生成用于空间分析的捕获探针的制作方法

技术特征：
1.一种产生空间阵列的方法，其包括：(a)提供包含多个寡核苷酸的阵列，其中多个寡核苷酸中的寡核苷酸的3
′
端附接至基材；(b)提供多个引物，其中多个引物中的引物与寡核苷酸的部分基本互补；(c)使用寡核苷酸作为模板来延伸引物，由此产生具有游离3
′
端的第一寡核苷酸；(d)延伸第一寡核苷酸以产生3
′
突出端；(e)提供与第一寡核苷酸的3
′
端杂交的夹板寡核苷酸；和(f)将第二寡核苷酸连接到第一寡核苷酸的3
′
端，其中第二寡核苷酸包含与夹板寡核苷酸的部分基本互补的序列，并且其中第二寡核苷酸包含捕获域，由此产生空间阵列。2.如权利要求1所述的方法，其中多个寡核苷酸中的寡核苷酸包含空间条形码。3.如权利要求1或2所述的方法，其中多个寡核苷酸中的寡核苷酸包含第一恒定序列。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸中的寡核苷酸还包含第二恒定序列。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸中的寡核苷酸的长度为20至60个核苷酸。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸还包含恒定序列，并且其中所述恒定序列与所述夹板寡核苷酸的部分基本互补。7.如权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸还包含独特分子标识符。8.如权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸还包括空间条形码。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述捕获域包含多聚
‑
t序列。9.如权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述捕获域包含基因特异性序列。10.如权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中步骤(d)的3
′
端突出端由酶产生。11.如权利要求10所述的方法，其中所述酶是不依赖模板的聚合酶。12.如权利要求11所述的方法，其中不依赖模板的聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)或多聚(a)聚合酶。13.一种用于确定生物样品中分析物位置的方法，包括：(a)将生物样品与通过权利要求1
‑
12中任一项所述的方法产生的空间阵列接触；(b)透化生物样品以允许生物样品中的分析物与空间阵列上的捕获域特异性结合；和(c)鉴定与捕获域特异性结合的分析物，从而确定分析物在生物样品中的空间位置。14.如权利要求13所述的方法，其中生物样品中的第二分析物与空间阵列上的第二捕获域相互作用，并且步骤(c)包括识别与第二捕获域特异性结合的第二分析物，从而确定所述分析物在第二生物样品中的空间位置。15.一种制备空间阵列的方法，包括：(a)使包含一组或多组第一寡核苷酸的阵列与包含一组或多组第二寡核苷酸的水凝胶接触，其中一组或多组第一寡核苷酸中的第一寡核苷酸包含捕获域，一组或多组第二寡核苷酸中的第二寡核苷酸包含捕获域，或两者都包含；(b)将第一寡核苷酸附接到第二寡核苷酸以产生包含捕获域的捕获探针；
(c)通过去除水以形成包含捕获探针的收缩的水凝胶来减小包含捕获探针的水凝胶的尺寸，从而产生空间阵列。16.如权利要求15所述的方法，其中一组或多组第二寡核苷酸固定在水凝胶中。17.如权利要求16所述的方法，其中固定的第二寡核苷酸被分区，从而使得所述固定的第二寡核苷酸的第一群体与固定的第二寡核苷酸的另一群体分开。18.如权利要求17所述的方法，其中所述固定的第二寡核苷酸被分区进入多个第二寡核苷酸分区，从而使得固定的第二寡核苷酸的不同群体彼此分开。19.如权利要求16或17所述的方法，其中固定的第二寡核苷酸的分区群体的第一固定的第二寡核苷酸不同于固定的第二寡核苷酸的另一分区群体的第二固定的第二寡核苷酸。20.如权利要求15
‑
19中任一项所述的方法，其中所述第一固定的第二寡核苷酸、所述第二固定的第二寡核苷酸或两者包含空间条形码。21.如权利要求20所述的方法，其中固定的第二寡核苷酸的分区群体的第一固定的第二寡核苷酸包含的空间条形码不同于固定的第二寡核苷酸的的另一分区群体的第二固定的第二寡核苷酸的空间条形码。22.如权利要求20或21所述的方法，其中一个或多个第二寡核苷酸分区包含固定的捕获探针的群体，所述固定的捕获探针的群体包含的空间条形码不同于另一第二寡核苷酸分区的固定的捕获探针的群体的空间条形码。23.如权利要求15
‑
22中任一项所述的方法，其中所述一组或多组第一寡核苷酸被分区。24.如权利要求23所述的方法，其中所述一组或多组第一寡核苷酸被分区到第一寡核苷酸分区中。25.如权利要求23或24所述的方法，其中一个或多个第一寡核苷酸分区包含的第一寡核苷酸的群体不同于另一个第一寡核苷酸分区中的第一寡核苷酸。26.如权利要求15
‑
25中任一项所述的方法，其中一个或多个第一寡核苷酸分区中的第一寡核苷酸的群体的第一寡核苷酸包含空间条形码。27.如权利要求26所述的方法，其中一个或多个第一寡核苷酸分区中的第一寡核苷酸的群体的第一寡核苷酸包括的空间条形码不同于另一个第一寡核苷酸分区中的第一寡核苷酸的群体的第一寡核苷酸的空间条形码。28.如权利要求26或27所述的方法，其中一个或多个第一寡核苷酸分区中的第一寡核苷酸的群体的第一寡核苷酸的空间条形码不同于一个或多个第二寡核苷酸分区中的第二寡核苷酸的群体的第二寡核苷酸的空间条形码。29.如权利要求26
