高通量检测棉花GhFAD2-1基因高油酸突变位点的KASP分子标记的制作方法

高通量检测棉花ghfad2
‑
1基因高油酸突变位点的kasp分子标记
技术领域
1.本发明涉及一种高通量检测棉花ghfad2
‑
1基因高油酸突变位点的kasp分子标记，属于生物技术领域。


背景技术：

2.棉花是重要的纤维作物和油料作物。纤维仅占棉花经济产量的40％左右，而棉籽约占60％。棉籽中油分含量约为25～39％，是我国第五大食用油来源，仅次于大豆、花生、油菜和向日葵。棉籽油含有较高的不饱和脂肪酸，易被人体吸收，是理想的色拉油、起酥油、人造黄油以及特种油脂的原料。
3.植物油中脂肪酸的组成和含量决定了食用油的营养价值和油脂稳定性。棉籽油中的脂肪酸主要由棕榈酸、油酸和亚油酸组成，其中亚油酸含量较高，约占46.7
‑
58.2％，而油酸含量较低，约占14.7
‑
21.7％。亚油酸(c18:2)为多不饱和脂肪酸，其性质不稳定，热稳定性及抗氧化性能都比较差，不耐储存，高温烹调时易变质；而油酸(c18:1)作为单不饱和脂肪酸，具有较高的稳定性且在烹调过程中不易产生反式脂肪酸，受到广大消费者青睐，被营养学界誉为“安全脂肪酸”。高油酸(70％以上)食用油及其制品凭借其耐氧化、抗血栓、抗高血压和降低血脂浓度的特性，成为人们关注的热点。因此，提高棉籽的油酸含量成为棉籽油品质改良的重要目标。
4.fad2基因是控制植物籽粒油酸、亚油酸含量的关键基因，其编码的δ
12
‑
脂肪酸脱饱和酶催化油酸(c18:1)进一步脱饱和形成亚油酸(c18:2)。陆地棉为异源四倍体(2n＝4x＝52，基因组aadd)，其基因组中含有8个fad2同源基因，其中ghfad2
‑
1a/d主要在种子中表达，是催化油酸形成亚油酸的关键基因(徐孝兰等，2019；chen et al.,2021)。ghfad2
‑
1a和ghfad2
‑
1d是位于不同亚基因组上的同源基因，两个基因对油酸、亚油酸含量均有贡献，这两个基因的转录同时受到抑制或酶活降低，棉籽会表现出高油酸性状。目前，仅在海岛棉中发现3份fad2
‑
1d单基因自然突变的种质材料，油酸含量提高至42％(shockey et al.,2017)。陆地棉中尚未发现自然突变或人工诱变的高油酸突变体。2002年，liu等利用rnai技术抑制棉花fad2基因的表达，创制出油酸含量高达77％的转基因棉花新材料。
5.2021年，我们实验室以棉花ghfad2
‑
1a/d基因为靶标，在其fatty acid desaturase结构域设计了1个靶点，利用prgeb32
‑
ghu6.9
‑
npt ii载体构建了ghfad2
‑
1a/d基因的crispr/cas9基因编辑载体，通过农杆菌转化棉花品系jin668，在t1代中检测到了4个非转基因(无载体筛选标记基因)高油酸材料(m1
‑
2、m1
‑
3、m20
‑
2和m27
‑
3)，将棉籽的油酸含量从14％提高到78％，亚油酸含量从59％降低到7％(chen et al.,2021)。经检测，m1
‑
2的ghfad2
‑
1a基因(ghir_a13g022660.1,hau assembly)编码区429nt处插入1个t碱基，产生移码突变；ghfad2
‑
1d基因(ghir_d13g023320.1,hau assembly)编码区429nt处插入1个a碱基，也产生了移码突变。我们以m1
‑
2为父本，分别与多个优质、高产、抗病棉花品种杂交，期望将高油酸性状转入当前主栽棉花品种中。但是利用sanger测序方法检测杂交后代，检测
效率低，检测周期长，检测成本较高，棉花高油酸育种和生产中亟需高通量检测方法。


技术实现要素：

6.本发明针对crispr/cas9基因编辑创制的高油酸棉花新种质m1
‑
2，提供高通量快速检测棉花ghfad2
‑
1a和ghfad2
‑
1d基因高油酸突变位点的分子标记kasp
‑
a429和kasp
‑
d429。本发明设计了ghfad2
‑
1a基因和ghfad2
‑
1d基因的特异性扩增引物及通用引物，建立了应用lgc高通量标记检测平台检测棉花ghfad2
‑
1a基因和ghfad2
‑
1d基因等位变异的方法，该方法将使得棉花高油酸育种过程中的大群体筛选变得更为高效、经济、简单、准确。
7.本发明的技术方案是：一种高通量检测棉花ghfad2
‑
1基因高油酸突变位点的kasp分子标记，其特征是，
8.与ghfad2
‑
1a核苷酸突变位点连锁的kasp分子标记为kasp
‑
a429，核苷酸序列为：5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtca[t/
