻璃或多糖(如琼脂糖或琼脂糖凝胶)，例如，其珠粒或其它颗粒)的固定化抗cov‑s抗体和其抗原结合片段也是本发明的一部分；任选地，其中固定化抗体与cov‑s或其抗原片段或第二抗体或其片段复合。[0090]“分离的”抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段、多肽、多核苷酸和载体至少部分不含来自产生其的细胞或细胞培养物中的其它生物分子。此类生物分子包含核酸、蛋白质、其它抗体或抗原结合片段、脂质、碳水化合物或其它物质，如细胞碎片和生长培养基。分离的抗体的抗原结合片段可以进一步至少部分地不含表达系统组分(如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子)。通常，术语“分离的”并不旨在是指完全不存在此类生物分子，也不是指不存在水、缓冲液或盐或指包含抗体或片段的药物调配物的组分。[0091]术语“表位”是指与抗原结合蛋白的特定抗原结合位点(例如，称为互补位的抗体分子的可变区)相互作用的抗原决定簇(例如，cov‑s多肽)。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体可以与抗原上的不同区域结合，并且可以具有不同的生物学效应。术语“表位”还可以指b和/或t细胞对其应答的抗原上的位点。其还指抗体结合的抗原的区。表位可以定义为结构性或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接有助于相互作用的亲和力的那些残基。表位可以是线性或构象的(即，由非线性氨基酸构成)。在某些实施例中，表位可以包含决定簇，所述决定簇是分子的化学活性表面基团(如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，并且在某些实施例中，可以具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。[0092]用于确定抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)的表位的方法包含丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke,(2004),《分子生物学方法(methodsmol.biol.)》,248:443‑63)、肽切割分析、晶体学研究和nmr分析。另外，可以采用如抗原的表位切除、表位提取及化学修饰等方法(tomer,(2000),《蛋白质科学(prot.sci.)》,9:487‑496)。可以用于鉴定与抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对所关注蛋白质进行氘标记，然后将抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)与经氘标记的蛋白质结合。接下来，cov‑s蛋白/抗原结合蛋白复合物转移到水中，并且受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比并非是界面的一部分的氨基酸内的可交换质子慢的速率经历氢‑氘反交换。因此，形成蛋白质/抗原结合蛋白界面的一部分的氨基酸可以保留氘，并且因此表现出与并未包含在界面中的氨基酸相比相对较高的质量。在解离抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)后，靶蛋白经历蛋白酶切割和质谱法分析，由此揭示与抗原结合蛋白与之相互作用的特定氨基酸相对应的经氘标记的残基。参见例如，ehring(1999)《分析生物化学(analyticalbiochemistry)》267:252‑259；engen和smith(2001)《分析化学(anal.chem.》,73:256a‑265a。[0093]如本文所使用的，术语“竞争物”是指与抗原(例如，cov‑s)结合并且抑制或阻断另一种抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)与抗原的结合的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)。所述术语还包含两个方向上的两个抗原结合蛋白(例如，抗体)之间的竞争，即，结合并且阻断第二抗体结合的第一抗体，反之亦然。在某些实施例中，第一抗原结合蛋白(例如，抗体)和第二抗原结合蛋白(例如，抗体)可以与相同的表位结合。可替代地，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白(例如，抗体)可以与不同但例如重叠的表位结合，其中一个的结合例如通过空间位阻抑制或阻断第二抗体的结合。抗原结合蛋白(例如，抗体)之间的竞争可以通过本领域已知的方法来测量，例如，通过实时无标记生物层干涉测定。表位作图(例如，通过丙氨酸扫描或氢‑氘交换(hdx))可以用于测定两个或更多个抗体是否是非竞争的(例如，纤突蛋白受体结合结构域(rbd)单体)、竞争同一表位或者竞争但是与不同的微表位竞争(例如，通过hdx鉴定的)。在本发明的实施例中，第一抗cov‑s抗原结合蛋白与第二抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)之间的竞争是通过以下测定的：测量固定化第一抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)(最初未与cov‑s蛋白复合)与与第二抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)复合的可溶cov‑s蛋白结合的能力。第一抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)与复合的cov‑s蛋白结合的能力相对于未复合的cov‑s蛋白有所降低指示第一抗cov‑s抗原结合蛋白和第二抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体)竞争。竞争程度可以表示为结合的降低的百分比。此类竞争可以使用实时无标记生物层干涉测定(例如，在octetred384生物传感器(颇尔富迪生物公司(pallfortebiocorp.)上)、elisa(酶联免疫吸附测定)或通过spr(表面等离振子共振)进行测量。[0094]抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，单克隆抗体(mab))之间的结合竞争可以在octetred384生物传感器(颇尔富迪生物公司)上使用实时无标记生物层干涉测定来测定。例如，为了测定两种抗cov‑s单克隆抗体之间的竞争，可以首先通过将尖端浸入抗cov‑smab的溶液中来将抗cov‑smab(后续称为“mab1”)捕获到抗hfc抗体涂覆的octet生物传感器尖端上(颇尔富迪生物公司，#18‑5060)。作为阻断的阳性对照，然后可以用已知的阻断同种型对照mab(后续称为“阻断mab”)使捕获抗体的生物传感器尖端通过浸入阻断mab的溶液中而饱和。为了测定mab2是否与mab1竞争，可以随后将生物传感器尖端浸入已经预温育一段时间的cov‑s多肽和第二抗cov‑smab(随后称为“mab2”)的共复合溶液中，并且可以测定mab1与cov‑s多肽的结合。在实验的每个步骤之间，可以将生物传感器尖端在缓冲液中洗涤。可以在实验过程期间监测实时结合应答，并且可以记录每个步骤结束时的结合应答。[0095]例如，在本发明的实施例中，竞争测定在25℃和约7(例如，7.4)的ph下、例如在存在缓冲液、盐、表面活性剂和非特异性蛋白质(例如，牛血清白蛋白)的情况下进行。[0096]通常，以某种方式修饰的本发明的抗体或抗原结合片段保留与cov‑s特异性结合的能力，例如，当以摩尔为基础表达其cov‑s结合活性时，保留所述活性的至少10％(在与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段与亲本抗体相比保留cov‑s结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多。本发明的抗体或抗原结合片段还旨在可以包含基本上不改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。[0097]多肽(如免疫球蛋白链(例如，mab8021vh、vl、hc或lc、mab8028vh、vl、hc或lc或mab8029vh、vl、hc或lc))的“变体”是指包括与本文所示的(例如，seqidno:2、10、18、20、22、30、38、40、42、50、58或60中所示的)参考氨基酸序列至少约70‑99.9％(例如，70％、72％、74％、75％、76％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％)相同或类似的氨基酸序列的多肽；当通过blast算法进行比较时，其中算法的参数被选择成给出在相应参考序列的整个长度内的相应序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字号：3；查询范围内的最大匹配数：0；blosum62矩阵；空位罚分：存在11，扩展1；条件组成得分矩阵调整)。[0098]多核苷酸的“变体”是指包括与本文所示的(例如，seqidno:1、9、17、19、21、29、37、39、41、49、57或59中所示的)参考核苷酸序列至少约70‑99.9％(例如，至少约70％、72％、74％、75％、76％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)相同的核苷酸序列的多核苷酸；当通过blast算法执行比较时，其中算法的参数被选择成给出在相应参考序列的整个长度内的相应序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字号：28；查询范围内的最大匹配数：0；匹配/不匹配得分：1，‑2；空位罚分：线性)。[0099]在本发明的实施例中，本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)包含与表1中所示的hcvr氨基酸序列具有至少70％(例如，80％、85％、90％、91％、等人,(1992),《科学(science)》,256:144345中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。[0105]抗cov‑s抗体和其抗原结合片段的功能保守变体也是本发明的一部分。抗cov‑s抗体和其抗原结合片段(如本文所讨论的)的变体中的任何变体可以是“功能保守变体”。在一些情况下，此类功能保守变体也可以被表征为保守修饰的变体。如本文所使用的，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基在没有显著改变抗体或片段的一个或多个功能性质的情况下已经变化的抗cov‑s抗体或其抗原结合片段的变体。在本发明的实施例中，本发明的功能保守变体抗cov‑s抗体或其抗原结合片段包括变体氨基酸序列，并且表现出以下功能性质中的一个或多个功能性质：[0106]·抑制冠状病毒(例如，sars‑cov‑2、sars‑cov和/或mers‑cov)在表达ace2和/或tmprss2的细胞(例如，calu‑3细胞)中的生长；[0107]·不会与没有表达ace2和/或tmprss2的mdck/tet‑on细胞显著结合；[0108]·显示细胞(例如，calu‑3,)的冠状病毒感染(例如，通过sars‑cov‑2、sars‑cov和/或mers‑cov)的体外传播；和/或[0109]·任选地，当与第二治疗剂组合时，保护被工程化成表达人tmprss2和/或ace2蛋白的小鼠免于冠状病毒感染(例如，sars‑cov‑2、sars‑cov或mers‑cov)所引起的死亡，例如其中小鼠感染以其它方式致死的剂量的病毒。[0110]·任选地，当与第二治疗剂组合时，保护被工程化成表达人tmprss2和/或ace2蛋白的小鼠免于冠状病毒感染(例如，sars‑cov‑2、sars‑cov或mers‑cov)所引起的体重减轻，例如其中小鼠感染以其它方式引起体重减轻的剂量的病毒。[0111]“中和”或“拮抗剂”抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)是指以任何可检测的程度抑制cov‑s的活性(例如，抑制cov‑s与要被蛋白酶(如tmprss2)切割的受体(如ace2)结合或介导病毒进入宿主细胞中或病毒在宿主细胞中繁殖的活性)的分子。[0112]表1是指包括如下文所示的重链或vh(或其变体)和轻链或vl(或其变体)的抗原结合蛋白(如抗体和其抗原结合片段)；或者所述抗原结合蛋白包括：vh，其包括其cdr(cdr‑h1(或其变体)、cdr‑h2(或其变体)和cdr‑h3(或其变体))；和vl，其包括其cdr(cdr‑l1(或其变体)、cdr‑l2(或其变体)和cdr‑l3(或其变体))，例如，其中免疫球蛋白链、可变区和/或cdr包括如下所描述的特定氨基酸序列。[0113]本文所描述的抗体还包含其中vh与野生型igg4(例如，其中残基108为s)或与igg4变体(例如，其中残基108为p)融合的实施例。[0114]本发明的抗体和抗原结合片段包括包含本文所示的氨基酸序列的免疫球蛋白链以及对抗体的细胞和体外翻译后修饰。例如，本发明包含与cov‑s特异性结合的抗体和其抗原结合片段，其包括本文所示的重和/或轻链氨基酸序列(例如，cdr‑h1、cdr‑h2、cdr‑h3、cdr‑l1、cdr‑l2和/或cdr‑l3)以及其中一个或多个氨基酸残基被糖基化、一个或多个asn残基被脱去酰胺基、一个或多个残基(例如，met、trp和/或his)被氧化、n端gln是焦谷氨酸(pyroe)和/或c端赖氨酸缺失的抗体和片段。[0115]示例性抗sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)抗体的氨基酸序列和核苷酸序列在下文的示例性序列表中示出。[0116]示例性序列表[0117][0118][0119][0120][0121][0122][0123][0124][0125][0126][0127][0128]抗体的施用[0129]本发明提供了用于施用本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，表1的那些)的方法，所述方法包括将抗原结合蛋白引入受试者(例如，人)体内。例如，所述方法包括用注射器的针刺穿受试者的身体，并且将抗原结合蛋白注射到受试者的体内，例如，注射到受试者的静脉、动脉、肿瘤、肌肉组织或皮下组织。[0130]本发明提供了包括本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，表1的那些)的器皿(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱、空心孔针或注射器筒)。[0131]本发明还提供了包括与cov‑s特异性结合的一个或多个抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)(例如，表1的那些)或其药物组合物的注射装置。注射装置可以包装成试剂盒。注射装置是通过肠胃外途径(例如，肌内、皮下或静脉内)将物质引入受试者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预先填充有药物组合物，如自动注射器)，所述注射器例如包含用于保持要注射的流体(例如，包括抗体或其片段或药物组合物)的圆筒或针筒、用于将皮肤和/或血管穿刺以注射液体的针头；以及用于将流体推出圆筒并通过针孔的柱塞。在本发明的实施例中，包括来自本发明的组合的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或其药物组合物的注射装置是静脉内(iv)注射装置。此类装置可以在可以附接到管的套管或套管针/针中包含抗原结合蛋白或其药物组合物，所述管可以附接到用于保持通过套管或套管针/针引入受试者体内的流体(例如，生理盐水)的袋或储器。在本发明的实施例中，一旦套管针和套管插入受试者的静脉中，就可以将抗体或片段或其药物组合物引入装置中并将套管针从插入的套管去除。iv装置可以例如插入外周静脉(例如，在手或手臂中)中；上腔静脉或下腔静脉或在心脏的右心房(例如，中央iv)内；或到锁骨下静脉、颈内静脉或股静脉中，例如向心脏前进，直到其到达上腔静脉或右心房(例如，中央静脉线)为止。在本发明的实施例中，所述注射装置是自动注射器；喷射注射器或外部输注泵。喷射注射器使用穿透表皮以将抗体或片段或其药物组合物引入受试者体内的高压窄射流。外部输注泵是以控制量将抗体或片段或其药物组合物递送到受试者体内的医疗装置。外部输注泵可以电力地或机械地供以动力。不同的泵以不同的方式进行操作，例如，注射泵将流体保持在注射器的储器中，并且可移动活塞控制流体递送；弹性泵将流体保持在可伸缩球囊储器中，并且来自球囊的弹性壁的压力驱动流体递送。在蠕动泵中，一组辊向下压紧在一段柔性管上，从而推动流体前进。在多通道泵中，流体可以以多种速率从多个储器递送。