‑
28中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸分区包括第一寡核苷酸的第一群体，所述第一寡核苷酸的第一群体包含的空间条形码不同于另一个第一寡核苷酸分区中的第一寡核苷酸的第二群体的空间条形码。30.如权利要求15
‑
29任一项所述的方法，其中步骤(c)中水凝胶尺寸的减小是等距的。31.如权利要求15
‑
30中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的水的去除包括脱水溶剂。32.如权利要求31所述的方法，其中所述溶剂包括醇、酮、醛、乙腈或其组合中的至少一种。33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述溶剂包括甘油、乙醇、乙腈、丙酮、2
‑
丙醇
及其组合中的至少一种。34.如权利要求15
‑
30中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的水的去除包括使用盐。35.如权利要求34所述的方法，其中所述盐包括无机盐。36.如权利要求15
‑
30中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的水的去除包括酸。37.如权利要求15
‑
36中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的水的去除包括脱水过程。38.如权利要求15
‑
37中任一项所述的方法，其中所述收缩的水凝胶的线性维度比步骤(c)收缩前的水凝胶之前的水凝胶的尺寸小约2至约10倍。39.如权利要求15
‑
38中任一项所述的方法，其中所述收缩的水凝胶的线性维度比所述收缩前的水凝胶小至少2倍。40.如权利要求15
‑
39中任一项所述的方法，其中所述收缩的水凝胶的线性维度比所述收缩前的水凝胶小至少4倍。41.如权利要求15
‑
40中任一项所述的方法，其中所述收缩的水凝胶的线性维度比所述收缩前的水凝胶小至少8倍。42.如权利要求15
‑
41中任一项所述的方法，其中所述附接包括聚合酶链式反应。43.如权利要求42所述的方法，其中所述水凝胶包含dna聚合酶、多个引物和多个核苷酸。44.如权利要求15
‑
43中任一项所述的方法，其中多个第一寡核苷酸的成员与所述水凝胶交联。45.如权利要求15
‑
44中任一项所述的方法，其中所述捕获探针被扩增。46.如权利要求45所述的方法，其中在减小水凝胶尺寸之前扩增捕获探针。47.如权利要求15
‑
46中任一项所述的方法，其中水凝胶由水凝胶亚单元制备，所述亚单元包括以下中的至少一种：丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚(乙二醇)、多脂族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四氢呋喃、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素及其组合。48.如权利要求15
‑
47中任一项所述的方法，其中所述一组或多组第一寡核苷酸中的第一寡核苷酸包含空间条形码。49.如权利要求15
‑
48中任一项所述的方法，其中所述一组或多组第一寡核苷酸中的第一寡核苷酸包含独特分子标识符。50.如权利要求15
‑
49中任一项所述的方法，其中所述一组或多组第一寡核苷酸中的第一寡核苷酸包含空间条形码和捕获域。51.一种用于确定生物样品中分析物位置的方法，包括：(a)提供如权利要求15
‑
50中任一项所述的空间阵列；(b)在允许分析物与空间阵列的捕获探针特异性结合的条件下，使生物样品与如权利要求1
‑
36中任一项所述的空间阵列接触；和(c)确定与捕获探针特异性结合的分析物的身份，从而确定分析物在生物样品中的位置。52.如权利要求51所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。53.如权利要求52所述的方法，其中所述组织样品是新鲜冷冻组织样品。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述组织样品包含肿瘤细胞。55.如权利要求52所述的方法，其中所述组织样品包含组织切片。56.如权利要求52
‑
55中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述生物样品中的分析物迁移至所述捕获探针。57.如权利要求56所述的方法，其中所述迁移包括被动迁移。58.如权利要求56所述的方法，其中所述迁移包括主动迁移。59.如权利要求51
‑
58中任一项所述的方法，其中所述分析物包括rna、dna、蛋白质、脂质、肽、代谢物、小分子和分析物捕获剂中的至少一种。60.一种用于生成阵列的方法，包括：(a)提供基材，所述基材包含固定在所述基材上的多个特征，其中所述多个特征中的特征包含第一寡核苷酸，并且其中所述第一寡核苷酸包含第一空间条形码；(b)将第二寡核苷酸递送至第一寡核苷酸，其中第二寡核苷酸包含第二空间条形码和捕获域；和(c)附接第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，由此产生包含第一空间条形码、第二空间条形码和捕获域的捕获探针。61.如权利要求60所述的方法，其中第一寡核苷酸与多个不同的第一空间条形码之一相关联。62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述第二寡核苷酸与多个不同的第二空间条形码之一相关联。63.如权利要求60