‑
]ccactcgaacaccggttccatggagcgtgacgaagtattcgtgcccaaacccaagtctaaattatcatgctttgcgaaatacttaaacaatccacccggtcgagt
‑3’
(seq id no.1)；
[0009]
与ghfad2
‑
1d核苷酸突变位点连锁的kasp分子标记为kasp
‑
d429，其核苷酸序列为：5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtca[a/
‑
]ccactcgaacaccggttccatggagcgtgacgaagtattcgtgcccaaacccaagtctaaattatcatgctttgcgaaatacttcaacaatccacccggtcgag
‑3’
(seq id no.2)。
[0010]
本发明还提供了一种高通量检测棉花ghfad2
‑
1基因高油酸突变位点的kasp分子标记引物，其特征在于，
[0011]
1)kasp
‑
a429的引物组为：
[0012]
kasp
‑
a429的特异性上游引物ghfad2
‑
1a
‑
hex:5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtcat
‑3’
(seq id no.3)；
[0013]
kasp
‑
a429的特异性下游引物ghfad2
‑
1a
‑
r:5
’‑
actcgaccgggtggattgttt
‑3’
(seq id no.4)；
[0014]
通用上游引物：ghfad2
‑
1ad
‑
fam:5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtcac
‑3’
，(seq id no.5)；
[0015]
2)kasp
‑
d429的引物组为：
[0016]
kasp
‑
d429的特异上游引物ghfad2
‑
1d
‑
hex:5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtcaa
‑3’
，(seq id no.6)；
[0017]
kasp
‑
d429的特异下游引物ghfad2
‑
1d
‑
r:5
’‑
ctcgaccgggtggattgttg
‑3’
，(seq id no.7)；
[0018]
通用上游引物：ghfad2
‑
1ad
‑
fam:5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtcac
‑3’
，(seq id no.5)。
[0019]
本发明还公开了一种高通量检测棉花ghfad2
‑
1基因高油酸突变位点的(用于确定棉花样品中ghfad2
‑
1a和ghfad2
‑
1d编码区429nt核苷酸突变位点)的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒至少包括seq id no.3
‑
7所示的pcr扩增引物。进一步的，上述检测试剂盒还包括2
×
kasp mix和棉花样品基因组dna。
[0020]
本发明还公开了一种鉴定棉花ghfad2
‑
1基因高油酸性状表型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
[0021]
采用seq id no.3
‑
7所示的pcr扩增引物对待测棉花样品的基因组dna进行pcr扩
增；
[0022]
采用分子标记kasp
‑
a429引物组进行pcr扩增鉴定目标indel基因型的结果判断为：如果待测棉花样品扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近竖轴(hex信号)，则判定待测棉花样品ghfad2
‑
1a基因编码区第429位碱基处只检测到t，为纯和高油酸突变基因，基因型定义为aa，若待测棉花样品扩增产物的荧光信号数据靠近横轴(fam信号)，则判定待测棉花样品ghfad2
‑
1a基因编码区第429位碱基处没有发生碱基插入突变，为纯和正常油酸棉花(野生型)，基因型定义为aa，如待测棉花扩增产物的荧光信号数据位于横轴和竖轴中间(fam信号和hex信号)，则判定棉花样品为杂合体，基因型定义为aa；
[0023]
采用分子标记kasp
‑
d429引物组进行pcr扩增鉴定目标indel基因型的结果判断为：如果待测棉花样品扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近竖轴(hex信号)，则判定待测棉花样品ghfad2