[0132]人抗体的制备[0133]用于在转基因小鼠中产生人抗体的方法是本领域已知的。可将任何此类已知方法用于本发明中用于制备与cov‑s特异性结合的人抗体的上下文。包括以下任何一种的免疫原可以用于产生针对cov‑s的抗体。在本发明的某些实施例中，本发明的抗体从用全长cov‑s或用减毒或灭活的病毒或用对蛋白质或其片段进行编码的dna免疫的小鼠获得。可替代地，可以使用标准的生物化学技术产生cov‑s蛋白或其片段，并且对其进行修饰并且用作免疫原。在本发明的一个实施例中，免疫原是重组产生的cov‑s蛋白或其片段。在本发明的某些实施例中，免疫原可以是cov‑s多肽疫苗。在某些实施例中，可以施用一种或多种加强注射。在某些实施例中，免疫原可以是在大肠杆菌或在任何其它真核或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(cho)细胞)中表达的重组cov‑s多肽。[0134]使用技术(参见例如，us6,596,541，再生元制药公司(regeneronpharmaceuticals)，)或用于产生单克隆抗体的任何其它已知方法，可以初步分离具有人可变区和小鼠恒定区的针对cov‑s的高亲和力嵌合抗体。技术涉及具有基因组的转基因小鼠的产生，所述基因组包括可操作地连接到内源性小鼠恒定区基因座的人重链可变区和人轻链可变区，使得小鼠响应于抗原性刺激而产生包括人可变区和小鼠恒定区的抗体。对抗体的重链可变区和轻链可变区进行编码的dna被分离，并且可操作连接到对人重链恒定区和人轻链恒定区进行编码的dna。然后dna在能够表达完全人抗体的细胞中表达。[0135]通常，用所关注抗原攻击小鼠，并且从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(如b细胞)。可以将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生的杂交瘤细胞系，并且对此类杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定产生对所关注抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。对重链可变区和轻链可变区的进行编码dna可以被分离并且连接到重链和轻链的期望同种型恒定区。此类抗体蛋白可以在如cho细胞等细胞中产生。可替代地，对抗原特异性嵌合抗体或轻链可变结构域和重链可变结构域的进行编码dna可以直接从抗原特异性淋巴细胞分离。[0136]最初，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如在下文的实验部分中，表征并选择抗体以获得期望特性，包含亲和力、选择性、表位等。将小鼠恒定区替换为期望的人恒定区以产生本发明的完全人抗体，例如野生型或经修饰的igg1或igg4。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特性存在于可变区中。[0137]包括fc变体的抗冠状病毒纤突蛋白抗体[0138]根据本发明的某些实施例，提供了包括fc结构域的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)，所述fc结构域包括增强或减少抗体与fcrn受体例如在酸性ph下(如与中性ph相比)的结合的一个或多个突变。例如，本发明包含在fc结构域的ch2区或ch3区中包括突变的抗cov‑s抗体，其中一个或多个突变增加fc结构域在酸性环境中(例如，在ph范围为约5.5到约6.0的核内体中)对fcrn的亲和力。当施用于动物时，此类突变可以导致抗体的血清半衰期增加。此类fc修饰的非限制性实例包含例如以下位置处的修饰：第250位(例如，e或q)；第250位和第428位(例如，l或f)；第252位(例如，l/y/f/w或t)、第254位(例如，s或t)和第256位(例如，s/r/q/e/d或t)；或第428位和/或第433位(例如，h/l/r/s/p/q或k)和/或第434位(例如，a、w、h、f或y[n434a、n434w、n434h、n434f或n434y])；或第250位和/或第428位；或第307位或第308位(例如，308f、v308f)和第434位。在一个实施例中，修饰包括428l(例如，m428l)和434s(例如，n434s)修饰；428l、259i(例如，v259i)和308f(例如，v308f)修饰；433k(例如，h433k)和434(例如，434y)修饰；252、254和256(例如，252y、254t和256e)修饰；250q和428l(例如，t250q和m428l)修饰；以及307和/或308(例如，308f或308p)修饰。在又另一个实施例中，修饰包括265a(例如，d265a)和/或297a(例如，n297a)修饰。[0139]例如，本发明包含包括fc结构域的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)，所述fc结构域选自由以下组成的组的一对或多对突变或一组或多组突变：250q和248l(例如，t250q和m248l)；252y、254t和256e(例如，m252y、s254t和t256e)；428l和434s(例如，m428l和n434s)；257i和311i(例如，p257i和q311i)；257i和434h(例如，p257i和n434h)；376v和434h(例如，d376v和n434h)；307a、380a和434a(例如，t307a、e380a和n434a)；以及433k和434f(例如，h433k和n434f)。[0140]设想了包括本文所示的包括前述fc结构域突变的任何可能的组合的vh和/或vl的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)在本发明的范围内。[0141]本发明还包含抗cov‑s抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段，其包括本文所示的vh和嵌合重链恒定(ch)区，其中所述嵌合ch区包括衍生自多于一种的免疫球蛋白同种型的ch区的区段。例如，本发明的抗体可以包括嵌合ch区，其包括衍生自人igg1、人igg2或人igg4分子、与衍生自人igg1、人igg2或人igg4分子的ch3结构域的一部分或全部组合的ch2结构域的一部分或全部。根据某些实施例，本发明的抗体包括具有嵌合铰链区的嵌合ch区。例如，嵌合铰链可以包括衍生自人igg1、人igg2或人igg4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据eu编号来自第216位到第227位的氨基酸残基)，其与衍生自人igg1、人igg2或人igg4铰链区的“下铰链”序列(根据eu编号来自第228位到第236位的氨基酸残基)组合。根据某些实施例，嵌合铰链区包括衍生自人igg1或人igg4上铰链的氨基酸残基和衍生自人igg2下铰链的氨基酸残基。在某些实施例中，包括本文所述的嵌合ch区的抗体可以表现出不会不利地影响抗体的治疗或药代动力学性质的经过修饰的fc效应子功能。(参见例如，wo2014/022540)。[0142]免疫缀合物[0143]本发明涵盖与另一个部分(例如，治疗性部分(免疫缀合物)，如类毒素或治疗流感病毒感染的抗病毒药)缀合的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。在本发明的实施例中，将抗cov‑s抗体或片段与本文所示的任何另外的治疗剂缀合。如本文所使用的，术语“免疫缀合物”是指与放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告基因部分、酶、肽或蛋白质或治疗剂化学或生物连接的抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。抗原结合蛋白可以沿分子能够结合其靶标(cov‑s)的长度在任何位置处连接到放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告基因部分、酶、肽或蛋白质或治疗剂。免疫缀合物的实例包含抗体‑ꢀ药物缀合物和抗体‑毒素融合蛋白。在本发明的一个实施例中，药剂可以是与cov‑s特异性结合的第二不同抗体。可以与抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或片段)缀合的治疗性部分的类型将考虑要治疗的病状和要实现的期望的治疗效果。参见例如，arnon等人,“用于在癌症疗法中免疫靶向药物的单克隆抗体(monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy)”,《单克隆抗体和癌症疗法(monoclonalantibodiesandcancertherapy)》,reisfeld等人(编著),第243‑56页(alanr.liss公司(alanr.liss,inc.)1985)；hellstrom等人,“用于药物递送的抗体(antibodiesfordrugdelivery)”《受控药物递送(controlleddrugdelivery)》(第2版),robinson等人(编著),第623‑53页(马塞尔德克尔公司(marceldekker，inc.)1987)；thorpe,“癌症疗法中的细胞毒性剂的抗体载体：综述(antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview)”,单克隆抗体(monoclonalantibodies)1984:《生物学和临床应用(biologicalandclinicalapplications)》,pinchera等人(编著),第475‑506页(1985)；“放射标记抗体在癌症疗法中的治疗性用途的分析、结果和未来展望(analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy)”《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy)》,baldwin等人(编著),第303‑16页(学术出版社(academicpress)1985)以及thorpe等人,“抗体‑毒素缀合物的制备和细胞毒性性质(thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody‑toxinconjugates)”《免疫学综述(immunol.rev.)》，62:119‑58(1982)。[0144]多特异性抗体[0145]本发明包含抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)以及其使用方法和制备此类抗原结合蛋白的方法。术语“抗cov‑s”抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)包含多特异性(例如，双特异性或双互补位)分子，所述多特异性分子包含与cov‑s特异性结合的至少一个第一抗原结合结构域(例如，来自表1的抗体的抗原结合结构域)和与不同的抗原或与cov‑s中的与第一抗原结合结构域的表位不同的表位结合的至少一个第二抗原结合结构域。在一些实施例中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者选自表1的抗原结合结构域。在本发明的实施例中，第一表位和第二表位重叠。在本发明的另一个实施例中，第一表位和第二表位不重叠。例如，在本发明的实施例中，多特异性抗体是双特异性igg抗体(例如，igg1或igg4)，其包含与包含表1的抗体的重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链的cov‑s特异性结合的第一抗原结合结构域和与cov‑s的不同表位特异性结合的第二抗原结合结构域。在一些实施例中，双特异性igg抗体(例如，igg1或igg4)包含与cov‑s特异性结合的第一抗原结合结构域和与宿主细胞蛋白(例如，ace2或tmprss2)结合的第二结合结构域。[0146]表1的抗体包含多特异性分子(例如，抗体或抗原结合片段)，所述多特异性分子分别包含那些抗体的cdr‑h和cdr‑l、vh和vl或hc和lc(包含本文所示的其变体)。[0147]在本发明的实施例中，与cov‑s特异性结合的抗原结合结构域可以包含在多特异性分子中，所述抗原结合结构域包括：[0148](1)[0149](i)重链可变结构域序列，其包括表1中所示的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3氨基酸序列，以及[0150](ii)轻链可变结构域序列，其包括表1中所示的cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3氨基酸序列；[0151]或者[0152](2)[0153](i)重链可变结构域序列，其包括表1中所示的氨基酸序列，以及[0154](ii)轻链可变结构域序列，其包括表1中所示的氨基酸序列；[0155]或者[0156](3)[0157](i)重链免疫球蛋白序列，其包括表1中所示的氨基酸序列，以及[0158](ii)轻链免疫球蛋白序列，其包括表1中所示的氨基酸序列。[0159]在本发明的实施例中，多特异性抗体或片段包含多于两种不同的结合特异性(例如，三特异性分子)，例如，与第一和/或第二抗原结合结构域相同或不同的一个或多个另外的抗原结合结构域。[0160]在本发明的一个实施例中，双特异性抗原结合片段包括对第一表位(例如，cov‑s)具有结合特异性的第一scfv(例如，包括表1的vh和vl序列)和对第二不同表位具有结合特异性的第二scfv。例如，在本发明的实施例中，第一和第二scfv与接头(例如肽接头(例如，gs接头，如(ggggs)n(seqidno:834)))拴系在一起，其中n为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。其它双特异性抗原结合片段包含双特异性igg抗体的f(ab)2，其包括表1和与不同表位结合的另一个抗体的重和轻链cdr。[0161]治疗方法[0162]本发明提供用于通过向需要此类治疗或预防的受试者(例如，人)施用治疗有效量的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)来治疗或预防病毒感染(例如，冠状病毒感染)的方法。[0163]受试者体内的冠状病毒感染可以通过向受试者施用本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白来治疗或预防。[0164]有效或治疗有效剂量的(例如，表1的)用于治疗或预防病毒感染的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)指的是足以减轻所治疗受试者的感染的一种或多种体征和/或症状的抗体或片段的量，无论所述减轻是通过诱导此类体征和/或症状的消退或消除完成的还是通过抑制此类体征和/或症状的进展完成的。剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。在本发明的实施例中，用于治疗或预防病毒感染(例如，在成人受试者中)的本发明的抗体或其抗原结合片段的有效或治疗有效剂量为约0.01到约200mg/kg，例如多达约150mg/kg。在本发明的实施例中，剂量多达约10.8或11克(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11克)。根据感染的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施例中，本发明的抗原结合蛋白可以以初始剂量和随后的一个或多个二次剂量来施用。在某些实施例中，可以在初始剂量之后施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，所述第二或多个后续剂量的量可以近似于或小于初始剂量的量，其中后续剂量间隔至少1天到3天；至少一周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。[0165]如本文所使用的，术语“受试者”是指需要预防和/或治疗疾病或病症(如病毒感染或癌症)的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猫、狗、牛、猪、绵羊、马、山羊、兔子)，优选地例如人。受试者可以患有病毒感染(例如，流感感染)或易患上感染。易患上感染的受试者或感染上感染(例如，冠状病毒或流感病毒感染)的风险较高的受试者包含由于自身免疫性疾病导致的免疫系统受损的受试者、接受免疫抑制疗法(例如，器官移植后)的受试者、患有人类免疫缺陷症综合征(hiv)或获得性免疫缺陷综合征(aids)的受试者、患有会耗尽或破坏白细胞的贫血形式的受试者、接受放射或化学疗法的受试者或患有炎性病症的受试者。另外地，年龄非常年轻(例如，5岁或更小)或年龄较大(例如，65岁或更大)的受试者处于较高风险中。