‑
62任一项所述的方法，其中步骤(c)包括连接第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。64.如权利要求63所述的方法，其中所述连接包括使用连接酶。65.如权利要求60
‑
63中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸通过化学偶联反应彼此附接。66.如权利要求60
‑
65中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含被保护基团掩蔽的3
′
端。67.如权利要求60
‑
66中任一项所述的方法，其中在将所述第二寡核苷酸递送至所述第一寡核苷酸之前去除所述保护基团。68.如权利要求67所述的方法，其中所述保护基团是光可裂解的保护基团。69.如权利要求68所述的方法，其中通过将所述第一寡核苷酸暴露于光来去除所述光可裂解保护基团。70.如权利要求68所述的方法，其中通过施加光掩模来保护与所述第一寡核苷酸偶联的所述光可裂解保护基团。71.如权利要求60
‑
70中任一项所述的方法，其中第一特征与所述多个中的其它特征通过一个或多个物理屏障隔开，其中所述一个或多个物理屏障形成一个或多个腔室，并且其中所述第一寡核苷酸被递送至一个或多个腔室中的腔室。72.如权利要求71所述的方法，其中所述一个或多个物理屏障包括疏水表面。73.如权利要求71或72所述的方法，其中所述一个或多个物理屏障包括具有与该基材接触的锥形端的一个或多个腔室壁。
74.如权利要求60
‑
73中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含独特分子标识符。75.一种用于生成阵列的方法，包括：(a)提供包含两个或更多个分区的基材，其中所述两个或更多个分区的第一分区包含固定在基材上的特征，其中所述特征包含第一寡核苷酸，并且其中所述第一寡核苷酸包含第一空间条形码；(b)将第二寡核苷酸递送至第一分区，其中第二寡核苷酸包含第二空间条形码和捕获域；和(c)在第一分区中附接第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，从而在第一分区中产生包含第一空间条形码、第二空间条形码和捕获域的捕获探针。76.如权利要求75所述的方法，所述方法还包括：(d)将第三寡核苷酸递送至两个或更多个分区的第二分区，其中第三寡核苷酸包含第三空间条形码和第二捕获域，其中第二分区包含第二特征，其中第二特征包含第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸包含第一空间条形码；和(e)附接第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，由此在第二分区中产生包含第一空间条形码、第三空间条形码和第二捕获域的第二捕获探针。77.如权利要求75或76所述的方法，其中所述两个或更多个分区由一个或多个物理屏障隔开。78.如权利要求77所述的方法，其中所述一个或多个物理屏障被印刷在所述基材上。81.如权利要求77或78所述的方法，其中所述一个或多个物理屏障形成包括一个或多个腔室壁的一个或多个腔室。82.如权利要求77
‑
79中任一项所述的方法，其中所述一个或多个腔室壁包括疏水表面。83.如权利要求77
‑
80中任一项所述的方法，其中所述一个或多个腔室壁包括与所述基材接触的锥形端。84.如权利要求75
‑
81中任一项所述的方法，其中使用微流体装置递送所述第二寡核苷酸。85.一种富集捕获探针的群体的方法，包括：(a)提供多个捕获探针，其中：(i)多个捕获探针的成员包含多个不同的空间条形码，并且(ii)待富集的捕获探针的群体的目标捕获探针包含目标空间条形码；和(b)从多个捕获探针中富集包含目标空间条形码的目标捕获探针的群体。86.一种用于确定生物样品中分析物位置的方法，包括：(a)提供包含多个捕获探针的基材，其中多个捕获探针的子集附接在基材上的一个位置，并且其中捕获探针的子集的两个或更多个捕获探针包含第一共同空间条形码；(b)使生物样品与基材接触，从而使得捕获探针的子集的捕获探针与来自生物样品的分析物特异性结合，其中与捕获探针特异性结合的分析物包含第一共同空间条形码或其互补物；(c)识别生物样品内的感兴趣区域，其中感兴趣区域包含与捕获探针特异性结合的分
析物；和(d)富集与捕获探针特异性结合的分析物以确定分析物在生物样品中的位置。87.如权利要求86所述的方法，其中所述基材还包括附接在基材上第二位置的捕获探针的第二子集，其中捕获探针的第二子集的两个或更多个捕获探针包含与第一共同空间条形码不同的第二共同空间条形码。88.如权利要求86或87所述的方法，其中所述基材还包含附接在所述基材上的第三位置处的捕获探针的第三子集，其中所述捕获探针的第三子集的两个或更多个捕获探针包含第三共同空间条形码，其不同于第一共同空间条形码和第二共同空间条形码。89.如权利要求86
‑
88所述的方法，其中所述捕获探针包括捕获域。90.如权利要求86
‑
89所述的方法，其中所述分析物包括rna、dna和细胞加标剂中的至少一种。91.如权利要求90所述的方法，其中所述分析物捕获剂包括抗原结合分子。92.如权利要求90或91所述的方法，其中所述分析物捕获剂包含被配置为与所述捕获探针的捕获域偶联或特异性结合的区域。93.如权利要求86
‑
92所述的方法，其中感兴趣区域通过如下方式被识别：对与捕获探针特异性结合的多个分析物的至少一个子集进行浅测序，和识别与所述感兴趣区域相关联的第一共同空间条形码。94.如权利要求86