‑
1d基因编码区第429位碱基处只检测到a，为纯和高油酸突变基因，基因型定义为bb，若待测棉花样品扩增产物的荧光信号数据靠近横轴(fam信号)，则判定待测棉花样品ghfad2
‑
1d基因编码区第429位碱基处没有发生碱基插入突变，为纯和正常油酸棉花(野生型)，基因型定义为bb，如待测棉花扩增产物的荧光信号数据位于横轴和竖轴中间(fam信号和hex信号)，则判定棉花样品为杂合体，基因型定义为bb；
[0024]
将kasp
‑
a429和kasp
‑
d429的检测结果结合，如检测棉花样品中ghfad2
‑
1a和ghfad2
‑
1d同时发生纯和突变，基因型为aabb，则该棉花样品为高油酸棉花样品。
[0025]
本发明的有益效果是：目前采用的检测方法为sanger测序法，该方法检测周期长、成本高、通量低，而本发明建立的ghfad2
‑
1a/d indel基因分型的kasp高通量检测体系，将使得棉花高油酸育种过程中的大群体筛选变得更为高效、经济、简单、准确。
附图说明
[0026]
图1为利用kasp标记检测96份测试棉花材料的分型图。
具体实施方式
[0027]
以下结合实施例及来说明附图来说明其效果。
[0028]
实施例1：棉花高油酸性状基因ghfad2
‑
1a和ghfad2
‑
1d紧密连锁kasp标记开发
[0029]
1.kasp引物设计
[0030]
提取ghfad2
‑
1a/d基因编码区429nt位点左右各100bp的侧翼序列，利用primer5.0软件设计3组kasp引物，利用douglas scientific公司arraytape平台检测后，标记kasp
‑
a429和kasp
‑
d429扩增效果和多态性最佳，可以明显区分出ghfad2
‑
1a和ghfad2
‑
1d在野生型和高油酸突变型中的indel差异。
[0031]
分子标记kasp
‑
a429的引物为：
[0032]
1)两条特异性引物：
[0033]
ghfad2
‑
1a
‑
hex:5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtcat
‑3’
，如seq id no.3所示；
[0034]
ghfad2
‑
1a
‑
r:5
’‑
actcgaccgggtggattgttt
‑3’
，如seq id no.4所示；
[0035]
2)一条通用引物：
[0036]
ghfad2
‑
1ad
‑
fam:5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtcac
‑3’
，如seq id no.5所示；
[0037]
分子标记kasp
‑
d429的引物为：
[0038]
1)两条特异性引物：
[0039]
ghfad2
‑
1d
‑
hex:5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtcaa
‑3’
，如seq id no.6所示；
[0040]
ghfad2
‑
1d
‑
r:5
’‑
ctcgaccgggtggattgttg
‑3’
，如seq id no.7所示；
[0041]
2)一条通用引物：
[0042]
ghfad2
‑
1ad
‑
fam:5
’‑
gaaaatcagtcaccgccgtcac
‑3’
，如seq id no.5所示。
[0043]
kasp标记均含有两条正向引物和一条反向引物，kasp
‑
a429的正向引物为ghfad2
‑
1ad
‑
fam和ghfad2
‑
1a
‑
hex，反向引物为ghfad2
‑
1a
‑
r。kasp
‑
d429的正向引物为ghfad2
‑
1ad
‑
fam和ghfad2
‑
1d
‑
hex，反向引物为ghfad2
‑
1d
‑
r。两条正向引物的3’末端为等位变异碱基，5’端分别连接英国lgc公司kasp试剂中特定的fam和hex荧光接头序列。
[0044]
2.dna提取
[0045]
采用常规ctab法从棉花幼嫩叶片中提取基因组dna。
[0046]
3.kasp反应测试
[0047]
荧光定量pcr扩增体系为：2.5μl棉花样品基因组dna(40ng/μl)，2.5μl lgc公司2
×
kasp mix(low rox)，0.07μl引物混合液(正向引物fam:正向引物hex:反向引物r＝2:2:5的摩尔浓度比)；
[0048]
pcr反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55
‑
