一种利用内生菌防治腐烂病的方法与流程

技术特征：
1.一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：产紫青霉的制备，将梨树腐烂病发病枝干韧皮部剥离，剪成组织块，投放于75％的乙醇中消毒；将步骤再用1％次氯酸钠消毒，组织经无菌水清洗5次后置于含氨苄青霉素的pda培养基表面；待组织块周围长出菌丝，挑针挑取菌落边缘菌丝或菌块，转移至新的培养基中进行纯化培养；经单孢纯化后得到单一菌株保存备用；s2：制备无菌滤液，将内生真菌jk2接种pda平板上，在25℃下培养7d；用无菌水将孢子洗脱后，用血球计数板统计浓度，并将其调整为108个/ml；接种1ml孢子液于50ml pdb培养基中，获得的发酵液过滤，即得无菌滤液；s3：制备带毒平板，取无菌滤液与冷却到50℃的pda培养基混合倒入平板，制成不同浓度(10％和20％)的带毒平板，以无菌水代替无菌滤液与pda培养基混合；s4：梨树枝条的选取，选取健康、长势一致当年生梨树枝条，经无菌水清洗干净后，用75％乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干；s5：用打孔器在枝条打孔，孔深至木质部；分别用内生真菌上清液或分生孢子(108个/ml)喷施处理打孔枝条，无菌水处理作为阴性对照，戊唑醇处理作为阳性对照；s6：处理后将枝条置于培养箱中保湿2d后，每个孔接种1个直径为0.5cm的梨树腐烂病菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉缠绕，外用封口膜缠绕保湿，置于25℃下光照培养箱中培养。2.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述s1中乙醇消毒时间为1min，且组织块的规格为0.5cm
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0.5cm。3.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述s1中次氯酸钠的消毒时间为3min，所述培养基的成分为马铃薯200g
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1、葡萄糖20g
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1和琼脂粉15g
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1；其中氨苄青霉素的含量为100mg
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1。4.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述s3中培养液于25℃、180r/min条件下振荡培养7d。5.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述s3中，发酵液经10000r/m离心20min后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。6.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述s5中打孔器所用的直径为0.5cm。7.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述s6中的枝条7d后测量病斑长度，并拍照记录。8.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述s6中每次接种10个孔，重复3次，发病率＝(总接种点数
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无病症的接种点数)/总接种点数*100％。

技术总结
本发明涉及梨树腐烂病治疗技术领域，公开了一种利用内生菌防治腐烂病的方法，S1：产紫青霉的制备；S2：制备无菌滤液；S3：制备带毒平板；S4：梨树枝条的选取；S5：用打孔器在枝条打孔，孔深至木质部；S6：处理后将枝条置于培养箱中保湿处理。本发明从梨树腐烂病发病枝条中分离获得一株真菌JK2，经形态学和分子生物学鉴定为青霉属产紫青霉，平板对峙试验显示，该菌株对梨树腐烂病菌具有强烈的抑制活性，抑制率达到95％以上，离体梨树枝条鉴定结果显示，JK2对梨树腐烂病具有良好的防治效果，产紫青霉是一种内生真菌，对环境和人类身体无害，有助于开发生物农药。开发生物农药。开发生物农药。


技术研发人员：袁洪波 涂洪涛 王丽 侯珲
受保护的技术使用者：中国农业科学院郑州果树研究所
技术研发日：2021.10.13
技术公布日：2021/12/7