此外，受试者由于接近疾病的爆发(例如，受试者居住在人口密集城市中或接近已经确诊或疑似患有病毒感染的受试者)或职业选择(例如，医院工作者、药物研究者、到过感染区域的旅行者或经常乘飞机者)而处于感染上病毒感染的风险中。[0166]“治疗(treat)”或“治疗(treating)”意指向具有疾病或感染(例如，病毒感染)的一种或多种体征或症状的受试者施用本发明(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)，对于所述疾病或感染而言，所述抗原结合蛋白在以有效或治疗有效量或剂量(如本文所讨论的)施用于受试者时是有效的。[0167]本发明还涵盖向处于病毒感染风险中的受试者预防性地施用本发明(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)以便预防此类感染。已经证明基于被动抗体的免疫预防法是预防受试者患上病毒感染的有效策略。参见例如，berry等人,被动广谱流感免疫预防(passivebroad‑spectruminfluenzaimmunoprophylaxis).《流感研究和治疗(influenzarestreat.)》2014；2014:267594。电子版发布于2014年9月22日；以及jianqiang等人,预防和控制甲型流感感染的被动免疫中和策略(passiveimmuneneutralizationstrategiesforpreventionandcontrolofinfluenzaainfections),《免疫疗法(immunotherapy)》2012年2月；4(2):175–186；prabhu等人,《抗病毒素疗法(antivirther.)》2009；14(7):911‑21,对h5血凝素具有特异性的嵌合单克隆抗体对致命的h5n1型流感的预防和治疗功效(prophylacticandtherapeuticefficacyofachimericmonoclonalantibodyspecificforh5hemagglutininagainstlethalh5n1influenza)。“预防(prevent)”或“预防(preventing)”意指向受试者施用本发明(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)以抑制疾病或感染(例如，病毒感染)在受试者体内的表现，对于所述疾病或感染，所述抗原结合蛋白在以有效或治疗有效量或剂量(如本文所讨论的)施用于受试者时是有效的。[0168]在本发明的实施例中，受试者的病毒感染的体征或症状是例如通过病毒滴度测定(例如，将冠状病毒在鸡胚中繁殖或冠状病毒纤突蛋白测定)测定的病毒在受试者体内的存活或增殖。病毒感染的其它体征和症状在本文中进行了讨论。[0169]如上所述，在一些实施例中，受试者可以是非人动物，并且本文所讨论的抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)可以在治疗和/或预防非人动物(例如，猫、狗、猪、牛、马、山羊、兔子、绵羊等)的疾病的兽医情景中使用。[0170]本发明提供了用于治疗或预防病毒感染(例如，冠状病毒感染)或用于诱导病毒感染的至少一种体征或症状的消退或消除或抑制所述至少一种体征或症状的进展的方法，如：[0171]·发烧或感到发热/发冷；[0172]·咳嗽；[0173]·咽喉痛；[0174]·流鼻涕或鼻塞；[0175]·打喷嚏；[0176]·肌肉或身体疼痛；[0177]·头痛；[0178]·疲劳(疲倦)；[0179]·呕吐；[0180]·腹泻；[0181]·呼吸道感染；[0182]·胸闷；[0183]·呼吸短促；[0184]·支气管炎；和/或[0185]·肺炎，[0186](对于病毒感染而言次要的体征或症状)，对有需要的受试者(例如，人)进行的所述治疗或预防或所述诱导或抑制是通过向所述受试者施用治疗有效量的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，通过将蛋白质注射到受试者体内)进行的。[0187]组合和药物组合物[0188]为了制备(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和其抗原结合片段)的药物组合物，将抗原结合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如，《雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》和《美国药典：国家处方集(u.s.pharmacopeia:nationalformulary)》,麦克出版公司(mackpublishingcompany),伊斯顿,宾夕法尼亚州,(1984)；hardman等人,(2001),《古德曼,吉尔曼治疗学的药理学基础(goodmanandgilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics)》,麦格劳希尔出版公司(mcgraw‑hill),纽约市,纽约州；gennaro(2000)《雷明顿：药物科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)》,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(lippincott,williams,andwilkins),纽约市,纽约州；avis等人(编著),(1993),《药物剂型：胃肠外药物(pharmaceuticaldosageforms:parenteralmedications)》,马塞尔德克尔公司,纽约；lieberman等人(编著),(1990),《药物剂型：胃肠外药物(pharmaceuticaldosageforms:tablets)》,马塞尔·德克尔公司,纽约；lieberman等人(编著),(1990),《药物剂型：胃肠外药物(pharmaceuticaldosageforms:dispersesystems)》,马塞尔德克尔公司,纽约；weiner和kotkoskie(2000)《赋形剂毒性和安全性(excipienttoxicityandsafety)》,马塞尔德克尔公司,纽约市,纽约州)。在本发明的一个实施例中，药物组合物是无菌的。此类组合物是本发明的一部分。[0189]本发明的范围包含干燥的(例如，冻干的)组合物，所述组合物包括(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或包含药学上可接受的载体但基本上缺乏水的其药物组合物。[0190]在本发明的另外的实施例中，与本文所公开的(例如，表1)的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)组合施用于受试者的另外的治疗剂是根据根据医师案头参考(physicians'deskreference)2003(汤姆森医疗保健(thomsonhealthcare)；第57版(2002年11月1日))向受试者施用的。[0191]施用模式可以变化。施用途径包含口服、直肠、透粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、真皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮或动脉内。[0192]本发明提供了用于施用(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的方法，所述方法包括将蛋白质引入受试者体内。例如，所述方法包括用注射器的针刺穿受试者的身体，并且将抗原结合蛋白注射到受试者的体内，例如，注射到受试者的静脉、动脉、肿瘤、肌肉组织或皮下组织。[0193]本发明提供了一种器皿(例如，塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱、空心孔针或注射器筒)，所述器皿包括以下中的任何一个：(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)、多肽(例如，表1的hc、lc、vh或vl)或(例如，表2的)多核苷酸或本文所示的载体或包括药学上可接受的载体的其药物组合物。[0194]在本公开的实施例中，本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)与一个或多个另外的治疗剂组合施用。另外的治疗剂包含但不限于：抗炎剂；抗疟疾剂；特异性结合tmprss2的第二抗体或其抗原结合片段；和与cov‑s特异性结合的第二抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗疟疾剂是氯喹或羟化氯喹。在一些实施例中，所述抗炎剂是抗体，如萨瑞鲁单抗、托珠单抗或吉西鲁单抗。在一些实施例中，另外的治疗剂是本文所公开的(例如，表1的)第二抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，表1的一个、两个、三个、四个或更多个抗体或其抗原结合片段可以组合(例如，同时或顺序地)施用。表1的抗体的具体组合在下文的示例性抗体组合表中列出(每个编号表示特定组合，例如mab10989和mab10987是组合1，mab10989和mab10934是组合2，以此类推)。在一些实施例中，抗体的组合可以选自与不同的表位簇结合的那些抗体。例如，本文所描述的某些抗体属于如下的表位簇：簇1，mab10987、mab10922、mab10936和mab10934；簇2，mab10989、mab10977和mab10933；簇3，mab10920；簇4、mab10954、mab10986和mab10964；和簇5，mab10984。因此，两个抗体的组合可以选自例如簇1和簇2、簇1和簇3、簇1和簇4、簇1和簇5、簇2和簇3、簇2和簇4、簇2和簇5、簇3和簇4、簇3和簇5以及簇4和簇5。在一些实施例中，特异性结合tmprss2的抗体是h1h7017n，如国际专利公开号wo/2019/147831号中所描述的。[0195]示例性抗体组合表[0196][0197][0198]在一些实施例中，来自不同人供体的抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗sars‑cov‑2‑s抗体或其抗原结合片段)可以组合。本发明包含一种包括包括来自人受试者的可变结构域的两个(或更多个)抗sars‑cov‑2‑s抗体或抗原结合片段的组合物，其中所述两个(或更多个)抗体或抗原结合片段衍生自不同的受试者(例如，两个不同的人受试者)。衍生自人b细胞的抗体可变区在例如实例1和2(表3)中进行了讨论，其描述了克隆自此类b细胞的可变结构域与并非来自那些b细胞的恒定区组合以产生杂交抗体。此类抗体可变区的来源(供体)在下文的示例性人源性抗体可变区表中示出。在一些实施例中，组合物可以包括具有衍生自供体1的可变结构域的抗体或其抗原结合片段和具有衍生自供体2的可变结构域的抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施例中，组合物可以包括具有衍生自供体1的可变结构域的抗体或其抗原结合片段和具有衍生自供体3的可变结构域的抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施例中，组合物可以包括具有衍生自供体2的可变结构域的抗体或其抗原结合片段和具有衍生自供体3的可变结构域的抗体或其抗原结合片段的组合。在一些实施例中，组合物可以包括来自供体1的mab10987(例如，包括表1中所示出的cdr、可变区或重链和轻链序列的抗体)和来自供体3的mab10989(例如，包括表1中所示出的cdr、可变区或重链和轻链序列的抗体)的组合。[0199]示例性人源性抗体可变区表[0200][0201][0202]在一些实施例中，所述另外的治疗剂是抗病毒药和/或疫苗。如本文所使用的，术语“抗病毒药”是指用于治疗、预防或减轻受试者的病毒感染的任何抗感染药。术语“抗病毒药”包含但不限于阳离子类固醇抗菌剂、亮抑酶肽、抑肽酶、利巴韦林(ribavirin)或干扰素‑α2b。用于通过与作为本发明的一部分的另外的治疗剂组合施用表1的抗体或抗原结合片段来治疗或预防需要所述治疗或预防的受试者的病毒(例如，冠状病毒)感染的方法。[0203]例如，在本发明的实施例中，所述另外的治疗剂是疫苗，例如冠状病毒疫苗。在本发明的实施例中，疫苗是灭活/杀伤病毒疫苗、减毒活病毒疫苗或病毒亚基疫苗。[0204]例如，在本发明的实施例中，所述另外的治疗剂是：[0205][0206](卡莫他特甲磺酸盐)；[0207][0208](萘莫司他甲磺酸盐)；[0209][0210](盐酸溴己新(bhh))；[0211][0212](4‑(2‑氨基甲基)苯磺酰氟盐酸盐(aebsf))；[0213][0214][0215](聚酰胺)。参见shen等人《生物化学(biochimie)》142:1‑10(2017)。[0216]在本发明的实施例中，所述抗病毒药是与冠状病毒(例如，sars‑cov‑2、sars‑cov或mers‑cov)特异性结合的抗体或抗原结合片段。示例性抗cov‑s抗体包含但不限于：h4sh15188p；h1h15188p；h1h15211p；h1h15177p；h4sh15211p；h1h15260p2；h1h15259p2；h1h15203p；h4sh15260p2；h4sh15231p2；h1h15237p2；h1h15208p；h1h15228p2；h1h15233p2；h1h15264p2；h1h15231p2；h1h15253p2；h1h15215p；以及h1h15249p2(如国际专利申请公开号wo/2015/179535中所示的)或其抗原结合片段，例如其中所述抗体或片段包括包含cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3(例如，其vl或轻链)的轻链免疫球蛋白；以及包含任何前述抗cov‑s抗体的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3(例如，其vh或其重链)的重链。[0217]在本发明的某些实施例中，所述另外的治疗剂不是抑肽素、亮抑酶肽、阳离子类固醇抗菌剂、流感疫苗(例如，杀伤、活、减毒全病毒或亚基疫苗)或针对流感病毒的抗体(例如，抗血凝素抗体)。[0218]术语“与……组合”指示可以将本发明的组分、抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)与另一种试剂一起调配成单个组合物例如以进行同时递送，或单独地调配成两种或更多种组合物(例如，试剂盒)。可以在与施用其它组分不同的时间将每种组分施用于受试者；例如，每次施用可以在给定的时间间隔内非同时(例如，分别或按照顺序)给予。此外，单独的组分可以通过相同途径或通过不同途径施用于受试者(例如，其中抗cov‑s抗体或其抗原结合片段)。[0219]试剂盒[0220]另外提供了包括与包含但不限于如本文所讨论的另外的治疗剂的一个或多个另外的组分组合的包含但不限于如本文所讨论的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)的一个或多个组分的试剂盒。抗原结合蛋白和/或另外的治疗剂可以被调配为单个组合物或以两个或更多个组合物(例如，与药学上可接受的载体)单独地调配在药物组合物中。[0221]在本发明的一个实施例中，所述试剂盒在一个容器(例如，无菌玻璃或塑料小瓶)中包含本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或其药物组合物并且在另一个容器(例如，无菌玻璃或塑料小瓶)中包含另外的治疗剂。[0222]在另一个实施例中，所述试剂盒包括本发明的组合，所述组合在单个共用容器中包含任选地一起调配在药物组合物中的本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或其药物组合物以及一个或多个另外的治疗剂。[0223]如果试剂盒包含用于向受试者进行肠胃外施用的药物组合物，则所述试剂盒可以包含用于进行此类施用的装置(例如，注射装置)。例如，所述试剂盒可以包含一个或多个皮下注射针或如上文所讨论的含有本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的其它注射装置。[0224]试剂盒可以包含包装插入物(packageinsert)，所述包装插入物包含关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，此类信息帮助患者和医师有效地且安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，可以在插入物中提供关于本发明的组合的以下信息：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、注意事项、不良反应、过剂量、合适的剂量和施用、如何供应、合适的储存条件、参考资料、制造商/经销商信息和专利信息。[0225]抗体的诊断用途[0226]本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)可以用于检测和/或测量样品中的cov‑s。