‑
93所述的方法，其中所述感兴趣区域通过免疫染色、免疫组织化学、显微镜检查、目视检查及其组合中的至少一种识别。95.如权利要求86
‑
94所述的方法，其中步骤(d)包括使用(i)与捕获探针特异性结合的分析物和(ii)包含对第一共同空间条形码具有特异性的序列或其互补物的引物来进行核酸延伸反应以产生与捕获探针特异性结合的富集的多个分析物，所述捕获探针包含第一共同条形码或其互补物。96.如权利要求86
‑
95中任一项所述的方法，其中通过进行聚合酶链式反应(pcr)来扩增所述分析物。97.如权利要求86
‑
96中任一项所述的方法，还包括富集存在于感兴趣的亚区域中的捕获探针的群体：(a)其中感兴趣的亚区域位于感兴趣的区域内，其中感兴趣的亚区域包含捕获探针的亚组，并且其中：(i)捕获探针的亚组中的两个或更多个捕获探针包含第一共同亚空间条形码；和(ii)第一共同亚空间条形码序列与感兴趣的亚区域相关联；和(b)富集包含第一共同亚空间条形码的捕获探针的群体。98.如权利要求97所述的方法，还包括富集存在于感兴趣的子亚区域中的捕获探针的群体：(a)其中感兴趣的子亚区域位于感兴趣的亚区域内，其中感兴趣的子亚区域包含子亚多个捕获探针，并且其中：(i)子亚多个捕获探针中的两个或更多个捕获探针包含第一共同子亚空间条形码；和(ii)第一共同子亚空间条形码与感兴趣子亚区域相关联；和(b)富集包含第一子亚空间条形码的捕获探针的群体。
99.如权利要求86
‑
98中任一项所述的方法，其中所述第一共同空间条形码与所述生物样品的单细胞相关联。100.如权利要求86
‑
99中任一项所述的方法，其中所述分析物包括mrna。101.如权利要求86
‑
99中任一项所述的方法，其中所述分析物包括蛋白质。102.如权利要求86
‑
99中任一项所述的方法，其中所述分析物包括抗体。103.如权利要求86
‑
99中任一项所述的方法，其中所述分析物包括dna。104.如权利要求103所述的方法，其中所述dna编码t细胞受体。105.如权利要求103所述的方法，其中dna包含生物样品中的一个或多个染色质区域。106.一种用于生成空间阵列的方法，包括：(a)提供包含多个第一寡核苷酸的基材，其中多个第一寡核苷酸的第一寡核苷酸通过其3
′‑
端或5
′‑
端附接到该基材的区域；(b)将第二寡核苷酸附接到第一寡核苷酸的未附接末端，其中第二寡核苷酸包含空间条形码。107.如权利要求106所述的方法，其中该方法在(b)之后还包括：(c)将第三寡核苷酸附接到第二寡核苷酸的未附接末端。108.如权利要求106或权利要求107所述的方法，其中所述第一寡核苷酸通过其5
′‑
端附接至所述基材，并且所述第二寡核苷酸使用空间定向原位合成在所述第一寡核苷酸的3
′‑
端上产生。109.如权利要求106或权利要求107所述的方法，其中所述第一寡核苷酸通过其3
′‑
端附接至所述基材，并且所述第二寡核苷酸使用空间定向原位合成在所述第一寡核苷酸的5
′‑
端上产生。110.如权利要求106
‑
109中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的磷酸二酯和环外胺部分被保护。111.如权利要求106
‑
110中任一项所述的方法，其中第二寡核苷酸的长度选自8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、25个核苷酸、26个核苷酸、27个核苷酸、28个核苷酸、29个核苷酸或30个核苷酸。112.如权利要求108
‑
111中任一项所述的方法，其中该原位合成是光定向合成。113.如权利要求106
‑
112中任一项所述的方法，其中基材的区域小于约2500μm2、小于约1600μm2、小于约400μm2、小于约100μm2、小于约50μm2、小于约25μm2、小于约15μm2、小于约10μm2或小于约5μm2。114.如权利要求106
‑
113中任一项所述的方法，其中两个或更多个第二寡核苷酸附接至两个或更多个第一寡核苷酸，其中两个或更多个第二寡核苷酸的成员不同于两个或更多个第二寡核苷酸的另一个成员。115.如权利要求106
‑
114中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含受保护的磷酸二酯和环外胺部分。116.如权利要求106
‑
115中任一项所述的方法，其中所述基材还包含与所述第一寡核苷酸杂交的基本上互补的寡核苷酸。
117.如权利要求106
‑
116中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸的长度为至少约2个核苷酸、5个核苷酸、8个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、18个核苷酸、20个核苷酸、22个核苷酸、25个核苷酸、27个核苷酸、30个核苷酸、33个核苷酸或35个核苷酸。118.如权利要求106
‑
117中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸的长度为约2至45个核苷酸、5至40个核苷酸、15至40个核苷酸、25至40个核苷酸、25至35个核苷酸或27至33个核苷酸。119.如权利要求106
‑
