新爵床脂定B在降血脂药物中的应用的制作方法

新爵床脂定b在降血脂药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及新爵床脂定b在制备降血脂的药物中的应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.随着人口老龄化、人们生活方式及习惯的改变，血脂代谢异常疾病越来越成为全球性的重大健康问题，成为导致全球人口死亡的重要原因。流行病学显示中国人群的血脂水平逐年升高，血脂异常患病率明显增加，成为城镇居民基本医疗保险的沉重负担。人群血清胆固醇水平的升高将导致2010年
‑
2030年期间我国心血管病事件约增加920万。我国儿童青少年高胆固醇血症患病率明显升高，预示未来中国成人血脂异常患病及相关疾病负担将继续加重。
3.血脂异常治疗的宗旨是防控动脉粥样硬化性心血管疾病，降低心肌梗死、缺血性脑卒中或冠心病死亡等心脑血管临床事件发生的危险。血脂异常相关疾病有高胆固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症、低高密度脂蛋白血症、动脉粥样硬化性心血管疾病。高胆固醇血症治疗首选他汀类药物，起始宜应用中等强度他汀，根据个体降脂疗效和耐受情况适当调整剂量，若胆固醇水平不能达标，与其他降脂药物联合使用。临床降脂尽管他汀类药物可显著降低高、中甚至低危人群患动脉粥样硬化性心血管疾病的风险，但其剂量增加1倍低密度脂蛋白胆固醇只降低6％，且有肝功能损伤、肌病及新发糖尿病等。高甘油三酯血症治疗主要为贝特类药物，但有肝脏、肌肉和肾毒性。混合型高脂血症常以他汀类药物与另一种作用机制不同的降脂药组合治疗。低高密度脂蛋白血症可以选用烟酸进行治疗，能快速提高高密度脂蛋白胆固醇水平，但有肝脏损伤、高尿酸血症、高血糖和消化道不适等不良反应，且与他汀联用的临床研究表明与单用他汀相比无心血管保护作用，目前欧美多国已将烟酸类药物淡出降脂药市场。
4.高血脂易引起动脉粥样硬化，进一步引起血栓性疾病。目前，针对静脉血栓栓塞性疾病的治疗临床上多采用抗凝药物，如肝素、黄达肝葵钠和沙利度胺等。针对动脉血栓栓塞性疾病的治疗根据不同情况会选用不同的治疗方案：(1)冠状动脉粥样硬化性心脏病通常采用阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板药物治疗，视病情联合肝素等抗凝药物治疗；(2)缺血性脑卒中首选采用rt
‑
pa溶栓治疗，不适合溶栓治疗尽早给予抗血小板药物或抗凝药物治疗；(3)下肢动脉硬化闭塞症通常采用抗血小板药物治疗，急性动脉缺血除ⅰ期和ⅱa期局部溶栓治疗外一般采用抗凝和抗血小板药物治疗；(4)心房颤动采用抗凝治疗。上述药物随着统计病例的增多，越来越多的病患出现了个体疗效差异显著、药物抵抗和胃肠道出血等诸多不良反应。
5.目前临床上治疗高血脂症兼血栓病时往往需要上述降血脂药物和抗血栓药物联合应用，尚未有药物能同时治疗高血脂兼血栓病。爵床为爵床科植物爵床justicia procumbens l.的干燥全草，分布于亚热带和热带地区，我国药材资源十分丰富。爵床用药历史悠久，始载于《神农本草经》列为上品，历代本草均有收载。本技术新爵床脂定b为从爵床中分离得到的单体化合物，本发明药理研究表明，新爵床脂定b能降血脂，还能抗血栓。


技术实现要素：

6.本发明的发明目的是针对现有技术在降血脂与抗血栓治疗方面存在的问题，提出新爵床脂定b在降血脂的同时兼具有抗血栓作用的应用。
7.新爵床脂定b(neojusticin b)，又名爵床脂定c(justicidin c)，属于4
‑
苯代萘内酯型木脂素类化合物，分子式为c
22
h
18
o7，分子量为394，化学结构为(ⅰ)
[0008][0009]
目前关于新爵床脂定b的药理研究为抗血小板聚集、细胞毒活性。没有发现关于新爵床脂定b降血脂和抗凝作用的报道。
[0010]
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0011]
本发明提供新爵床脂定b在制备降血脂药物中的应用。
[0012]
进一步，所述与降血脂药物治疗的疾病包括高胆固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症、低高密度脂蛋白血症、动脉粥样硬化性心血管疾病，包括高血脂症兼患血栓病。
[0013]
进一步，所述新爵床脂定b上调载脂蛋白a
‑ⅱ
、载脂蛋白c
‑
ii的表达，下调糖蛋白ⅲb的表达以产生降脂作用。
[0014]
进一步，所述新爵床脂定b下调纤维蛋白原、凝血因子x的表达以产生抗血栓作用。
[0015]