针对cov‑s的示例性测定可以包含例如使样品与本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白接触，其中所述抗cov‑s抗原结合蛋白标记有可检测标记或报告基因分子或用作捕获配体以选择性地将cov‑s从样品分离。与cov‑s复合的抗cov‑s抗原结合蛋白的存在指示cov‑s存在于样品中。可替代地，未经标记的抗cov‑s抗体可以与本身被可检测标记的第二抗体组合使用。可检测的标记或报告基因分子可以是如3h、14c、32p、35s或125i等放射性同位素；荧光或化学发光部分，如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或酶，如碱性磷酸酶、β‑半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可以用于检测或测量样品中的cov‑s的具体示例性测定包含中和测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)和荧光激活细胞分选(facs)。因此，本发明包含用于检测样品中的纤突蛋白多肽的存在的方法，所述方法包括使样品与抗cov‑s抗原结合蛋白接触以及检测cov‑s/抗cov‑s抗原结合蛋白的存在，其中复合物的存在指示cov‑s的存在。[0227]本发明的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白可以在用于检测样品中的cov‑s或其片段的存在的蛋白质印迹或免疫蛋白质印迹程序中使用。此种程序形成本发明的一部分并且包含例如以下步骤：[0228](1)提供包括要针对cov‑s的存在进行测试的样品的膜或其它固体基质，例如任选地包含使用本领域已知的方法(例如，半干印迹或罐印迹)将来自要针对cov‑s的存在进行测试的样品(例如，来自对样品中的蛋白质进行page或sds‑page电泳分离)的蛋白质转移到膜或其它固体基质上；以及使要针对cov‑s的存在进行测试的膜或其它固体基质或其片段与本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白接触。[0229]此类膜可以采用要针对cov‑s在非变性page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或sds‑page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中的存在进行测试的蛋白质(例如，在凝胶中的电泳分离后)已经转移到其的基于硝化纤维或乙烯基(例如，聚偏二氟乙烯(pvdf))的膜的形式。在使所述膜与抗cov‑s抗原结合蛋白接触之前，任选地用例如无脂干奶等阻断膜，以便结合膜上的非特异性蛋白质结合位点。[0230](2)将所述膜洗涤一次或多次以将未结合的抗cov‑s抗原结合蛋白和其它未结合的物质去除；以及[0231](3)检测结合的抗cov‑s抗原结合蛋白。[0232]检测结合的抗原结合蛋白指示cov‑s蛋白在所述膜或基质上和在所述样品中呈递。检测结合的抗原结合蛋白可以通过使抗原结合蛋白与可检测地标记的第二抗体(抗免疫球蛋白抗体)结合、并且然后检测第二抗体标记的存在来进行。[0233]本文所公开的(例如，表1的)抗cov‑s抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)也可以用于进行免疫组织化学。此种方法形成本发明的一部分并且包括例如[0234](1)使要针对cov‑s蛋白的存在进行测试的组织与本发明的抗cov‑s抗原结合蛋白接触；以及[0235](2)在所述组织上或中检测抗原结合蛋白。[0236]如果抗原结合蛋白自身可检测地标记，则可以直接检测到其。可替代地，抗原结合蛋白可以通过可检测地标记的第二抗体结合，其中然后检测所述标记。[0237]实例[0238]提出以下实例，以向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其发明的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，室温是约25℃，并且压力为大气压或接近大气压。[0239]实例1：针对sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)的人抗体的产生[0240]在包括对人免疫球蛋白重链可变区和κ轻链可变区或人免疫球蛋白重链可变区和λ轻链可变区的进行编码dna的小鼠中产生针对sars‑cov‑2纤突蛋白(sars‑cov‑2‑s)的人抗体。用表达sars‑cov‑2‑s受体结合结构域(rbd)(ncbi登录号(mn908947.3)seqidno:832的氨基酸1‑1273)的载体、然后用带有sars‑cov‑2‑s载体或sars‑cov‑2‑s蛋白的增强剂使每个小鼠产生免疫。由sars‑cov‑2‑s特异性免疫测定来监测抗体免疫应答。当达到期望的免疫应答时，收获淋巴细胞并使其与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选并选择杂交瘤细胞系以鉴定产生sars‑cov‑2‑s特异性抗体的细胞系。如美国专利7582298所描述的，抗sars‑cov‑2‑s抗体直接从抗原阳性的小鼠b细胞中分离，而不与骨髓瘤细胞融合，所述专利通过全文引用的方式并入。使用这种方法，获得了完全人抗sars‑cov‑2‑s抗体(即，具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)。[0241]将抗体可变区从人血液样品分离。实验室确认sars‑cov‑2和症状性covid‑19疾病的pcr测试为阳性后3‑4周，采集患者全血。使用基于氯化铵的裂解缓冲液(生命技术公司(lifetechnologies))裂解红细胞，并通过阴性选择富集b细胞。通过荧光活化细胞分选(facs)分离结合sars‑cov‑2纤突蛋白的单个b细胞。将分离的b细胞单孔铺板并与抗体轻和重可变区域特异性pcr引物混合。每个b细胞的cdna通过逆转录酶(rt)反应合成。然后将每个所产生的rt产物分离并转移到两个对应的孔中以用于后续的抗体重链和轻链pcr。首先将一组所产生的rt产物通过使用对抗体重可变区前导序列具有特异性的5'简并引物或对抗体轻链可变区前导序列具有特异性的5'简并引物和对抗体恒定区具有特异性的3'引物的pcr进行扩增以形成扩增子。然后将扩增子通过使用对抗体重可变区构架1具有特异性的5'简并引物或对抗体轻链可变区构架1具有特异性的5'简并引物和对抗体恒定区具有特异性的3'引物的pcr再次进行扩增以产生用于进行克隆的扩增子。将抗体重链和轻链衍生的pcr产物分别克隆到含有重恒定区和轻恒定区的表达载体中，由此产生杂交抗体的表达载体。将表达全长重和轻链对的表达载体转染到cho细胞以产生抗体蛋白以进行测试。[0242]根据这个实例的方法产生的示例性抗体的生物学性质在下文所示的实例中详细描述。[0243]实例2：重链和轻链可变区氨基酸和核苷酸序列[0244]表1示出了示例性抗sars‑cov‑2‑s抗体的重链和轻链可变区和cdr以及重链和轻链序列的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符列于表2中。[0245]表1：氨基酸序列标识符[0246][0247][0248][0249]表2：核酸序列标识符[0250][0251][0252][0253]虽然本文所公开的抗体具有完全人可变区，但是可以具有小鼠恒定区(例如，小鼠igg1fc或小鼠igg2fc(a或b同种型))或人恒定区(例如，人igg1fc或人igg4fc)。如本领域普通技术人员所理解的，具有特定fc同种型的抗体可以转化为具有不同fc同种型的抗体(例如，具有小鼠igg1fc的抗体可以转化为具有人igg4的抗体等)，但无论如何，由表1和2中所示出的数字标识符指示的可变结构域(包含cdr)将保持相同，并且无论恒定结构域的性质如何，预期抗原的结合性质相同或基本上类似。[0254]通过下一代测序对衍生自小鼠和衍生自人样品的抗体的可变区进行测序，并鉴定重链和轻链对的组库(图10a和图10b)。vi抗体的主要谱系使用与vk1‑9、vk1‑33或vk1‑39配对的vh3‑53，而人源性抗体使用与vk1‑33配对的vh3‑66或与vk1‑39配对的vh2‑70。对重叠序列的进一步分析示出vi与人源性抗体之间的分离的κ链的组库中的较强重叠。尽管λ链的组库并没有很好地重叠，这可能是由于这个试验中仅包含两只λ小鼠。vi与人源性抗体的重链的平均cdr长度类似，平均长度分别为13个和14.5个氨基酸。vi和人源性抗体的平均κcdr长度同为9个氨基酸并且接近平均长度分别为11.1个和10.6个氨基酸的λ链。人源化小鼠和人源性抗体的可用性允许更多的v基因的多样性，并且使得能够随后对非竞争抗体进行鉴定。[0255]如上文所描述的，从以下来源获得抗体：从产生自小鼠的杂交瘤、通过从抗原阳性的小鼠b细胞直接分离或衍生自从抗原阳性人b细胞克隆的可变区。这些来源的总结在表3中示出。[0256]表3：抗体/可变区来源[0257][0258][0259][0260]实例3：通过结合elisa表征杂交瘤上清液[0261]进行elisa结合测定以鉴定与sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域(rbd)结合的抗体上清液。将由在c端处用6x组氨酸标签和两个myc表位标签(sars‑cov‑2‑s‑rbd‑mmh；另请参见ncbi登录号mn908947.3)表达的sars‑cov‑2的rbd(氨基酸319‑541)组成的蛋白质在4℃下在pbs缓冲液中以1μg/ml涂覆在96孔板上过夜。随后使用0.5％(w/v)的含bsa的pbs的溶液阻断非特异性结合位点。仅将抗体上清液或培养基在psa 0.5％bsa阻断缓冲液中以1:40或1:50稀释，并转移到经过洗涤的微量滴定板。在室温下温育一小时后，将孔洗涤，并用与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司(jacksonimmunoresearch))或与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗小鼠igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)检测板结合的上清液。然后根据制造商的建议使用tmb底物溶液(bd生物科学公司)对板进行显影，并在victorx5读板仪上测量450nm处的吸光度。[0262]如上文所描述的，在sars‑cov‑2‑s‑rbd‑mmh蛋白涂覆在微板的情况下，使用结合elisa法评估抗sars‑cov‑2‑s抗体结合sars‑cov‑2‑s的受体结合结构域(sars‑cov‑2‑s‑rbd)的能力。用hrp缀合的抗‑hfc或抗‑mfc抗体检测与涂覆在96孔微量滴定板上的sars‑cov‑2‑s‑rbd‑mmh结合的单点抗体上清液。[0263]三个试验的结合结果汇总于表4中。指示了sars‑cov‑2结合信号(吸光度450nm)，每个实验提供仅培养基背景作为阴性参考。标记有ic(不确定)的样品的板具有实验异常，并且因此所述样品报告为无值。如与仅培养基对照比较所示出的，测试的上清液显示出与sars‑cov‑2‑s‑rbd的大量结合。[0264]表4：上清液与sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域的结合[0265][0266][0267]实例4：抗体与表达sars‑cov‑2‑s的病毒样颗粒的结合[0268]为了研究一组抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体结合sars‑cov‑2纤突糖蛋白的能力，开发了在基于电化学发光的检测平台(msd)中使用表达sars‑cov‑2纤突蛋白的病毒样颗粒(vlp)进行体外结合测定。[0269]为了瞬时表达sars‑cov‑2纤突蛋白(ncbi登录号mn908947.3，氨基酸16‑1211；seqidno:833)，将缺乏糖蛋白g(vsvδg)的水泡性口炎病毒(vsv)用s‑cov‑2纤突蛋白进行假型化(vsv‑sars‑cov‑2‑s)并在hek293t细胞中产生。作为阴性结合对照，将vsvδg用vsvg蛋白(vsv‑g)进行假型化。[0270]根据以下程序进行实验。将上文所描述的两种类型的vlp稀释于pbs中，接种到96孔碳电极板(多阵列高结合板，msd)中，并在4℃下温育过夜，以允许vlp粘附。将非特异性结合位点在室温下用含2％bsa(w/v)的pbs阻断1小时。将含有从sarscov‑2免疫小鼠或受感染人血清产生的抗体的上清液以及在1xpbs 0.5％bsa缓冲液中以1:10或1:20稀释的仅培养基对照添加到板结合的颗粒。然后将板在室温下摇动温育1小时，然后使用aquamax2000洗板机(mds分析技术公司(mdsanalyticaltechnologies))将板用1xpbs洗涤以去除未结合的抗体。在室温下用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)或sulfo‑tagtm缀合的抗小鼠igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)对板结合的抗体进行1小时的检测。洗涤后，根据制造商建议的程序用读取缓冲液(msd)对板进行显影，并用sector成像仪600(mesoscaledevelopment)仪器记录发光信号。捕获直接结合信号(在rlu中)，并计算出表达sars‑cov‑2‑s的vlp与无关vlp的比率。[0271]如上文所描述的，使用免疫结合测定评估抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与表达sars‑cov‑2‑s的vlp的结合相较于与无关的表达vsv的vlp结合的能力。用稀释度为1:10或1:20的抗体上清液对96孔高结合平板(msd)上的固定的vlp进行单点结合，结合1小时，并使用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg或抗小鼠igg抗体进行检测。将来自电化学发光的结合信号记录在sector成像仪600(msd)上。测定抗体与vlp的结合的rlu值。比较表达sars‑cov‑2‑s的vlp结合信号与对照vlp来计算比率。[0272]来自三个实验的结合结果汇总于表5中。从表达sars‑cov‑2‑s的vlp观察到的信号指示结合，而与阴性vlp的比较则提供了相对背景。仅培养基样品提供了二级抗体与没有上清液的样品的结合的基线信号。在表达sars‑cov‑2‑s的vlp上，46种抗体的特异性结合比仅培养基样品(20‑35rlu)高出>4倍，结合信号的范围为85‑13,600rlu。表达sars‑cov‑2‑s的vsv:vsv‑vlp(阴性对照)的比率的范围为1.1‑22.7，其中许多在vsv‑vlp上具有高背景。mab11002的比率为0.9可能是由于上清液样品中的单克隆抗体的浓度较低。[0273]表5：sars‑cov‑2‑svlp结合vsv‑sars‑cov‑2‑s假病毒进行的体外中和测定。[0278]如上文所描述的，通过用对sars‑cov‑2纤突蛋白进行编码的质粒瞬时转染293t细胞来产生vsv假型化病毒。在使用125μllipofectamineltx、30μlplus试剂和高达3mlopti‑mem转染15μg/板纤突蛋白dna前一天，在dmem完全培养基中将细胞以每板1.2×107个细胞接种在15cm的板中。转染后24小时，将细胞用10mlpbs洗涤，然后在10ml的opti‑mem中用0.1vsvδg:mneon病毒的moi感染。将病毒在细胞上温育1小时，每10分钟轻轻摇动一次。将细胞用10mlpbs洗涤3次，然后用20ml感染培养基覆盖，然后在37℃、5％co2下温育24小时。将上清液收集在冰上的250ml离心管中，然后以3000rpm离心5分钟以沉淀任何细胞碎片，在冰上等分，然后冷冻到‑80℃。在用于中和测定中之前，在vero细胞上测试感染性。这个材料将被称为vsv‑sars‑cov‑2‑s。[0279]用vsv‑sars‑cov‑2‑s进行中和测定[0280]在第1天，将vero细胞以80％汇合度接种在t225烧瓶中。对于种子细胞，将培养基从细胞去除，将细胞用20mlpbs(gibco：20012‑043)洗涤，并添加5mltryple并在37℃下温育～5分钟，直到细胞脱落为止。添加5ml的完整dmem使胰蛋白酶失活，并上下移液以分配细胞。为了计数重悬细胞，将20,000个vero细胞平板接种在96孔黑色聚苯乙烯微板(康宁公司(corning)：3904)中的每孔100μl预热的完整dmem中。[0281]在第2天，将vsv‑sars‑cov‑2‑s在冰上解冻，并用感染培养基1:1稀释。[0282]在v型底96孔板中，在60ul感染培养基中产生每种上清液的稀释液。对于培养基(阴性)对照，将60μl的经过稀释的条件培养基添加到孔。除培养基对照孔外，向每个孔添加60μl的经过稀释的vsv‑sars‑cov‑2‑s。