118中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸通过在所述基材外合成而被制备，并且所述第一寡核苷酸随后被附接至所述基材。120.如权利要求119所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的磷酸二酯和环外胺部分在第一寡核苷酸与基材附接之前被保护。121.如权利要求119或120所述的方法，其中第一寡核苷酸的磷酸二酯和环外胺部分在第一寡核苷酸附接到基材之后被保护。122.如权利要求106
‑
118中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸通过在所述基材上原位合成来制备。123.如权利要求122所述的方法，其中原位合成不是光定向合成。124.如权利要求122所述的方法，其中原位合成不是空间定向合成。125.如权利要求106
‑
124中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含含有裂解位点的序列。126.如权利要求106
‑
125中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸通过接头附接至所述基材。127.如权利要求126所述的方法，其中所述接头包含含有以下的化学基团：硅烷、胺、肽、聚乙二醇、生物素、脱硫生物素、链霉亲和素、硫醇、丙烯酸酯、叠氮化物、地高辛、己炔基或其组合。128.如权利要求127所述的方法，其中所述接头是支化接头或树枝状接头。129.如权利要求107
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128中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸通过连接附接至所述第二寡核苷酸。130.如权利要求129所述的方法，其中在将第三寡核苷酸连接到第二寡核苷酸之前，去除第一和第二寡核苷酸的任何受保护部分。131.如权利要求107
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130中任一项所述的方法，其中多个第三寡核苷酸的长度为至少约5个核苷酸、7个核苷酸、9个核苷酸、13个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、27个核苷酸、30个核苷酸、33个核苷酸、或35个核苷酸。132.如权利要求107
‑
131中任一项所述的方法，其中多个第三寡核苷酸的长度为约5至40个核苷酸、5至20个核苷酸、5至10个核苷酸、10至35个核苷酸、15至30个核苷酸、25至35个核苷酸或27至33个核苷酸。133.如权利要求107
‑
132中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸在3
′‑
端包含长度至少为6个核苷酸的捕获域。134.如权利要求133所述的方法，其中所述捕获域包含多聚
‑
t序列。135.如权利要求107
‑
134中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸包含长度为6至20个核苷酸的随机序列。
136.一种组合物，其包含附接于基材上多个区域的多个寡核苷酸，其中所述多个寡核苷酸中的寡核苷酸包含：通过其3
′
端或5
′
端与基材附接的长度为2至50个核苷酸的第一寡核苷酸；和附接到第一寡核苷酸的未附接末端的长度为8至30个核苷酸的第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸包含空间条形码。137.如权利要求136所述的组合物，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸包含被保护的磷酸二酯和环外胺部分。138.如权利要求136
‑
137中任一项所述的组合物，其中第一寡核苷酸通过其5’端附接至所述基材，并且第二寡核苷酸附接至第一寡核苷酸的3’端。139.如权利要求136
‑
138中任一项所述的组合物，其中第一寡核苷酸通过其3’端附接至所述基材，并且第二寡核苷酸附接至第一寡核苷酸的5’端。140.如权利要求136
‑
139中任一项的组合物，其中所述寡核苷酸还包含：附接到第二寡核苷酸的未附接末端的长度为5至40个核苷酸的第三寡核苷酸，其中第三寡核苷酸包含捕获域。141.如权利要求136
‑
140中任一项所述的组合物，其中第二寡核苷酸的长度选自8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、25个核苷酸、26个核苷酸、27个核苷酸、28个核苷酸、29个核苷酸或30个核苷酸。142.如权利要求136
‑
141中任一项所述的组合物，其中所述区域小于约2500μm2、小于约1600μm2、小于约400μm2、小于约100μm2、小于约50μm2、小于约25μm2、小于约15μm2、小于约10μm2、小于约5μm2或小于约1μm2。143.如权利要求136
‑
142中任一项所述的组合物，其中各个区域中的寡核苷酸的长度为至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸或至少60个核苷酸。144.如权利要求136
‑
143中任一项所述的组合物，其中各个区域的寡核苷酸的长度为15至100个核苷酸、20至100个核苷酸、40至100个核苷酸、50至90个核苷酸或60至80个核苷酸。145.一种产生空间阵列的方法，其包括：(a)提供基材；(b)将多组引物固定在基材上，其中多组引物的第一组包括第一引物和第二引物；(c)提供包含空间条形码结构域的反向互补物、捕获域的反向互补物、能够与第一引物杂交的第一杂交域和第二杂交域的模板寡核苷酸，其中第二杂交域的反向互补杂交域能够与第二引物杂交；(d)将模板寡核苷酸与第一引物杂交；(e)使用模板寡核苷酸作为模板来延伸第一引物以产生包含第一引物、空间条形码和捕获域的捕获探针，所述捕获探针固定在基材上；和(f)从捕获探针释放模板寡核苷酸，从而产生空间阵列。146.如权利要求145所述的方法，还包括扩增所述捕获探针以产生一个或多个捕获探