进一步，所述降血脂药物包括药学上可接受的辅料。
[0016]
进一步，所述降血脂药物选自口服制剂或注射制剂；所述口服制剂选自片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂或口服液剂中的一种；所述注射制剂选自注射液或冻干粉针。
[0017]
由实施例3表5结果，发明人发现新爵床脂定b降血脂的作用靶点为糖蛋白ⅲb(glycoproteinⅲb)、载脂蛋白a
‑ⅱ
(apolipoproteina
‑ⅱ
)、载脂蛋白c
‑ⅱ
(apolipoprotein c
‑ⅱ
)。糖蛋白ⅲb能与低密度脂蛋白颗粒结合，促进肠道脂肪吸收与脂肪组织中脂质储存，参与炎症反应和动脉粥样硬化血栓形成相关的疾病，新爵床脂定b能明显下调血液中糖蛋白ⅲb的表达量。载脂蛋白a
‑ⅱ
与脂质结合共同稳定高密度脂蛋白的结构，促进脂质、胆固醇等代谢排出体外；载脂蛋白c
‑ⅱ
是低密度脂蛋白激活剂，研究表明其过度表达或缺失均可导致甘油三酯血症，虽然对血脂调控作用不明显但能保护血管内皮细胞阻止动脉粥样硬化形成；新爵床脂定b能明显上调血液中载脂蛋白a
‑ⅱ
和载脂蛋白c
‑ⅱ
的表达量。发明人还发现新爵床脂定b抗凝作用靶点为纤维蛋白原(fibrinogen)、凝血因子x(coagulation factor x)。纤维蛋白原是凝血过程、血栓形成过程中的重要物质，高纤维蛋白原表达是临床血栓性疾病的标志物，纤维蛋白原主要通过改变血液流变性、血小板聚
集、动脉粥样硬化、纤维蛋白原凝块结构、纤溶系统的活化等影响血栓的形成。新爵床脂定b能显著下调血液中纤维蛋白原的表达量。凝血因子x是一种血浆糖蛋白，被激活成凝血因子xa，凝血因子xa在凝血系统中处于内源、外源和共同途径的衔接部位，为体内凝血酶原唯一的生理性激活物，在血液凝固的连锁反应中起关键性作用。新爵床脂定b能显著下调血液中凝血因子x的表达量。
[0018]
本发明中，新爵床脂定b可以通过从爵床或爵床科植物中提取和纯化获得，也可以通过化学合成的方式获得，还可以通过购买获得。提取和纯化均为本领域的常规方法。提取方法例如是浸渍、渗漉、煎煮、回流、超声、微波提取等；纯化方法例如是醇提水沉、碱溶酸沉以及各种柱色谱技术，如大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等。
[0019]
方便的药用形式可以是适于体内施用的剂型，如片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液或注射剂。本领域技术人员可以根据实际需要按照常规方法将有效量的新爵床脂定b与药学上可接受的载体或辅料组合制成上述剂型。上述的药学可接受的载体或辅料包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、缓控释辅料、矫味剂、防腐剂、基质等。“辅料”是指可药用惰性成分，分为稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、矫味剂、掩味剂、着色剂、抗粘剂、保湿剂、螯合剂、塑化剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂等。技术人员可认识到，某些药学上可接受的赋形剂可提供不止一种功能，并提供可供选择的功能，这取决于制剂中存在多少该赋形剂和制剂中存在哪些其他赋形剂。
[0020]
技术人员掌握本领域的知识和技能，以使他们能选择用于本发明的适当量的合适的药学上可接受的药用辅料。此外，存在大量技术人员可获得的资源，他们描述药学上可接受的赋形剂，并用于选择合适的药学上可接受的药用辅料(即赋形剂)。实例包括remington's pharmaceutical sciences(mack publishing company),the hand book of pharmaceutical additives(gower publishing limited),and the hand book of pharmaceutical excipients(the american pharmaceutical association and the pharmaceutical press)。
[0021]
本发明的有益效果在于：
[0022]
(1)新爵床脂定b通过上调载脂蛋白a
‑ⅱ
、载脂蛋白c
‑
ii的表达，下调糖蛋白ⅲb的表达，产生降低脂质吸收和运转、加速脂质清除的作用。
[0023]
(2)新爵床脂定b通过下调凝血因子x的表达产生抗凝作用，通过下调纤维蛋白原的表达产生抗血小板聚集作用。通过抗凝和抗血小板聚集共同实现抗血栓功效。
[0024]