62℃(优选55℃)退火60s，40个循环。
[0049]
其中，2
×
kasp mix由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a、淬灭探针b、高保真taq酶、dntp、mg
2
等组成；荧光探针a的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt
‑3’
，5’末端连接一个hex荧光基团；荧光探针b的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct
‑3’
，其5’末端连接一个fam荧光基团；淬灭探针a的核苷酸序列为：5
’‑
aatccgttgactccgaccttc
‑3’
，其3’末端连接一个淬灭基团bhq；淬灭探针b的核苷酸序列为：5
’‑
agcatgaacttggtcaccttc
‑3’
，其3’末端连接一个淬灭基团bhq。
[0050]
pcr完成后，通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光数据，再经douglas基因分型软件分析。
[0051]
采用分子标记kasp
‑
a429引物组的鉴定目标indel的基因型(图1)：如果待测棉花样品扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近竖轴(hex信号)，则判定待测棉花样品ghfad2
‑
1a基因编码区第429位碱基处只检测到t，为纯和高油酸突变基因，基因型定义为aa，若待测棉花扩增产物的荧光信号数据靠近横轴(fam信号)，则判定待测棉花样品ghfad2
‑
1a基因编码区第429位碱基处没有发生碱基插入突变，为纯和正常油酸棉花(野生型)，基因型定义为aa，如待测棉花扩增产物的荧光信号数据位于横轴和竖轴中间(fam信号和hex信号)，则判定棉花样品为杂合体，基因型定义为aa；
[0052]
采用分子标记kasp
‑
d429引物组的鉴定目标indel的基因型(图1)：如果待测棉花样品扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近竖轴(hex信号)，则判定待测棉花样品ghfad2
‑
1d基因编码区第429位碱基处只检测到a，为纯和高油酸突变基因，基因型定义为bb，若待测棉花扩增产物的荧光信号数据靠近横轴(fam信号)，则判定待测棉花样品ghfad2
‑
1d基因编码区第429位碱基处没有发生碱基插入突变，为纯和正常油酸棉花(野生型)，基因型定义为bb，如待测棉花扩增产物的荧光信号数据位于横轴和竖轴中间(fam信号和hex信号)，则判定棉花样品为杂合体，基因型定义为bb；
[0053]
将kasp
‑
a429和kasp
‑
d429结果结合，如检测棉花样品中ghfad2
‑
1a和ghfad2
‑
1d同时发生纯和突变，基因型为aabb，则该样品为高油酸棉花样品。
[0054]
实施例2：kasp标记的应用
[0055]
为了验证本发明的kasp标记的实用性，利用表1所述的棉花材料进行检测分析。其中，h01
‑
h92为鲁棉418为母本与高油酸棉花突变体m1
‑
2(chen yizhen,fu mingchuan,li hao,et al.,high
‑
oleic acid content,nontransgenic allotetraploid cotton(gossypium hirsutum l.)generated by knockout of ghfad2 genes with crispr/cas9 system.plant biotechnology journal,2021,19:424
‑
426.)为父本杂交配制的f2分离群体，h93和h94为高油酸棉花突变体m1
‑
2，用作阳性对照，h95和h96为鲁棉418，用作阴性对照。
[0056]
表1棉花分离群体的表型与基因型信息kasp引物表
[0057]
[0058][0059]
结果如表1及图1所示，经过kasp分析，在92份f2分离群体单株中，检测到12份单株基因型与阳性对照m1
‑
2一致。同时，利用sanger测序方法分析表1中所述的96份材料，结果表明：分子标记kasp
‑
a429的检测结果与sanger测序分析结果完全一致，分子标记kasp
‑
d429的检测在h25、h54和h56样品中没有信号，其他93个材料的kasp检测结果与sanger测序分析结果一致。从分析结果可以看出：该高通量检测体系，使得棉花高油酸育种过程中的大群体筛选变得更为高效、经济、简单、准确。