针的簇。147.如权利要求146所述的方法，其中扩增包括：(a)将捕获探针与第二引物杂交；(b)使用捕获探针作为模板来延伸第二引物以产生固定在基材上的模板寡核苷酸的拷贝；(c)将模板寡核苷酸的拷贝与多个引物的第二组的第一引物杂交；和(d)使用模板寡核苷酸的拷贝作为模板来延伸多个引物的第二组的第一引物以产生固定在基材上的捕获探针的拷贝，其中捕获探针的簇包含捕获探针和捕获探针的拷贝。148.如权利要求145
‑
147中任一项所述的方法，其中所述模板寡核苷酸包含独特分子标识符(umi)的反向互补物，并且其中所产生的捕获探针包含所述umi。149.如权利要求145
‑
148中任一项所述的方法，其中第一引物在第一引物的5
′
端被附连到该基材上。150.如权利要求145
‑
149中任一项所述的方法，其中第一引物包含与所述模板寡核苷酸互补的序列。151.如权利要求145
‑
150中任一项所述的方法，其中第一引物包含多聚(a)结构域。152.如权利要求145
‑
151中任一项所述的方法，其中第一引物包含裂解域。153.如权利要求145
‑
152中任一项所述的方法，其中第二引物在第二引物的5
′
端被附连到基材。154.如权利要求145
‑
153中任一项所述的方法，其中第二引物包含裂解域。155.如权利要求154所述的方法，其中在产生捕获探针的拷贝后，通过裂解裂解域来释放模板寡核苷酸的拷贝。156.如权利要求145
‑
155中任一项所述的方法，其中所述模板寡核苷酸附接至珠。157.如权利要求156所述的方法，还包括：在使用模板寡核苷酸作为模板来延伸第一引物的步骤之后将珠与模板寡核苷酸分离，以产生包括第一引物、空间条形码和捕获域的捕获探针，其中捕获探针固定在基材上。158.如权利要求156或157所述的方法，其中所述珠是凝胶珠。159.如权利要求156
‑
158中任一项所述的方法，其中所述珠的直径为2微米或更小。160.如权利要求156
‑
158中任一项所述的方法，其中所述珠的直径为1微米或更小。161.如权利要求156
‑
160中任一项所述的方法，其中在延伸所述第一引物的步骤之前去除所述珠。162.如权利要求156
‑
160中任一项所述的方法，其中在延伸所述第一引物的步骤之后去除所述珠。163.如权利要求145
‑
162中任一项所述的方法，其中确定所产生的捕获探针的全部或部分序列。164.如权利要求163所述的方法，其中在释放所述模板寡核苷酸之后确定所产生的捕获探针的全部或部分序列。165.如权利要求163或164所述的方法，其中原位确定所产生的捕获探针的全部或部分序列。166.如权利要求165所述的方法，其中所产生的捕获探针的全部或部分序列通过原位
测序确定。167.如权利要求166所述的方法，其中通过合成测序(sbs)、顺序荧光杂交、连接测序、核酸杂交或高通量数字测序技术进行原位测序。168.如权利要求145
‑
167中任一项所述的方法，其中所述捕获域包含与感兴趣的分析物互补的序列。169.如权利要求145
‑
168中任一项所述的方法，其中所述捕获域包括多聚(t)域。170.如权利要求145
‑
169中任一项所述的方法，其中所述基材包括玻璃载玻片。171.如权利要求170所述的方法，其中所述玻璃载玻片是经处理的玻璃载玻片。172.一种用于确定生物样品中分析物位置的方法，包括：(a)使用如权利要求146
‑
170中任一项所述的方法制备空间阵列；(b)通过确定一个或多个捕获探针的空间条形码的全部或部分序列来解码一个或多个捕获探针，从而将一个或多个捕获探针的空间条形码与空间阵列上的位置相关联；(c)在分析物与捕获探针特异性结合的条件下使生物样品与空间阵列接触；(d)通过使用分析物作为模板的聚合反应延伸一个或多个捕获探针以产生延伸的一个或多个捕获探针，其包含一个或多个捕获探针和分析物的反向互补物；和(e)确定延伸的一个或多个捕获探针的序列，并将一个或多个捕获探针的空间条形码与分析物相关联，从而确定分析物在生物样品中的位置。173.如权利要求172所述的方法，其中一个或多个捕获探针包括模板寡核苷酸和珠。174.如权利要求173所述的方法，还包括在通过使用所述分析物作为模板的聚合反应延伸所述一个或多个捕获探针以产生包含一个或多个捕获探针和分析物的反相互补物的延伸的一个或多个捕获探针的步骤之后，将所述珠与所述模板寡核苷酸分离。175.如权利要求145
‑
174中任一项所述的方法，其中所述第一引物和所述第二引物的比率为1∶1.5至1.5∶1。176.如权利要求145
‑
175中任一项所述的方法，其中第一引物和第二引物相隔小于5μm。177.通过权利要求145
‑
171或175
‑
176中任一项的方法产生的空间阵列。178.一种空间阵列，包括：(a)基材；和(b)固定在基材上的多组引物，其中多组引物的第一组包括第一引物和第二引物；并且其中第一引物包含与捕获探针互补的序列。179.如权利要求178所述的空间阵列，还包括含有独特分子标识符(umi)的反向互补序列的模板寡核苷酸，并且其中所述捕获探针包括所述umi。180.如权利要求178或179所述的空间阵列，其中所述第一引物在所述第一引物的5
′
端处附连至所述基材。181.如权利要求178
‑