(3)新爵床脂定b降血脂作用机制新颖，为高血脂疾病治疗提供了新方案。特别为由高血脂致动脉粥样硬化进一步导致血栓性疾病的临床治疗提供新方案。
附图说明
[0025]
图1为模型组血管图。
[0026]
图2为新爵床脂定b对血管的保护作用图。
[0027]
图3为模型组血栓侧颈动脉血管横切面的he染色切片图。
[0028]
图4为模型组空白侧颈动脉血管横切面的he染色切片图。
[0029]
图5为新爵床脂定b组血栓侧颈动脉血管横切面的he染色切片图。
[0030]
图6为新爵床脂定b组空白侧颈动脉血管横切面的he染色切片图。
[0031]
附图标记如下：1.古粉红色；2.大红色。
具体实施方式
[0032]
为使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例中所使用的试验方法如无特别说明，均为常规方法；所使用的实验动物、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]
实施例1：新爵床脂定b的制备
[0034]
1材料
[0035]
1.1爵床药材
[0036]
爵床药材于2019年秋季采收于武汉市江夏区，经湖北中医药大学吴和珍教授鉴定为爵床科爵床属植物爵床。
[0037]
1.2试剂
[0038]
乙醇、甲醇为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈为色谱纯，购自默克化工技术有限公司；d101大孔吸附树脂购自蓝晓科技新材料股份有限公司。
[0039]
2方法
[0040]
2.1新爵床脂定b制备
[0041]
取爵床药材30kg，粉碎，过2号筛，80％乙醇渗漉，渗漉液减压浓缩至无醇味，乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯液，减压回收溶剂，残渣加30％乙醇超声使混悬均匀，上d101大孔吸附树脂柱，先用30％乙醇洗至无色，弃去，再用50％乙醇洗至无色，收集，最后用90％乙醇洗柱，弃去，取50％乙醇洗脱流份段，减压回收溶剂，残渣加无水乙醇适量，超声使混悬均匀，抽滤，重复7～10次至脱去色素，残渣减压干燥，得爵床提取物106g。取爵床提取物25g，用乙腈溶解提取物，采用安捷伦1260infinity制备型高效液相色谱仪进行制备。色谱柱：安捷伦prep
‑
sil(21.2mm
×
150mm,5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈
‑
水(50:50)；流速：20ml/min；进样量：200μl；检测波长:256nm。将待制备样品的溶液浓度调整至液相主峰纵坐标2000mau，开始制备，得到新爵床脂定b1.8g。
[0042]
2.2新爵床脂定b结构鉴定
[0043]
本品为白色粉末，uplc
‑
ms显示[m h]

峰荷质比为395.1133，计算化合物分子量为c
22
h
18
o7。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)谱图含有18个质子，δ3.86(3h，s)，4.08(3h，s)，4.39(3h，s)为高场区的3个甲氧基质子信号；δ5.17(2h，s)是内酯环上联氧的亚甲基质子信号，且羰基与苯环异侧；δ6.08(1h，s)，6.11(1h，s)是亚甲二氧基上两个质子信号；芳香区可见5个质子信号，δ7.72(1h，s，h
‑
5)；7.02(1h，s，h
‑
8)为萘环上两个单质子信号，苯环存在abx耦合质子信号δ6.99(1h，d，j＝6.5hz)，6.81(1h，dd，j＝5.7hz，1.8hz)，6.80(1h，dd，j＝1.8hz)。以上质谱、核磁共振谱数据与新爵床脂定b数据一致。
[0044]
实施例2：新爵床脂定b降血脂药效研究
[0045]
1材料
[0046]
1.1动物
[0047]
sd大鼠购自三峡大学实验动物中心。
[0048]
1.2试剂
[0049]
血清总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒、生化试剂均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；高脂饲料购自湖北省疾控中心；其余试剂均为分析纯购自国药集团化学试剂有限公司。
[0050]
2方法
[0051]
2.1高脂血症造模
[0052]
取sd雄性大鼠30只，适应性饲养观察7d，取尾静脉血测定总胆固醇、甘油三酯。根据总胆固醇水平，采用分层随机抽样方法将大鼠分组，适当调整使各组大鼠的总胆固醇和初始体重分布均衡。开始试验后，除基础饲料对照组外，其余各组均用高脂饲料喂养，连续30d。