向这些孔添加60μl的感染培养基。然后将假病毒与上清液稀释液在室温下一起温育30分钟。将培养基从vero细胞板去除，将100μl的上清液/假病毒混合物转移到细胞，并将板在37℃、5％co2下温育24小时。1:4和1:20(并且针对一些样品，1:100)的最终上清液稀释度用于评估vsv‑sars‑cov‑2‑s假病毒的中和。[0283]在第3天，在温育24小时后，将上清液从细胞孔去除，并用100μl的pbs置换。然后在带有minimax成像细胞仪的spectramaxi3上对板进行读取。[0284]使用中和荧光聚焦测定评估抗sars‑cov‑2‑s抗体中和基于vsv的表达sars‑cov‑2‑s的假型化病毒的能力。三个测定的结合结果总结如下。与模拟上清液对照相比，每种稀释度下的抗体的中和效力表示为百分比。所有抗体展现出中和能力，并且特别是对于以1:100评价的一组抗体，示出较高中和的抗体可以表示更有效的中和能力。[0285]表6：vlp的中和[0286][0287][0288]*nt：未测试到[0289]实例6：抗体在抗体依赖性细胞介导的毒性替代测定中的表征[0290]在使用报告基因细胞和与抗体结合的靶细胞的替代生物测定中测量了靶向sars‑cov‑2纤突蛋白的抗体与fcγr3a(在自然杀伤(nk)细胞上显著表达的fc受体，其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc))相互作用的能力。这个测定使用的是被工程化成在转录因子nfat(nfat‑luc)以及高亲和力人fcγr3a176val同种异型受体(jurkat/nfat‑luc/hfcγr3a176val)的控制下表达报告基因萤光素酶的jurkatt细胞。靶细胞是工程化的表达人cd20的jurkatt细胞(用作与靶向cd20的人igg1抗体的阳性对照)和受强力霉素诱导型启动子控制的全长sars‑cov‑2纤突蛋白。将报告基因细胞与靶细胞一起温育，并且fcγr3a通过与靶细胞结合的人igg1抗体的fc结构域的结合导致报告基因细胞中的转录因子nfat活化并驱动荧光素酶的表达，然后通过发光读数对所述荧光素酶的表达进行测量。[0291]jurkatt细胞被工程化成组成型表达全长人cd20(ncbi登录号为np_690605.1的氨基酸m1‑p297)、tet3g反式活化蛋白(使用takarapef1α‑tet3g载体克隆的，目录号631167)以及强力霉素诱导型全长sars‑cov‑2纤突蛋白(ncbi登录号yp_009724390.1的氨基酸m1‑t1273)。对工程化的表达jurkat/tet3g/hcd20/sars‑cov2纤突蛋白的细胞进行分选以使纤突蛋白进行高表达，并且随后维持在rpmi 10％无tet的fbs p/s/g 500μg/mlg418 1μg/ml嘌呤霉素 250μg/ml潮霉素生长培养基中。[0292]jurkatt细胞被工程化成稳定表达经活化的t细胞的核因子(nfat)荧光素酶报告基因构建体以及高亲和力人fcγr3a176val同种异型受体(ncbi登记号p08637var_003960的氨基酸m1‑k254)。将工程化报告基因细胞维持在rpmi1640 10％fbs p/s/g 0.5μg/ml嘌呤霉素 500μg/mlg418生长培养基中。[0293]在开始替代adcc测定之前的36小时，在含1μg/ml强力霉素的rpmi 10％无tet的fbs p/s/g细胞培养基(西格玛公司(sigma))中诱导5×105个靶细胞/ml。实验前一天，将报告基因细胞在rpmi1640 10％fbs p/s/g 0.5μg/ml嘌呤霉素 500μg/mlg418生长培养基中分裂成7.5×105个细胞/ml的密度。[0294]简而言之，在实验当天，将靶细胞和报告基因细胞转移到测定培养基(rpmi 10％无tet的fbs p/s/g)中，并以3:2的比率(3×104个靶细胞/孔和2×104个报告基因细胞/孔)添加到384孔白色微量滴定板中，然后添加不同浓度的抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液。每个板上包含阳性对照(带有人igg1的cd20抗体)样品和不含抗体的阴性对照样品以使抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液的检测到的adcc活性归一化。将板在37℃/5％co2下温育5小时，然后添加等体积的one‑glotm(普洛麦格公司(promega))试剂以裂解细胞并检测荧光素酶活性。在多标签读板仪envision(珀金埃尔默公司(perkinelmer))上以相对光单位(rlu)捕获发射的光，并使用以下等式对数据进行分析和归一化：[0295][0296]抗sars‑cov‑2‑s抗体活化fcγr3a受体的能力在替代adcc测定中通过将jurkat/nfat‑luc/fcγr3a176val用作报告基因细胞并将jurkat/hcd20/sars‑cov2纤突用作靶细胞进行了评价。测试的每个抗体含有igg1结构域。[0297]表7汇总了结果，其示出了原始荧光素酶活性，并且指示了计算出的阳性对照的％。观察到一定范围的adcc活性％，这表明抗体上清液使fcγr3a活化。所有样品展现出替代adcc活性的某种度量，并且抗体上清液中的10个抗体上清液展现出的替代adcc活性比在阳性对照中观察到的更好。[0298]表7：抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液的adcc替代活性。[0299]mabadcc平均rluadcc(活性(％))mab1091311,480111.9mab1091421,960265.8mab1091514,280153mab1093213,020108.8mab109339,74068.5mab1093411,68092mab1093511,54090.4mab1093615,160133.8mab1093712,340100.1mab1092015,480137.8mab1092110,08067.7mab109229,14056.3mab1092313,340107.1mab109247,22033mab109308,90053.4mab1093812,960102.5mab109399,44059.7mab1094012,520106.2mab1094110,34077.2mab109827,90059.4mab1098467806.8mab1098558402.8mab1098662004.4mab109871202029.4mab1098872008.7mab109891020021.5mab109691050023.1mab10970764010.6mab10971748010mab1096463805.1mab1096567806.9mab10966708010.4mab1096767408.6mab1095469409.8mab1095567408.7mab1095667608.8mab10957712010.8mab109771298033.8[0300]实例7：抗sars‑cov‑2‑s抗体结合特异性测定[0301]进行luminex结合测定以测定抗sars‑cov‑2‑s抗体与一组抗原的结合。对于这个测定，将抗原通过链霉亲和素胺偶联或捕获到路明克斯(luminex)微球，如下：将大约1千万个magplex微球(路明克斯公司(luminexcorp.)，magplex微球，目录号mc10000和mc12000)通过在ph6.2的500μl0.1mnapo4(活化缓冲液)中涡旋而重新悬浮并且然后离心以去除上清液。因为微球对光敏感，所以使其避光。将微球重新悬浮于160μl的活化缓冲液中，并将羧酸酯基团(‑cooh)通过添加20μl的50mg/mln‑羟基琥珀酰亚胺(nhs，赛默飞世尔科技公司(thermoscientific)，目录号24525)、然后添加20μl的50mg/ml1‑乙基‑3‑[3‑ꢀ二甲基氨基丙基]碳二亚胺(edc，赛默飞世尔科技公司，目录号22980)在25℃下活化。10分钟后，通过添加ph5的600μl50mmmes(偶联缓冲液)将反应的ph降低到5.0，并将微球涡旋并离心以去除上清液。将经活化的微球立即与500μl的含25μg/ml的蛋白质抗原或链霉亲和素的偶联缓冲液混合，并在25℃下温育两小时。将偶联反应通过添加ph8.0的50μl的1mtris‑hcl淬灭，并将微球涡旋、离心并用800μl的0.005％pbs(吐温(tween)200.05％)洗涤三次，以去除未偶联的蛋白质和其它反应组分。将微球以1千万个微球/ml重新悬浮于1ml的pbs2％bsa0.05％叠氮化钠中。为了对抗原进行链霉亲和素捕获，将500μl的含12.5μg/ml的生物素化蛋白的pbs溶液添加到链霉亲和素偶联的微球并在25℃下温育一小时。将微球涡旋、离心并用800μl的pbs洗涤三次，并且然后使用500μl的含30mm生物素(密理博西格玛公司(millipore‑sigma)，目录号b4501)的ph8.0的0.15mtris阻断。将微球温育30分钟，然后涡旋、离心并用800μl的pbs洗涤三次。将微球以1千万个微球/ml重新悬浮于1ml的pbs2％bsa0.05％叠氮化钠中。[0302]将用于不同蛋白质和生物素化蛋白的微球以2700个珠粒/ml混合，并将75μl的微球平板接种在96孔procartaplex平底板(赛默飞世尔科技公司，目录号：epx‑44444‑000)的每个板中，并与25μl的含有抗体的单独的抗sars‑cov‑2上清液混合。将样品和微球在25℃下温育两小时，并且然后用200μl的含有0.05％吐温20的dpbs洗涤两次。为了检测抗体与单独的微球结合的水平，添加100μl的含2.5μg/mlr‑藻红蛋白偶联的山羊f(ab')2抗人κ(南方生物技术公司(southernbiotech)，目录号2063‑09)的阻断缓冲液(用于含有鼠fc区的抗体)或100μl的含1.25μg/mlf(ab')2片段特异性的r‑藻红蛋白亲和纯化f(ab')2片段山羊抗小鼠igg(杰克逊免疫研究实验室有限公司，目录号：115‑116‑072)的阻断缓冲液(用于含有人fc区的抗体)，并将其在25℃下温育30分钟。30分钟后，将样品用200μl的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮于150μl的洗涤缓冲液中。在路明克斯flexmap(路明克斯公司)和路明克斯软件版本4.3(路明克斯公司)中对板进行读取。测定中使用的sars‑cov‑2蛋白如下：[0303]rbd_(r319‑f541).mmh：seqidno:829[0304]rbd_(r319‑f541).mfc：seqidno:830[0305]rbd_(r319‑f541).hfc：seqidno:831[0306]路明克斯结合的结果在表8和表9中示出为中值荧光强度(mfi)信号强度。结果示出46个抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液与sars‑cov‑2‑srbd蛋白特异性结合。这些结果还示出这些抗体中的五个抗体与sars冠状病毒纤突rbd蛋白交叉反应，其结合信号大于1000mfi。[0307]表8：sars‑cov‑2纤突rbd、sars‑cov‑2纤突s1、sarsrbd、sars纤突s1、mers纤突和mersrbd蛋白与抗sars‑cov‑2单克隆抗体(含有hfc)的结合信号(mfi)[0308][0309][0310]表8(续)[0311][0312]表9：sars‑cov‑2rbd、sars‑cov‑2纤突s1、sarsrbd、sars纤突s1、mers纤突和mersrbd蛋白与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体(含有mfc)的结合信号(mfi)[0313][0314]表9(续)[0315][0316]实例8：抗sars‑cov‑2‑s抗体多样性测定[0317]进行结合测定以测定抗sars‑cov‑2‑s抗体的结合曲线。对于这个测定，如上文针对路明克斯结合测定所描述的，抗原是胺偶联的。简而言之，将用于16个不同珠粒区的大约9百万个magplex微球(路明克斯公司，magplex微球，目录号magplexmc10000和mc12000)通过在ph6.2的500μl0.1mnapo4中涡旋而重新悬浮并且然后离心以去除上清液。将微球重新悬浮于160μl的活化缓冲液中，并将羧酸酯基团(‑cooh)通过添加20μl的50mg/mln‑羟基琥珀酰亚胺(nhs，赛默飞世尔科技公司，目录号24525)、然后添加20μl的50mg/ml1‑乙基‑3‑[3‑二甲基氨基丙基]碳二亚胺(edc，赛默飞世尔科技公司，目录号22980)在25℃下活化。10分钟后，通过添加ph5的600μl的50mmmes(偶联缓冲液)将反应的ph降低到5.0，并将微球涡旋并离心以去除上清液。将经活化的微球立即与500μl的含20μg/ml的sars‑cov‑2纤突蛋白(rbd)(r319‑f541)‑mmh的偶联缓冲液混合，并在25℃下温育两小时。将偶联反应通过添加ph8.0的50μl的1mtris‑hcl淬灭，并将微球涡旋、离心并用1000μl的pbs洗涤三次。将微球以9百万个微球/ml重新悬浮于250μl的pbs中。[0318]对16个含有胺偶联的蛋白质的微球区中的15个微球区进行如下修饰以进行结合测定：将微球用pbs5％dmso洗涤两次，并将500μl的化学品或酶按照制造建议溶解并以10nm添加到上文所描述的胺偶联的微球。随后将其涡旋并在室温下旋转温育2小时。用pbs2％bsa洗涤微球3次。将微球以9百万个微球/ml重新悬浮于1ml的pbs中。[0319]将经蛋白质修饰的微球和未经蛋白质修饰的(完整的)微球以2700个珠粒/ml混合，并将75μl的微球平板接种在96孔procartaplex96孔平底板(赛默飞世尔科技公司，目录号：epx‑44444‑000)的每个板中，并与25μl的含有抗体的单独的抗sars‑cov‑2‑s上清液混合。将样品和微球在25℃下温育两小时，并且然后用200μl的含有0.05％吐温20的dpbs洗涤两次。为了检测抗体与单独的微球结合的水平，添加100μl的含2.5μg/mlr‑藻红蛋白偶联的山羊f(ab')2抗人κ(南方生物技术公司，目录号2063‑09)的阻断缓冲液(用于含有hfc的抗体)或100μl的含1.25μg/mlf(ab')2片段特异性的r‑藻红蛋白亲和纯化f(ab')2片段山羊抗小鼠igg(杰克逊免疫研究实验室有限公司，目录号115‑116‑072)的阻断缓冲液(用于含有mfc的抗体)或100μl的含1.25μg/mlr‑藻红蛋白抗his(生物传奇公司(biolegend)，目录号362603)的阻断缓冲液(用于ace‑2对照，r&d，目录号933‑zn)，并将其在25℃下温育30分钟。30分钟后，将样品用200μl的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮于150μl的洗涤缓冲液中。在flexmap(路明克斯公司)和路明克斯软件版本4.3(路明克斯公司)中对板进行读取。[0320]路明克斯分箱的结果在表10中示出为中值荧光强度(mfi)信号强度。为了确定簇，相对于完整蛋白质(未经修饰的微球)对数据进行归一化并聚类。将46种抗sars‑cov‑2抗体分类为含有2种或更多种抗体的9个簇，并将11种抗体分类为单个节点。基于层次聚类和树状图的这些结果来分配簇。这些结果示出46种抗sars‑cov‑2‑s抗体上清液具有不同的结合特性和曲线，这表明收集了与sars‑cov‑2纤突蛋白上的不同表位结合的抗体。[0321]表10：抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与sars‑cov‑2‑srbd.mmh(未经修饰的和经化学或酶修饰的)结合信号(mfi)和簇分配[0322][0323][0324]表10(续)[0325][0326][0327]实例9：抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体的biacore结合动力学[0328]使用基于实时表面等离振子共振的biacoret200/biacore8k生物传感器测定来自来自chot细胞或来自杂交瘤的初级上清液的不同sars‑cov‑2‑s抗体的平衡解离常数(kd)。所有结合研究在25℃下在10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph为7.4的(hbs‑et)运行缓冲液中进行。首先将biacorecm5传感器芯片表面通过与小鼠抗人fc特异性mab或兔抗小鼠fcγ单克隆抗体(ge，目录号br‑1008‑38)进行胺偶联来衍生化以捕获抗sars‑cov‑2抗体。对用c端myc‑myc‑六组氨酸标签表达的人sars‑cov‑2rbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mmh)、用c端小鼠igg2a表达的sars‑cov‑2rbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mfc)或用c端人igg1(sars‑cov‑2rbd‑hfc)表达的sars‑cov‑2rbd细胞外结构域进行结合研究。