180中任一项所述的空间阵列，其中所述第一引物包含与所述模板寡核苷酸互补的序列。182.如权利要求178
‑
181中任一项所述的空间阵列，其中所述第一引物包含多聚(a)结构域。183.如权利要求178
‑
182中任一项所述的空间阵列，其中所述第一引物包含裂解域。
184.如权利要求178
‑
183中任一项所述的空间阵列，其中所述第二引物在所述第二引物的5
′
端处附连至所述基材。185.如权利要求178
‑
184中任一项所述的空间阵列，其中所述第二引物包含裂解域。186.如权利要求178
‑
185中任一项所述的空间阵列，其中所述模板寡核苷酸附接到珠上。187.如权利要求186所述的空间阵列，其中所述珠是凝胶珠。188.如权利要求186或187所述的空间阵列，其中所述珠的直径为2微米或更小。189.如权利要求186或187所述的空间阵列，其中所述珠的直径为1微米或更小。190.如权利要求178
‑
189中任一项所述的空间阵列，其中所述基材包括玻璃载玻片。191.如权利要求190所述的空间阵列，其中所述载玻片是经处理的玻璃载玻片。192.如权利要求177
‑
191中任一项所述的空间阵列，其中所述第一引物和所述第二引物的比率为1∶1.5至1.5∶1。193.如权利要求177
‑
192中任一项所述的方法，其中第一引物和第二引物相隔小于5μm。194.一种产生空间阵列的方法，其包括：(a)提供包含阵列化的多个受体寡核苷酸的基材，其中所述多个受体寡核苷酸中的受体寡核苷酸包含空间条形码和第一连接柄，并且其中所述受体寡核苷酸的5
′
端与所述基材附接；(b)提供包含与第一连接柄互补的序列和与供体寡核苷酸互补的序列的夹板寡核苷酸；和(c)将包含捕获域的供体寡核苷酸连接到受体寡核苷酸的3
′
端以产生捕获探针，从而产生空间阵列。195.如权利要求194所述的方法，其中所述受体寡核苷酸还包含裂解域、独特分子标识符、功能序列或其任何组合。196.如权利要求194或195所述的方法，其中与夹板寡核苷酸的捕获域互补的序列是多聚(a)序列。197.如权利要求194或195所述的方法，其中与夹板寡核苷酸的捕获域互补的序列是基因特异性序列。198.如权利要求197所述的方法，其中基因特异性序列是penk特异性序列。199.如权利要求194或195所述的方法，其中与夹板寡核苷酸的捕获域互补的序列是随机序列。200.如权利要求199所述的方法，其中所述随机序列是六聚体。201.如权利要求194至200中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(c)之后使生物样品接触该空间阵列。202.如权利要求201所述的方法，其中所述方法还包括透化所述生物样品以允许所述生物样品中的分析物与所述捕获探针相互作用。203.如权利要求201或202所述的方法，其中所述方法还包括将生物样品中的分析物迁移到多个捕获探针。204.如权利要求203所述的方法，其中所述迁移包括被动迁移。
205.如权利要求203所述的方法，其中所述迁移包括主动迁移。206.一种产生空间阵列的方法，其包括：(a)提供包含阵列化的多个受体寡核苷酸的基材，其中所述多个受体寡核苷酸中的受体寡核苷酸包含空间条形码和第一连接柄，并且其中所述受体寡核苷酸的5
′
端与所述基材附接；(b)提供包含与第一连接柄互补的序列和与第二连接柄互补的序列的夹板寡核苷酸；和(c)将包含第二连接柄和捕获域的供体寡核苷酸连接到受体寡核苷酸的3
′
端以产生捕获探针，从而产生空间阵列。207.如权利要求206所述的方法，其中所述受体寡核苷酸还包含裂解域、独特分子标识符、功能序列或其任何组合。208.如权利要求206或207所述的方法，其中所述捕获域包含多聚(t)序列。209.如权利要求206或207所述的方法，其中所述捕获域包含基因特异性序列。210.如权利要求209所述的方法，其中基因特异性序列是penk特异性序列。211.如权利要求206或207所述的方法，其中所述捕获域包含随机序列。212.如权利要求211所述的方法，其中所述随机序列是六聚体。213.如权利要求206至212中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(c)之后使生物样品接触该空间阵列。214.如权利要求213所述的方法，其中所述方法还包括透化所述生物样品以允许所述生物样品中的分析物与所述捕获探针相互作用。215.如权利要求213或214所述的方法，其中所述方法还包括将生物样品中的分析物迁移到捕获探针。216.如权利要求215所述的方法，其中所述迁移包括被动迁移。217.如权利要求215所述的方法，其中所述迁移包括主动迁移。218.一种产生与基材结合的捕获探针的方法，包括：将第二溶液分配到被覆有第一溶液的基材表面的部分上，其中在分配后，第一溶液和第二溶液中的分子基本上不相互混合，其中第二溶液包含捕获探针，并且分配导致捕获探针附接到基材表面。219.如权利要求218所述的方法，还包括在步骤(a)之后：固化第二种溶液；和从基材去除第一溶液，其中固化的第二溶液保留在基材的表面上。220.如权利要求218或219所述的方法，其中捕获探针所附接的基材表面的面积小于在不存在第一溶液的情况下通过将第二溶液分配到基材表面上而产生的相应面积。221.如权利要求218或219所述的方法，其中捕获探针所附接的基材表面的面积约两倍小于在不存在第一溶液的情况下通过将第二溶液分配到基材表面上而产生的相应面积。222.如权利要求218所述的方法，所述方法还包括：将第一溶液和第二溶液固化在基材上，从而产生基质。223.如权利要求222所述的方法，其中第一和第二溶液通过化学方法固化。224.如权利要求222所述的方法，其中第一和第二溶液通过光反应方式固化。