[0053]
2.2分组与给药
[0054]
取上述分组均衡的sd雄性大鼠分别设为基础饲料对照组、高血脂模型对照组、新爵床脂定b组。两个对照组灌胃蒸馏水，新爵床脂定b灌胃1.66mg/kg，每天灌胃一次，连续30d。
[0055]
2.3血液中总胆固醇、甘油三酯测定
[0056]
末次给药后禁食12h，腹主动脉取血，3000rpm离心10min，取离心后上层血清，按血清总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒说明操作，测定血液中总胆固醇、甘油三酯含量。
[0057]
3结果
[0058]
3.1新爵床脂定b降低血液中总胆固醇与甘油三酯量
[0059]
试验前各组大鼠血液中总胆固醇与甘油三酯含量基本一致，组间无差异。试验至第30d时，高血脂模型组大鼠血液中总胆固醇与甘油三酯含量高于基础饲料对照组，且具有显著性差异，说明高血脂模型造模成功。新爵床脂定b组大鼠血液中总胆固醇与甘油三酯含量均显著低于高血脂模型组，略高于基础饲料对照组。结果见表1。说明新爵床脂定b能降低血液中总胆固醇与甘油三酯含量。
[0060]
表1 新爵床脂定b对大鼠血清总胆固醇和甘油三酯含量的影响
[0061][0062]
注：#表示与基础饲料组比，p＜0.05；**表示与高血脂模型组比，p＜0.01。
[0063]
实施例3：新爵床脂定b抗血栓药效研究
[0064]
1材料
[0065]
1.1动物
[0066]
sd大鼠购自三峡大学实验动物中心。
[0067]
1.2试剂
[0068]
苏木素染液、伊红染液购自赛维尔生物科技有限公司；戊巴比妥钠购自默克化工
技术有限公司；iam碘乙酰胺、triethylammonium bicarbonate buffer(teab)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；modifiedtrypsin蛋白酶(质谱级)购自promega公司；乙腈(质谱级)、甲醇(质谱级)、甲酸(质谱级)、tmt 10plex、protein ladder(预染)、protease inhibitor cocktail(蛋白酶抑制剂)、piercetm bca protein assay kit、nupage 10％bt gel 1.0mm 12w、breakertm tcep solution(tcep)购自赛默飞世尔科技有限公司；bca蛋白定量试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；其余试剂均为分析纯购自国药集团化学试剂有限公司。
[0069]
2方法
[0070]
2.1造模方法
[0071]
取sd大鼠，饮食正常，所有试验动物适应性喂养7d后开始试验。试验前各组大鼠禁食8h以上，灌胃给药5min后，按0.25ml/100g腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液，麻醉后仰卧固定大鼠，去毛，消毒涂擦术野皮肤，在环甲状软骨以上、沿颈部正中纵行切开皮肤，以止血钳钝性分离结缔组织，暴露颈部肌群，沿肌间隙分离，暴露颈动脉，游离3cm左右，放入1.0cm宽的封口胶条，再用浸有20％fecl3溶液的滤纸条(0.6cm宽)环裹分离备用的颈动脉段，15min后，取下滤纸条。
[0072]
2.2分组与给药
[0073]
取sd大鼠，30只，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、新爵床脂定b组。空白组不进行手术；模型组灌胃0.5％的cmc
‑
na溶液；新爵床脂定b组灌胃1.66mg/kg。
[0074]
2.3血栓重量测定
[0075]
建立大鼠颈动脉血栓模型15min后，取下滤纸条，40min后，腹主动脉取血，精确剪下滤纸条包裹的血管段，去掉血管内余血，精确称量含血栓的血管湿重，取另一侧对应位置颈动脉血管，同样用洁净滤纸吸干血管内余血作为对照，两者相减即为血管段内血栓的重量。
[0076]
2.3病理切片
[0077]
取含血栓血管，以4％多聚甲醛固定，脱水，包埋，切片，苏木精伊红(he)染色，脱水封片，置倒置显微镜下观察。
[0078]
2.4蛋白组学分析
[0079]
取sd大鼠fecl3颈动脉血栓试验全血，3500rpm，离心8min，弃去上层血清，沉淀加100μl ph 7.4等渗磷酸盐缓冲液润洗1次，3500rpm，离心8min，倾出上清液，取沉淀加入适量的蛋白质裂解液，冰上裂解30min，4℃，12000g离心30min，取蛋白质上清液，bca蛋白定量，sds