将在hbs‑et运行缓冲液中制备的单一浓度的sars‑cov‑2rbd‑mmh(100nm)；sars‑cov‑2rbd‑mfc(50nm)或sars‑cov‑2rbd‑hfc(50nm)以30微升/分钟的流动速率注射1.5分钟，同时在hbs‑et运行缓冲液中监测抗体结合的不同sars‑cov‑2rbd试剂的解离2分钟。在每个循环结束时，使用10秒注射20mm磷酸的小鼠抗人fc特异性单克隆抗体表面或40秒注射ph1.5的10mm甘氨酸、hcl的兔抗小鼠fcγ特异性多克隆抗体再生sars‑cov‑2rbd抗体捕获表面。缔合率(ka)和解离率(kd)通过使用bia评价软件v3.1或biacore洞察评价软件v2.0或曲线拟合软件将实时结合传感图拟合到具有质量传输限制的1:1结合模型来测定。结合解离平衡常数(kd)和解离半衰期(t1/2)是根据动力学速率如下计算的：[0329]并且[0330]不同的sars‑cov‑2单克隆抗体与本发明的不同的抗sars‑cov‑2rbd试剂在25℃下结合的结合动力学参数示出于表11和12中。[0331]表11：sars‑cov‑2rbd‑mmh与抗sars‑cov‑2单克隆抗体在25℃下结合的结合动力学[0332][0333][0334]表12：sars‑cov‑2rbd‑mfc或sars‑cov‑2rbd‑hfc与抗sars‑cov‑2单克隆抗体在25℃下结合的结合动力学[0335][0336][0337]*：在实验条件下基于对解离速率常数和解离半衰期进行的测量的极限的估计值。[0338]实例10：通过阻断elisa来表征抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体[0339]开发了基于elisa的阻断测定以测定抗sars‑cov2‑s抗体阻断sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域(rbd)与人血管紧张素转化酶2(hace2)结合的能力。[0340]实验中使用的sars‑cov‑2蛋白包含在c端处用人igg1的fc部分表达的sars‑cov‑2纤突蛋白(氨基酸arg319到phe541)的受体结合结构域(rbd)部分(sars‑cov‑2rbd‑hfc；参见ncbi登录号mn908947.3)。实验中使用的人ace2蛋白购自r&d系统公司(r&dsystems)并包含具有c端10x组氨酸标签的氨基酸谷氨酰胺18到丝氨酸740(hace2‑his；ncbi登录号q9byf1)。[0341]使用以下程序进行实验。将单克隆抗五‑his抗体(凯杰公司(qiagen))在pbs中以1μg/ml在4℃下涂覆在96孔微量滴定板上过夜。将hace2‑his受体以0.2μg/ml添加到pbs中并在室温下结合2小时。随后使用0.5％(w/v)的含bsa的pbs的溶液阻断非特异性结合位点。在其它微量滴定板中，将恒定量的10pm或15pm(如表13中所指示的)的sars‑cov‑2rbd‑hfc蛋白与在pbs 0.5％bsa中1:10或1:20稀释的抗体结合。在一小时温育后，将这些抗体‑蛋白质复合物转移到涂覆有hace2‑his的微量滴定板。在室温下温育1.5小时后，将孔洗涤，并用与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗人igg抗体(杰克森)检测板结合的sars‑cov‑2rbd‑hfc蛋白。然后根据制造商的建议使用tmb底物溶液(bd生物科学公司，目录号555214)对板进行显影，并在victorx5读板仪上测量450nm处的吸光度。[0342]通过计算在存在抗体的情况下与不存在抗体的情况下的固定的sars‑cov‑2‑srbd‑hfc浓度的信号的减少％来进行数据分析。在计算中，将每个板的恒定sars‑cov‑2‑srbd‑hfc的样品在不存在抗体的情况下的结合信号称为100％结合或0％阻断；并将仅培养基的样品在不存在sars‑cov‑2rbd‑hfc的情况下的基线信号称为0％结合或100％阻断。[0343]使用阻断elisa形式评估抗sars‑cov‑2‑s抗体阻断sars‑cov‑2‑srbd与人ace2结合的能力。用hrp缀合的抗‑hfc抗体检测到单点测试抗体上清液阻断了10pm或15pmsars‑cov‑2‑srbd‑hfc与在涂覆在96孔微量滴定板上的抗his抗体上呈递的hace2‑his的结合。[0344]三个测定的阻断结果汇总于表13中。指示了sars‑cov‑2‑s结合信号(450nm)和g计算的阻断％。对于测试样品，观察到一定范围的阻断。对于在第6列和第7列中指示na的样品，在第4列和第5列中包含板校正值，因为数据与那些样品发生的单板切换一致。46个抗体上清液中的43个抗体上清液阻断大于50％的sars‑cov‑2‑srbd‑hfc与板涂覆的人ace2的结合，其中所述抗体上清液中的16个抗体上清液阻断>90％的信号。[0345]表13：阻断elisa结果[0346][0347][0348]实例11：通过氢‑氘交换质谱法对针对纤突糖蛋白的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体进行表位作图[0349]进行氢‑氘交换质谱法(hdx‑ms)以测定与mab10989、mab10987、mab10934、mab10933、mab10920、mab10922、mab10936、mab10954、mab10964、mab10977、mab10984和mab10986相互作用的sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域(rbd(氨基酸r319‑f541))的氨基酸残基。对hdx‑ms方法的一般描述在例如以下文献中示出：ehring(1999)《分析生物化学》267(2):252‑259；以及engen和smith(2001)《分析化学》73:256a‑265a。[0350]在集成的hdx/ms平台上进行hdx‑ms实验，所述平台由用于氘标记和淬灭的leaptechdxpal系统、用于样品消化和装载的沃特斯(waters)acquityi级(binary溶剂管理器)、用于分析梯度的沃特斯acquityi级(二元溶剂管理器)以及用于肽质量测量的赛默qexactivehf质谱仪组成。[0351]在pd7.0下，将标记溶液制备为d2o中的pbs缓冲液(10mm磷酸盐缓冲液、140mmnacl和3mmkcl，在25℃下相当于ph7.4)。为了进行氘标记，在各个时间点一式两份地将10μl的rbd蛋白或与上文所列出的12种抗体中的每种抗体预混合的rbd蛋白与90μl的d2o标记溶液在20℃下一起温育。对于mab10989、mab10987、mab10934和mab10933，时间点分别为0分钟(非氘代对照)、5分钟和10分钟。对于mab10920、mab10922、mab10936、mab10954、mab10964、mab10977、mab10984和mab10986，时间点分别为0分钟(非氘代对照)和10分钟。通过向每份样品添加90μl的预冷却的淬灭缓冲液(0.5mtcep‑hcl，4m尿素和0.5％甲酸)以在20℃下温育90秒钟来淬灭氘化反应。然后将淬灭的样品注射到leaptechdxpal系统以进行在线胃蛋白酶/蛋白酶xiii消化。将消化的肽通过c18柱(2.1mmꢀ×5mm，沃特斯)俘获，并通过另一个c18柱(2.1mm×50mm，沃特斯)在‑5℃下以20分钟梯度(对于mab10989、mab10987、mab10934和mab10933)或以10分钟梯度(对于mab10920、mab10922、mab10936、mab10954、mab10956、mab10964、mab10977和mab10984)与0％到90％的流动相b溶液(流动相a溶液：含0.5％甲酸和4.5％乙腈的水，流动相b溶液：含0.5％甲酸的乙腈)分离。通过赛默qexactivehf质谱法以lc‑ms/ms或lc‑ms模式对洗脱的肽进行分析。[0352]使用byonic搜索引擎(proteinmetrics)针对包含rbd蛋白、胃蛋白酶、蛋白酶xiii的氨基酸序列和其反向序列的数据库搜索来自未氘化rbd蛋白样品的lc‑ms/ms数据。使用非特异性酶消化和人糖基化作为常见的变量修饰，将搜索参数设置为默认值。然后将鉴定的肽的列表输入到hdexaminer软件(版本3.1)以计算所有氘化样品的氘摄取(d‑摄取)和氘摄取百分比的差异(δ％d)。氘摄取百分比的差异(δ％d)如下计算。[0353]氘摄取的差异(δd)＝d‑摄取(rbd‑mab)‑d‑摄取(单独的rbd)[0354][0355]从单独的rbd和与mab10989样品复合的rbd两者中鉴定出总共190种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为86.06％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸467‑513(disteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvl)(seqidno:835)的肽显著受mab10989保护。[0356]从单独的rbd和与mab10987样品复合的rbd两者中鉴定出总共187种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为86.06％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸432‑452(cviawnsnnldskvggnynyl)(seqidno:836)的肽显著受mab10987保护。[0357]从单独的rbd和与mab10934样品复合的rbd两者中鉴定出总共188种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为86.06％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸432‑452(cviawnsnnldskvggnynyl)(seqidno:836)、467‑474(disteiyq)(seqidno:837)和480‑513(cngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvl)(seqidno:838)的肽显著受mab10934保护。[0358]从单独的rbd和与mab10933样品复合的rbd两者中鉴定出总共188种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为86.06％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸467‑510(disteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrv)(seqidno:839)的肽显著受mab10933保护。[0359]从单独的rbd和与mab10920样品复合的rbd两者中鉴定出总共75种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为83.27％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸471‑486(eiyqagstpcngvegf)(seqidno:840)和491‑515(plqsygfqptngvgyqpyrvvvlsf)(seqidno:841)的肽显著受mab10920保护。[0360]从单独的rbd和与mab10922样品复合的rbd两者中鉴定出总共86种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸432‑452(cviawnsnnldskvggnynyl)(seqidno:836)的肽显著受mab10922保护。[0361]从单独的rbd和与mab10936样品复合的rbd两者中鉴定出总共81种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为82.07％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸351‑360(yawnrkrisn)(seqidno:842)、432‑452(cviawnsnnldskvggnynyl)(seqidno:836)、467‑486(disteiyqagstpcngvegf)(seqidno:843)和491‑513(plqsygfqptngvgyqpyrvvvl)(seqidno:844)的肽显著受mab10936保护。[0362]从单独的rbd和与mab10954样品复合的rbd两者中鉴定出总共84种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸400‑422(fvirgdevrqiapgqtgkiadyn)(seqidno:845)、453‑486(yrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegf)(seqidno:846)和490‑515(fplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsf)(seqidno:847)的肽显著受mab10954保护。[0363]从单独的rbd和与mab10964样品复合的rbd两者中鉴定出总共109种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为83.67％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸401‑424(virgdevrqiapgqtgkiadynyk)(seqidno:848)和471‑513(eiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvl)(seqidno:849)的肽显著受mab10964保护。[0364]从单独的rbd和与mab10977样品复合的rbd两者中鉴定出总共78种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸351‑364(yawnrkrisncvad)(seqidno:850)和471‑486(eiyqagstpcngvegf)(seqidno:840)的肽显著受mab10977保护。[0365]从单独的rbd和与mab10984样品复合的rbd两者中鉴定出总共88种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸400‑422(fvirgdevrqiapgqtgkiadyn)(seqidno:845)和453‑486(yrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegf)(seqidno:846)的肽显著受mab10984保护。[0366]从单独的rbd和与mab10986样品复合的rbd两者中鉴定出总共84种来自rbd的肽，这表示rbd的序列覆盖率为87.25％。将在mab结合后表现出氘摄取降低5％或更大(即，δ％d值小于‑5％，如‑6％、‑10％，以此类推)的任何肽定义为显著受保护的。对应于rbd的氨基酸400‑422(fvirgdevrqiapgqtgkiadyn)(seqidno:845)、453‑486(yrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegf)(seqidno:846)和490‑515(fplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsf)(seqidno:847)的肽显著受mab10986保护。[0367]总而言之，所测试的大多数中和抗体以覆盖包括ace2界面的rbd残基的方式接触rbd；此外，如图15中所示出的，可以基于其接触rbd表面的模式对抗体进行分组。上述数据也汇总于表14‑25中。