225.如权利要求222
‑
224中任一项所述的方法，其还包括：使基质收缩，从而产生具有附接了捕获探针的区域的收缩的基质，其中与基质中的相应面积相比，收缩的基质中的面积减小。226.如权利要求218所述的方法，其中所述方法还包括，在分配第二溶液的步骤之前：固化第一溶液以形成第一溶液基质，其中第一溶液基质可以沿其一个或多个轴可逆地膨胀。227.如权利要求226所述的方法，其中将所述第二溶液分配到所述基材的部分上的步骤包括将第二溶液分配到处于膨胀状态的第一溶液基质的表面上。228.如权利要求227所述的方法，其中该方法还包括，在分配步骤之后：沿基材表面的一个或多个轴收缩第一溶液基质。229.如权利要求218
‑
228中任一项所述的方法，其中第一溶液的粘度比第二溶液的粘度大约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10倍。230.如权利要求218
‑
229中任一项所述的方法，其中与所述第二溶液相比，第一溶液具有较低的核酸扩散率。231.如权利要求218
‑
230中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包括空间条形码。232.如权利要求218
‑
231中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包含独特分子标识符。233.如权利要求218
‑
232中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包含功能域。234.如权利要求218
‑
233中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包含裂解域、空间条形码、独特分子标识符、功能域和捕获域。235.一种产生与基材结合的捕获探针阵列的方法，包括：将第二溶液的液滴分配到被覆有第一溶液的基材表面的部分上，其中在分配之后，第一溶液和第二溶液的液滴中的分子基本上不相互混合，其中第二溶液包含捕获探针，并且分配导致捕获探针附接到基材表面。236.如权利要求235所述的方法，所述方法还包括：固化第二种溶液；和从基材去除第一溶液，其中固化的第二溶液保留在基材的表面上。237.如权利要求235或236所述的方法，其中捕获探针所附接的基材表面的面积小于在不存在第一溶液的情况下通过将第二溶液分配到基材表面上而产生的相应面积。238.如权利要求237所述的方法，其中捕获探针所附接的基材表面的面积约两倍小于在不存在第一溶液的情况下通过将第二溶液分配到基材表面上而产生的相应面积。239.如权利要求235
‑
238中任一项所述的方法，还包括：将第一溶液和第二溶液固化在基材上，从而产生基质。240.如权利要求239所述的方法，其中第一溶液和第二溶液通过化学方法固化。241.如权利要求239所述的方法，其中第一和第二溶液通过光反应方式固化。242.如权利要求239
‑
241中任一项所述的方法，其还包括：使基质收缩，从而产生具有附接了捕获探针的区域的收缩的基质，其中与基质中的相
应面积相比，收缩的基质中的面积减小。243.如权利要求235
‑
242中任一项所述的方法，其中所述方法还包括，在分配第二溶液的步骤之前：固化第一溶液以形成第一溶液基质，其中第一溶液基质可以沿其一个或多个轴可逆地膨胀。244.如权利要求243所述的方法，其中将所述第二溶液分配到所述基材的部分上的步骤包括将第二溶液分配到处于膨胀状态的第一溶液基质的表面上。245.如权利要求244所述的方法，其中该方法还包括，在分配步骤之后：沿基材表面的一个或多个轴收缩第一溶液基质。246.如权利要求235
‑
245中任一项所述的方法，其中第一溶液的粘度比第二溶液的粘度大约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10倍。247.如权利要求235
‑
246中任一项所述的方法，其中与所述第二溶液相比，第一溶液具有较低的核酸扩散率。248.如权利要求235
‑
245中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包括空间条形码。249.如权利要求235
‑
248中任一项所述的方法，其中所述捕获探针中的至少一个包含独特分子标识符。250.如权利要求235
‑
249中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包含功能域。251.如权利要求235
‑
250中任一项所述的方法，其中所述捕获探针包含裂解域、空间条形码、独特分子标识符、功能域和捕获域。252.一种对生物样品中的分析物进行空间概况分析的方法，包括：(a)将第二溶液的液滴分配到被覆有第一溶液的基材的部分表面上，其中分配后，第一溶液中和第二溶液的液滴中的分子基本上不相互混合，其中第二溶液包含捕获探针，并且分配导致捕获探针附接到基材表面；(b)使生物样品与空间阵列接触，从而使得生物样品中存在的分析物被捕获探针捕获；由此确定捕获的分析物的空间分布。253.如权利要求252所述的方法，其中所述捕获探针中的至少一个包括裂解域、空间条形码、独特分子标识符、功能域和捕获域。

技术总结
本公开涉及用于在基材上产生用于识别分析物在生物样品中的位置的捕获探针的组合物和方法。和方法。[转续页]


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：10x基因组学有限公司
技术研发日：2019.12.06
技术公布日：2021/12/7