‑
page电泳。
[0080]
取蛋白样品100μg，进行还原烷基化和酶解，tmt标记，uplc
‑
ms检测，数据库分析。
[0081]
3实验结果
[0082]
3.1新爵床脂定b对血管的保护
[0083]
手术进行中，取下含有fecl3溶液的滤纸条30min后，包裹滤纸一侧血管明显变黑变粗，结果见图1，图中黑圈里面为包裹侧，另一侧血管为对照。相对于模型组，新爵床脂定b组血管颜色较浅，说明新爵床脂定b能较好的保护血管，显著减轻fecl3溶液对血管的损伤，结果见图2。原始图为彩色图更直观，附图为申报黑白图。
[0084]
3.2病理切片结果
[0085]
病理切片结果显示，sd大鼠经fecl3诱导后颈动脉损伤较严重，可见颈动脉壁变黑和破损(见图3、5)，而空白侧颈动脉壁形态完好(见图4、6)。he染色后空白侧颈动脉细胞核明显且分散均匀，fecl3诱导后颈动脉壁外侧细胞核呈线状排列、部分细胞核丢失。颈动脉横截面图可见，经fecl3诱导后，颈动脉腔内呈现大红色(附图标记2)和古粉红色(附图标记1)两部分，大红色为血细胞凝固产生，古粉红色为血栓产生(见图3、5)。模型组血栓非常明显，相对而言新爵床脂定b组中血栓较少(见图5)。上述结果说明fecl3已渗透入颈动脉，并在颈动脉内形成血栓，表明造模成功。
[0086]
3.3新爵床脂定b对血栓的抑制
[0087]
测定各组血栓重量结果显示，新爵床脂定b具有显著的体内抗血栓效果。相对于模型组，新爵床脂定b能极显著降低血栓重量与模型组比两者有极显著性差异。结果见表2。
[0088]
表2 不同组血栓重量
[0089][0090]
**表示与模型组比较p＜0.01，有极显著性差异。
[0091]
3.4新爵床脂定b对血液中蛋白质分析
[0092]
采用超高压液相质谱联用技术检测模型组与新爵床脂定b组样品。将新爵床脂定b组与模型组检测出的蛋白进行比较，搜集表达差异蛋白进行go数据库和kegg数据库分析，go注释和kegg注释参数设置为：e
‑
value值≤10
‑5、identity值≥0.98、校正pvalue值≤0.5。
[0093]
新爵床脂定b组与模型组差异蛋白进行kegg功能和go功能显著性富集分析，按校正pvalue值进行差异显著性排序。结果发现新爵床脂定b显著下调补体和凝血级联反应、脂肪消化吸收、脂肪细胞中脂解的调节，显著上降脂质运转负调控，结果见表3、表4。
[0094]
表3 显著下调kegg功能
[0095][0096]
表4 显著上调go功能
[0097][0098]
进一步对各功能核心蛋白进行分析，发现新爵床脂定b通过下调糖蛋白ⅲb、上调载脂蛋白a
‑ⅱ
和载脂蛋白c
‑ⅱ
的表达，来降低脂质吸收和运转、加速脂质清除。新爵床脂定b通过下调纤维蛋白原、凝血因子x的表达来抑制血栓形成。结果见表5。
[0099]
表5 与模型组比新爵床脂定b组调控蛋白logfc值
[0100][0101]
实施例4：新爵床脂定b颗粒剂的制备
[0102]
1材料
[0103]
1.1新爵床脂定b
[0104]
实施例1中的新爵床脂定b单体(实施例1中2.1项)。
[0105]
1.2药用辅料
[0106]
糊精购自安徽山河药用辅料股份有限公司；蔗糖购自南宁糖业股份有限公司。
[0107]
1.3试剂
[0108]
乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。
[0109]
2方法
[0110]
取新爵床脂定b 0.75g，已粉碎至80目筛蔗糖10g，糊精14.25g，合并，混合均匀，以90％乙醇为润湿剂制成软材，过14目筛制成湿颗粒，60℃干燥至含水量小于2％，14目筛整粒，分装，每袋装0.5g。
[0111]
3结果
[0112]
共制备47袋颗粒，每袋含新爵床脂定b15mg。
[0113]
实施例5：新爵床脂定b胶囊剂的制备
[0114]
1材料
[0115]
1.1新爵床脂定b
[0116]
实施例1中的新爵床脂定b单体(实施例1中2.1项)。
[0117]
1.2药用辅料
[0118]
糊精购自安徽山河药用辅料股份有限公司；蔗糖购自南宁糖业股份有限公司。
[0119]
1.3试剂
[0120]
乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。
[0121]
2方法
[0122]
取新爵床脂定b 0.75g，已粉碎至80目筛蔗糖5g，糊精14.25g，混合均匀，以90％乙醇为润湿剂制成软材，过14目筛制成湿颗粒，60℃干燥至含水量小于2％，14目筛整粒，分装入2号胶囊，每粒装0.4g。
[0123]
3结果
[0124]
共制备44粒胶囊，每粒含新爵床脂定b15mg。