[0368]表14：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab时显著受保护的纤突蛋白受体结合结构域(rbd)肽[0369][0370][0371]表15：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10987复合物时显著受保护的纤突蛋白rbd肽[0372][0373]表16：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10934复合物时显著受保护的rbd肽[0374][0375][0376]表17：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10933复合物时显著受保护的rbd肽[0377][0378]表18：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10920复合物时显著受保护的rbd肽[0379][0380][0381]表19：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10922复合物时显著受保护的rbd肽[0382][0383]表20：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10936复合物时显著受保护的rbd肽[0384][0385]表21：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10954复合物时显著受保护的rbd肽[0386][0387][0388]表22：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10964复合物时显著受保护的rbd肽[0389][0390]表23：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10977复合物时显著受保护的rbd肽[0391][0392]表24：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10984复合物时显著受保护的rbd肽[0393][0394][0395]表25：相较于单独的rbd在形成rbd‑mab10986复合物时显著受保护的rbd肽[0396][0397]实例12：sars‑cov‑2野生型和变体纤突蛋白的中和[0398]为了测试抗sars‑cov‑2纤突蛋白抗体是否能够中和sars‑cov‑2变体，针对表达野生型和变体纤突蛋白的一组vsv假型化病毒对这些抗体进行了筛选。通过用对sars‑cov‑2纤突蛋白进行编码的质粒或含有对sars‑cov‑2纤突蛋白氨基酸序列进行编码的已知变体的核苷酸变异的相同质粒瞬时转染293t细胞来产生vsv假型化病毒。通过sanger测序来确认所有质粒。在使用125μllipofectamineltx、30μlplus试剂和高达3mlopti‑mem转染15μg/板纤突dna前一天，在dmem完全培养基(1000mldmem，gibco；100mlfbs，gibco；10mlpsg，gibco)中将细胞以每板1.2×107个细胞接种在15cm的板中。转染后24小时，将细胞用10mlpbs洗涤，然后在10ml的opti‑mem中用0.1vsvδg:mneon病毒的moi感染。将病毒在细胞上温育1小时，每10分钟轻轻摇动一次。将细胞用10mlpbs洗涤3次，然后用20ml感染培养基(1000mldmem，gibco；10ml丙酮酸钠，gibco；7mlbsa，西格玛公司；5ml庆大霉素，gibco)覆盖，然后在37℃、5％co2下温育24小时。将假病毒上清液收集在冰上的250ml离心管中，然后以3000rpm离心5分钟以沉淀任何细胞碎片，在冰上等分，然后冷冻到‑80℃。在用于中和测定中之前，在vero细胞上测试感染性。这个材料将被称为vsvδg:mneon/纤突假病毒或vsvδg:mneon/纤突_(变体氨基酸突变)(例如，vsvδg:mneon/纤突_h49y)。[0399]在第1天，将vero细胞以80％汇合度接种在t225烧瓶中，将细胞用pbs(gibco：20012‑043)洗涤，添加tryple以使细胞从烧瓶脱落，并添加完整dmem以灭活胰蛋白酶。将20,000个vero细胞平板接种在96孔黑色聚苯乙烯微板(康宁公司：3904)中的每孔100μl的预热的完整dmem中。在第2天，将vsvδg:mneon/纤突假病毒在冰上融化并用感染培养基稀释。将抗体在u型底96孔板中稀释，从而在210μl感染培养基中以2倍测定浓度产生每种抗体的稀释液。将120μl的经过稀释的抗体转移到新鲜的u型底板，并向每个板添加培养基和igg1对照抗体。将120μl的经过稀释的假病毒添加到除培养基对照孔之外的每个孔。向这些孔添加120μl的感染培养基。将带有抗体的假病毒在室温下温育30分钟，然后将培养基从vero细胞去除。将100μl的抗体/假病毒混合物添加到细胞，并且然后在37℃、5％co2下温育24小时。在第3天，将上清液从细胞孔去除，并用100μl的pbs置换。在带有minimax成像细胞仪的spectramaxi3上对板进行读取。[0400]除使用非复制型vsv‑sars‑cov‑2‑s病毒测试中和能力之外，还使用sars‑cov‑2病毒测试抗体。将单克隆抗体和抗体组合在dmem(质量生物有限公司(qualitybiological))中连续稀释，补充10％(v/v)热灭活胎牛血清(西格玛公司)，1％(v/v)青霉素/链霉素(孪连生物制品公司(geminibio‑products))和1％(v/v)l‑谷氨酰胺(2mm最终浓度，gibco)(veroe6培养基)到250μl的最终体积。接下来，将250μl的含sars‑cov‑2(wa‑1)(1000pfu/ml)的veroe6培养基添加到每个血清稀释液并添加到250μl培养基作为未经处理的对照。将病毒‑抗体混合物在37℃下温育60分钟。温育后，通过噬菌斑测定来测定混合物的病毒滴度。最后，使用4参数对数曲线拟合到中和百分比数据(graphpad软件，加利福尼亚州拉荷亚)来计算50％噬菌斑减少中和滴度(prnt50)值(相对于未经处理的对照的噬菌斑形成，噬菌斑形成减少50％的血清稀释度)。[0401]在vero细胞中测定对纤突蛋白(s‑wt)的武汉‑hu‑1(ncbi登录号mn908947.3)序列进行编码的表达vsv‑sars‑cov‑2纤突蛋白(s)的假病毒的单独的单克隆抗体的半数最大抑制浓度(ic50)(表26)。大多数抗体在皮摩尔范围(pm)内显示出中和效力，其中有些抗体在纳摩尔(nm)范围内表现出中和效力。[0402]虽然重组ace2能够介导vsv‑纤突假颗粒的中和，但是如先前所报道的，其效力远低于单克隆抗体的效力，相对于最佳中和mab，其效力下降多于1000倍(图10a)。另外，mab10987、mab10989、mab10933和mab10934的有效中和活性在中和测定中得到证实，包含中和veroe6细胞中的sars‑cov‑2(图10b)。所有中和测定跨四个mab(mab10987、mab10989、mab10933和mab10934)产生类似的效力，并且没有组合显示出协同中和活性(图10b)。[0403]表26：针对vero细胞中的vsv‑sars‑cov‑2‑s假颗粒的野生型菌株的mab中和效力(ic50(m))[0404][0405][0406]从表示全球循环菌株的7000多个公开可用的sars‑cov‑2序列鉴定了纤突(s)蛋白中的氨基酸变体，并将其克隆到vsv假颗粒中。用对变体进行编码的假颗粒进行中和测定以评估每种变体对单克隆抗体的中和效力的影响。表27展示了针对对变体进行编码的假颗粒的单克隆抗体相对于单一浓度为5μg/ml的sars‑cov‑2纤突(s‑wt)的相对中和效力。对于每个单独的抗体和变体，捕获相对于s‑wt的中和百分比。除mab10985和r408i变体以外，没有抗体在5μg/ml浓度下展示出中和效力丧失。这些数据证实了针对全球循环sars‑cov‑2纤突变体的单克隆抗体的广泛的功能性中和覆盖率。[0407]为了进一步询问s蛋白变体对单克隆抗体的中和效力的影响，运行了完整中和曲线以测定针对位于s蛋白的受体结合结构域(rbd)内的变体的亚群的最有效的中和抗体的ic50值。表28示出了每种变体假颗粒的ic50中和值。在假颗粒中和测定之间可以观察到高达3倍的固有变异性，并且其并非指示中和效力的变化。这些数据证实了抗体保留其针对一组不同的s蛋白rbd变体的中和效力。[0408]表27.vero细胞中的抗体浓度为5μg/ml的对s蛋白进行编码的vsv‑sars‑cov‑2变体的相对中和[0409][0410][0411]表27(续)[0412][0413][0414]表28.vero细胞中vsv‑sars‑cov‑2‑srbd变体的中和ic50(m)[0415][0416]表28(续)[0417][0418]实例13：经纯化的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体的biacore结合动力学[0419]使用基于实时表面等离振子共振的biacoret200/biacore8k生物传感器测定与经过纯化的chot抗sars‑cov‑2单克隆抗体(mab)结合的不同的sars‑cov‑2rbd试剂的平衡解离常数(kd)。所有结合研究在25℃和37℃下在10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph为7.4的(hbs‑et)运行缓冲液中进行。首先将biacorecm5传感器芯片表面通过与小鼠抗人fc特异性mab(再生元公司(regeneron)，mab2567)进行胺偶联来衍生化以捕获抗sars‑cov‑2bmab。对用c端myc‑myc‑六组氨酸表达的人sars‑cov‑2rbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mmh)和用c端小鼠igg2a表达的sars‑cov‑2rbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mfc)进行结合研究。使用这些试剂允许对抗体分别结合单体和二聚体rbd肽的能力进行测试。[0420]在hbs‑et运行缓冲液中制备不同浓度的hsars‑cov‑2rbd‑mmh(90nm‑3.33nm，3倍稀释度)和sars‑cov‑2rbd‑mfc(30nm‑1.11nm，3倍稀释度)，并将其以50微升/分钟的流动速率注射3分钟，同时在hbs‑et运行缓冲液中监测mab结合的不同sars‑cov‑2rbd试剂的解离6‑10分钟。在每个循环结束时，使用12秒注射20mm磷酸的小鼠抗人fc特异性mab表面再生sars‑cov‑2rbdmab捕获表面。缔合率(ka)和解离率(kd)通过使用bia评价软件v3.1或biacore洞察评价软件v2.0或曲线拟合软件将实时结合传感图拟合到具有质量传输限制的1:1结合模型来测定。结合解离平衡常数(kd)和解离半衰期(t1/2)是根据动力学速率如下计算的：[0421]并且[0422]不同的sars‑cov‑2mab与本发明的不同的抗sars‑cov‑2rbd试剂在25℃和37℃下结合的结合动力学参数分别示出于表29到32中。[0423]表29：sars‑cov‑2rbd‑mmh与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在25℃下结合的结合动力学参数。[0424][0425][0426]表30：sars‑cov‑2rbd‑mmh与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在37℃下结合的结合动力学参数。[0427][0428][0429]表31：sars‑cov‑2rbd‑mfc与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在25℃下结合的结合动力学参数。[0430][0431][0432]表32：sars‑cov‑2rbd‑mfc与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在37℃下结合的结合动力学参数[0433][0434][0435]实例14：如通过elisa测定的，抗sars‑cov‑2抗体阻断rbd与hace2的结合[0436]使用基于elisa的阻断测定以测定抗sars‑cov‑2抗体阻断sars‑cov‑2纤突蛋白受体结合结构域(rbd)与其受体、人血管紧张素转化酶2(hace2)结合的能力。[0437]这个测定中使用的sars‑cov‑2蛋白包含在c端处用人igg1的fc部分表达的sars‑cov‑2纤突蛋白(氨基酸arg319‑phe541)的受体结合结构域(rbd)部分(sars‑cov‑2rbd‑hfc)。实验中使用的人ace2蛋白购自r&d系统公司并由具有c端10x组氨酸标签的氨基酸gln18‑ser740组成(hace2‑his；ncbi登录号q9byf1)。[0438]使用以下程序进行实验。将单克隆抗五‑his抗体(凯杰公司)在pbs中以1μg/ml在4℃下涂覆在96孔微量滴定板上过夜。将hace2‑his受体以0.2μg/ml添加到pbs中并在室温(rt)下结合两小时。随后使用0.5％(w/v)的含bsa的pbs的溶液阻断非特异性结合位点。在其它微量滴定板中，将恒定量的100pm的sars‑cov‑2rbd‑hfc蛋白与抗sars‑cov‑2抗体和同种型igg1抗体对照在pbs 0.5％bsa中以0.0008nm到50nm的稀释度结合。温育一小时后，将混合物溶液转移到微量滴定板涂覆的hace2‑his。在室温下温育1.5小时后，将孔洗涤，并用与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗人igg抗体(杰克森)检测板结合的sars‑cov2。然后根据制造商的建议使用tmb底物溶液(bd生物科学公司，#555214)对板进行显影，并在victorx5读板仪上测量450nm处的吸光度。[0439]使用prismtm软件(graphpad)内的s形剂量应答模型分析结合数据。计算出的ic50值被定义为阻断50％的sars‑cov‑2rbd‑hfc与板涂覆的hace2‑his结合所需的抗体浓度，将其用作阻断效力的指标。阻断百分比是基于使用这个公式测试的最高抗体浓度下观察到的背景校正结合信号定义的，并且针对所有测试的抗体进行了报告：[0440][0441]在最高测试浓度下阻断小于或等于50％的结合的抗体被分类为非阻断剂，并且未报告那些抗体的ic50值。[0442]使用阻断elisa评估抗sars‑cov‑2抗体阻断sars‑cov‑2rbd与人ace2结合的能力。在这个测定中，用各种浓度的抗sars‑cov‑2‑s抗体滴定100pmsars‑cov‑2rbd‑hfc，并且评估了抗体的存在对rbd与hace2‑his结合的抑制。用hrp缀合的抗‑hfc抗体检测板结合的rbd‑hfc。[0443]抗sars‑cov‑2‑s抗体在最高测试浓度下的阻断ic50和最大阻断汇总于表33中，并且阻断曲线在图1‑8中示出。在所测试的46种抗体中，44种抗体显示出对rbd.hfc与hace‑2结合的抗体浓度依赖性阻断。在最高测试抗体浓度下，ic50值的范围为41pm到4.5nm，并且最大阻断范围为55％到约100％。在所测试的46种抗体中，两种抗体在测定条件下未示出阻断活性。如所期望的，无关的同种型对照抗体未示出阻断活性。[0444]表33：抗sar‑cov‑2抗体对纤突rbd‑hfc与固定的人ace‑2结合的阻断效力[0445][0446][0447]注意：将100pm的rbd‑hfc用抗sars‑cov‑2‑s抗体以从50nm开始的系列稀释度滴定，并将rbd‑hfc结合在具有10x组氨酸标签的固定的hace2上，并用hrp缀合的抗hfc抗体进行检测。nbd；未检测到阻断。[0448]实例15：mab10987、mab10989、mab10933和mab10934之间的交叉竞争[0449]在交叉竞争结合测定中检查了mab10987、mab10989、mab10933和mab10934(图11)，从而鉴定出几对具有皮摩尔中和效力的非竞争性mab，其可能潜在地组合以形成抗体混合物，例如mab10987和mab0933。[0450]抗sars‑cov‑2‑smab的表位分箱使用具有10mmhepes、150mmnacl、0.05％(v/v)吐温‑20、ph7.4、1mg/mlbsa的运行缓冲液的富迪(fortebio)octethtx生物层干涉仪(富迪生物分子装置公司(moleculardevicesfortebiollc)，加利福尼亚州菲蒙)以预混合夹心形式进行，所述预混合夹心形式涉及mab以成对组合方式相互竞争与sars‑cov‑2rbd‑mmh蛋白结合。在30℃下以1000rpm连续搅拌进行测定。在运行缓冲液中获得初始基线后，将20μg/ml的抗covid19mab捕获到抗人fc(ahc)生物传感器尖端上持续300秒。为了阻断ahc生物传感器尖端上剩余的游离不饱和结合位点，将所有传感器暴露于含有100μg/ml无关igg1的阻断溶液持续240秒。这个过程之后，将生物传感器浸入含有100nmsarscov‑2rbd‑mmh蛋白和600nm的第二mab的抗covid19mab结合位点的预混合溶液的孔中持续300秒。记录每个步骤处的结合应答，并通过将自阻断mab竞争性对照从数据集中减去来使特定信号归一化。用使用表位分箱的octet数据分析ht10.0软件进行数据分析。[0451]将交叉竞争结合测定与上文所描述的hdx‑ms结果进行比较深入了解了非竞争性抗体对可以同时结合rbd并且可以因此成为治疗性抗体混合物的理想配体的机制。mab10987和mab10933表示此类抗体对。mab10933靶向ace2界面的一个边缘上的纤突状环区。在所述区内，显示出最显著受mab10933hdx保护的残基面朝上，这表明mab10933的fab区从顶部方向与rbd结合，其中mab10933将与ace2发生显著碰撞。为了避免与mab10933竞争，mab10987仅从正面或左下侧(在图12中的mab10987的前视图中)与hdx定义的受保护区结合。这与上文所描述的中和数据一致，因为mab10987会将其定向成处于极有可能干扰ace2的位置。[0452]实例16：抗体结合的纤突蛋白的结构测定[0453]为了更好地了解mab10933和mab10987与纤突蛋白rbd的结合，通过低温电子显微镜(cryoem)进行了结构分析。使用fabalactica试剂盒(genovis)分离mab10933和mab10987的fab片段。将600μg的mab10933fab和600μg的mab10987fab与300μg的sars‑cov‑2‑srbd混合并在冰上温育～1小时，然后注射到平衡到50mmtrisph7.5、150mmnacl的superdex200增加凝胶过滤柱中。收集含有mab10933fab‑mab10987fab‑rbd复合物的峰级分，并将其使用10kdamwco离心过滤器浓缩。对于cryoem网格制备，将蛋白质样品稀释到1.5mg/ml，并添加0.15％pmal‑c8amphipol。将3.5μl的蛋白质沉积到刚用等离子体清洁的ultraufoil网格(1.2/1.3，300目)上。使用滤纸将多余溶液吸干，并使用vitrobotmarkiv将其速冻成液态乙烷。将cryoem网格转移到配备有k3检测器(加坦公司(gatan))的titankrios(赛默飞世尔公司)。使用epu(赛默飞世尔公司)以对应于的像素大小的105,000倍的放大率收集影片。使用每秒每像素15个电子的剂量速率，并且每个影片为2秒，对应于每个电子的总剂量。[0454]所有cryoem数据处理均使用cryosparcv2.14.2进行。使用补丁运动校正和补丁ctf估计将2,821个影片对齐。基于估计的散焦值和ctf拟合分辨率，选择2,197张对齐的显微照片进行进一步处理。使用斑点拾取器拾取的一组初始颗粒经过2d分类以生成用于模板拾取的模板。通过模板拾取而拾取的989,553个颗粒经过多轮2d分类以去除未结合的fab和含有不完整复合物的颗粒。从头进行三类重建产生含有对应于mab10933fab‑mab10987fab‑rbd复合物的61,707个颗粒的单个类别。这个类别中的颗粒的异质性细化、然后非均匀细化导致含有用于模型构建的含有48,140个颗粒的分辨率(fsc＝0.143)图。将rbd(获取自pdb代码6m17)和两个fab(获取自先前的抗体结构，除来自pdb代码5u15的mab10987的λ轻链之外)的模型手动放置到这个图中。然后使用coot手动重建这些模型，并使用phenix根据图对实际空间进行细化。[0455]确认上文所描述的数据后，sars‑cov‑2纤突rbd与mab10933和mab10987的fab片段结合的复合物的单颗粒cryoem示出了这个混合物中的两种抗体可以与rbd的不同区同时结合(图13a、图13b和图14)。复合物的标称分辨率为的3d重构图示出了两个fab片段在rbd的不同表位处结合，从而证实其是非竞争性抗体。mab10933在rbd的顶部结合，从而与ace2的结合位点广泛重叠。另一方面，mab10987的表位位于rbd的一侧，充分远离mab10933表位，并且与ace2结合位点几乎没有重叠。[0456]实例17：抗sars‑cov‑2‑smab之间的交叉竞争[0457]在octethtx生物传感器平台(颇尔富迪生物公司)上使用实时、无标记生物层干涉(bli)测定来测定抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体(mab)之间的结合竞争。实验是在板以1000rpm的速度摇动的情况下在25℃下在10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、1mg/mlbsa、ph为7.4的(hbs‑ebt)缓冲液中进行的。为了评估两种mab是否能够彼此竞争与用c端myc‑myc‑六组氨酸表达的sars‑cov‑2‑srbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mmh)上的其相应的表位结合，首先通过将生物传感器尖端浸没在含有10μg/mlsars‑cov‑2‑srbd‑mmh溶液的孔中1分钟将约～0.51nm的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh捕获到抗penta‑his抗体涂覆的octet生物传感器尖端(富迪生物公司，#18‑5122)上。然后通过浸入含有50μg/mlmab‑1溶液的孔中5分钟用第一种抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体(随后称为mab‑1)使sars‑cov‑2‑srbd‑mmh捕获的生物传感器尖端饱和。然后将生物传感器尖端浸入含有50μg/ml第二种抗sars‑cov‑2单克隆抗体(随后称为mab‑2)溶液的孔中5分钟。在实验的每一步之间将生物传感器的尖端在hbs‑etb缓冲液中清洗。在整个实验过程中对实时结合反应进行监测，并记录每个步骤结束时的结合反应。比较了mab‑2与预先与mab‑1复合的sars‑cov‑2rbd‑mmh的结合的应答，并测定了不同抗sars‑cov‑2单克隆抗体的竞争/非竞争行为，如表34中所示出的。[0458]表34：抗sars‑cov‑2‑s抗体之间的交叉竞争[0459][0460][0461][0462][0463][0464][0465][0466][0467][0468][0469][0470][0471][0472][0473][0474][0475][0476][0477][0478][0479][0480][0481][0482][0483][0484][0485][0486][0487][0488][0489][0490][0491]实例18：在37℃下测量的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与单体sars‑cov‑2‑srbd试剂结合的ph敏感性[0492]使用基于实时表面等离振子共振(spr)的biacoret200生物传感器测定ph7.4、ph6.0和ph5.0的缓冲液中的不同的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体的解离速率常数(kd)。所有结合研究均在37℃下使用三种运行缓冲液进行，(i)pbs、0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph7.4(pbs‑t‑ph7.4)，(ii)pbs、0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph6.0(pbs‑t‑ph6.0)和(iii)pbs、0.05％v/v表面活性剂吐温‑20、ph5.0(pbs‑t‑ph5.0)。首先将biacorecm5传感器芯片表面通过与小鼠抗人fc特异性mab(再生元公司)进行胺偶联来衍来生化以捕获抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体。对用c端myc‑myc‑六组氨酸表达的人sars‑cov‑2‑srbd细胞外结构域(sars‑cov‑2rbd‑mmh)进行结合研究。将在pbs‑t‑ph7.4缓冲液中制备的单一浓度的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh(90nm)以25微升/分钟的流动速率注射3分钟，然后将结合的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh在pbs‑t‑ph7.4、pbs‑t‑ph6.0或pbs‑tpbs‑t‑ph5.0运行缓冲液中解离5分钟。[0493]四种ph运行缓冲液中的解离速率常数(kd)通过使用scrubber2.0c曲线拟合软件将实时结合传感图拟合到1:1结合模型来确定。根据kd值计算出解离半衰期(t1/2)为：[0494][0495]表35中示出了在pbs‑t‑ph7.4中与不同的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体结合、然后在37℃下在pbs‑t‑ph7.4和pbs‑t‑ph6.0中解离的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh的kd值和t1/2值。表36中示出了在pbs‑t‑ph7.4中与不同的抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体结合、然后在37℃下在pbs‑t‑ph7.4和pbs‑t‑ph5.0中解离的sars‑cov‑2‑srbd‑mmh的kd值和t1/2值。对ph7.4、ph6.0和ph5.0的缓冲液的sars‑cov‑2rbd‑mmh的解离半衰期(t1/2)的比较。[0496]表35：sars‑cov‑2‑srbd‑mmh与抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体在pbs‑t‑ph7.4缓冲液中的结合和在37℃在pbs‑t‑ph7.4和ph6.0缓冲液中的解离。[0497][0498][0499]表36：sars‑cov‑2‑srbd‑mmh与抗sars‑cov‑2单克隆抗体在pbs‑t‑ph7.4缓冲液中的结合和在37℃在pbs‑t‑ph7.4和ph5.0缓冲液中的解离。[0500][0501][0502]实例19：抗sars‑cov‑2‑s抗体与病毒样颗粒的结合[0503]为了研究一组抗sars‑cov‑2单克隆抗体结合sars‑cov‑2纤突糖蛋白的能力，开发了在基于电化学发光的检测平台(msd)中使用用sars‑cov‑2纤突蛋白进行假型化的水疱性口炎病毒(vsv)进行体外结合测定。[0504]从hek293t细胞产生假型化水泡性口炎病毒(vsv)病毒样颗粒(vlp)以瞬时表达sars‑cov‑2纤突蛋白(登录号mn908947.3，氨基酸16‑1211)。也产生仅表达vsv的vlp作为阴性结合对照。[0505]根据以下程序进行实验。将来自上文所描述的两种来源的vlp稀释于pbs中，接种到96孔碳电极板(多阵列高结合板，msd)中，并在4℃下温育过夜，以允许vlp粘附。将非特异性结合位点在室温下用含2％bsa(w/v)的pbs阻断1小时。向板结合的颗粒一式两份地添加稀释于浓度范围为0.0008nm到50nm的pbs 0.5％bsa中的抗sars‑cov‑2抗体和非结合人igg1对照以及无抗体的缓冲液，并将板在室温下摇动温育1小时。然后使用aquamax2000洗板机(mds分析技术公司)将板用1xpbs洗涤以去除未结合的抗体。在室温下用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)对板结合的抗体进行1小时的检测。洗涤后，根据制造商建议的程序用读取缓冲液(msd)对板进行显影，并用sector成像仪600(mesoscaledevelopment)仪器记录发光信号。捕获表达sars‑cov‑2的vlp和仅vsv的vlp的直接结合信号(在rlu中)。[0506]使用免疫结合测定评估抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与表达sars‑cov‑2‑s的vlp的结合相较于与无关的表达vsv的vlp结合的能力。用一系列抗体稀释液进行与96孔高结合板(msd)上的固定的vlp的结合，并使用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg检测结合的抗体。将来自电化学发光的结合信号记录在sector成像仪600(msd)上。测定抗体与vlp的结合的rlu值。所有抗体均显示出浓度依赖性结合，并在5.5nm和0.20nm下对表达sars‑cov‑2‑s的vlp上的结合与仅vsv上的结合的比率进行分析。[0507]两种浓度下的抗sars‑cov‑2‑smab与vsv/纤突和仅vsv的vlp的结合结果汇总于表37中。在所测试的46种抗体中，44种抗体在任一浓度下以相对于vsv为3或更高的比率与vsv/纤突特异性结合。在0.2nm抗体下，vsv/纤突与vsv的比率的范围为3到56，并且在5nm下，比率的范围为3到303。尽管两种抗体(mab10998和mab11002)显示出与vsv/纤突vlp的结合较弱，相对于vsvvlp的比率小于3，但是5nm下的信号在vsv/纤突上高于vsv。如预期的那样，无关的igg1同种型抗体显示出最小结合。[0508]表37：通过电化学发光，抗sars‑cov‑2‑s抗体与表达纤突蛋白的vsvvlp对vsv结合的特异性[0509][0510][0511]实例20：抗sars‑cov‑2‑s抗体与表达纤突蛋白的细胞的结合[0512]为了研究一组抗sars‑cov‑2‑s单克隆抗体与表达sars‑cov‑2‑s的细胞结合的能力，开发了在基于电化学发光的检测平台(msd)中使用表达sars‑cov‑2‑s的细胞进行体外结合测定。[0513]jurkat/tet3g/hcd20/tet‑3g诱导型细胞被工程化成瞬时表达sars‑cov‑2纤突蛋白(登录号mn908947.3，氨基酸16‑1211，jurkat/tet3g/hcd20/tet‑on3g诱导型covid‑19纤突蛋白高分选的)并被流式细胞术分选以选择sars‑cov‑2蛋白的高表达。实验中还包含亲本jurkat/tet3g/hcd20/tet‑3g作为阴性结合对照。[0514]根据以下程序进行实验。在收获前将来自上文所描述的两个系的细胞在37℃下用1μg/ml强力霉素诱导36小时，向下旋转，用pbs洗涤，然后在pbs中稀释，接种到96孔碳电极板(多阵列高结合板，msd)中，并在4℃下温育过夜，以允许细胞粘附。将非特异性结合位点在室温下用含2％bsa(w/v)的pbs阻断一小时。向板结合的细胞一式两份地添加稀释于浓度范围为0.0008nm到50nm的pbs 0.5％bsa中的抗sars‑cov‑2抗体和非结合人igg1对照以及无抗体的缓冲液，并将板在室温下摇动温育一小时。然后使用aquamax2000洗板机(mds分析技术公司)将板用1xpbs洗涤以去除未结合的抗体。在室温下用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司)对板结合的抗体进行一小时的检测。洗涤后，根据制造商建议的程序用读取缓冲液(msd)对板进行显影，并用sector成像仪600(mesoscaledevelopment)仪器记录发光信号。捕获表达sars‑cov‑2‑s的细胞和阴性对照细胞系的直接结合信号(在rlu中)。[0515]使用免疫结合测定评估抗sars‑cov‑2单克隆抗体与表达sars‑cov‑2纤突蛋白的细胞的结合相较于与亲本细胞结合的能力。用一系列抗体稀释液进行与96孔高结合板(msd)上的固定的细胞的结合，并使用sulfo‑tagtm缀合的抗人igg检测结合的抗体。将来自电化学发光的结合信号记录在sector成像仪600(msd)上。所有抗体均显示出浓度依赖性结合，并在5.5nm和0.20nm的浓度下对表达纤突的细胞上的结合与亲本细胞上的结合的比率进行分析。[0516]抗sars‑cov‑2‑smab在两种浓度下与表达纤突蛋白的细胞和亲本jurkat细胞的结合结果汇总于表38中。在所测试的46种抗体中，44种抗体在任一浓度下以相对于亲本细胞为4或更高的比率与jurkat/纤突细胞(jurkat/tet3g/hcd20/tet‑on3g诱导型sars‑cov‑2纤突蛋白高分选的细胞)特异性结合。在0.2nm下，jurkat/纤突细胞与亲本细胞上的结合信号的比率的范围为4到36，并且在5nm下，比率的范围为4到63。尽管两种抗体(mab10998和mab11002)显示出与jurkat/纤突细胞的结合较弱，相对于亲本细胞的结合比率小于4，但是在5nm下，jurket/纤突上的结合信号高于亲本细胞上的结合信号。如预期的那样，无关的igg1同种型抗体显示出最小结合。[0517]表38：通过电化学发光，抗sars‑cov‑2‑s抗体与表达纤突蛋白的jurkat细胞对亲本细胞的结合的特异性[0518][0519][0520][0521]*****************[0522]本文引用的所有参考文献均通过引用并入，达到如同每个单独的出版物、数据库条目(例如，genbank序列或geneid条目)、专利申请或专利被专门且单独地指示通过引用并入的相同程度。申请人意图通过引用将这一并入声明与每一个单独的出版物、数据库条目(例如，genbank序列或geneid条目)、专利申请或所标识的专利相关联，即使这样的引用不直接与通过引用并入的专用声明相邻。在说明书中包含通过引用并入的专有说明(如果有的话)并不以任何方式削弱通过引用并入的一般性声明。本文引用参考文献并非旨在承认所述参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。当前第1页12当前第1页12
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