用于检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的基因及应用的制作方法

1.本发明属于寄生虫分子检测技术领域，具体涉及用于检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的基因及应用。


背景技术：

2.捻转血矛线虫是羊的主要寄生虫之一；感染性幼虫在进入羊体3d后即开始吸血，同时引起寄生部位的出血和炎症反应，在感染后10～12d宿主即可出现贫血；对于成年捻转血矛线虫而言，每天每条虫体可导致羊失血30～80μl，而贫血程度很大程度上与羊只血液代偿性生成能力有关。捻转血矛线虫感染的危害与摄入感染性幼虫数量、宿主对其抵抗力以及造血能力息息相关。
3.由于捻转血矛线虫具有极强的遗传多样性，在面对复杂的环境变化时，具备极强的应对不同环境的潜力。因此，在羊只活动的所有地区，几乎都存在捻转血矛线虫，随时可能爆发捻转血矛线虫病。
4.捻转血矛线虫病药物防控技术主要包括预防性驱虫和治疗性驱虫。在药物选择方面，由于伊维菌素具有广谱、高效，易于操作等特点，深受农牧民及养殖业主的欢迎，故被广泛用于羊捻转血矛线虫病的防控。但是，长期频繁盲目的用药，会使得捻转血矛线虫对伊维菌素产生广泛的耐药性，致使其很难达到理想的驱虫效果。目前为止，还未见公认的适用于检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的分子生物学方法。
5.因此，如何利用分子手段检测捻转血矛线虫对伊维菌素的敏感性成为本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明公开了用于检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的基因，可利用其进行捻转血矛线虫伊维菌素敏感性的特异性检测。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.用于检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的基因，核苷酸序列如seq id no:1所示：
9.ctagttcaatgcaagatttcaatcgttcattcgattcrcaaagtgcactagcatacggtggacctcaagcaactccgattggagttggtgtagcgcctcaacaagttccgatcacaatggatccyagacctgtmccactctaccgaggaaatcag。
10.用于检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的基因，核苷酸序列如seq id no:2所示：
11.catgatgggcgtctcggagttggagatagaattttagctgtgagacttttttttcataaaatccagatttctcttttaaatggctaggatgtactcttaaaaaaagactttcaggttgatgacatcggacttgagaatgttacacatgagtatgccgtcgatgtattgaagcgaaccggcacgaaagtcacattgttggtgcttaaagcagacccaaatgtgaatgtcagctcaattgaagaaactgcaagccgtcagtatgttgcatccactccacaatatcctcagacaacgcc
aatcagatgtgagcttcctccattttttatgtgttctcgtgtggtgctcatgagacttggaatcctgaagtgtatagaataccaatgggccgttttagctagttcaatgcaagatttcaatcgttcattcgattcrcaaagtgcactagcatacggtggacctcaagcaactccgattggagttggtgtagcgcctcaacaagttccgatcacaatggatccyagacctgtmccactctaccgaggaaatcaggcacggttattcctttattattgtagtgacggattatttcatgcttgcctttgtgttttttcattaagttttcgttcttccaaaagggttacagtgggtaagactcttgggcacagcatgagatgaggatgcggcatgatcga；
12.其中395
‑
549bp为cds区，如seq id no:1所示。
13.上述基因编码l27
‑
1、pdz、src同源结构以及鸟苷酸激酶结构域蛋白，通过该基因中的三个snp位点，可分析捻转血矛线虫对伊维菌素的敏感性。
14.进一步地，seq id no:1或seq id no:2所示基因在检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性中的应用：根据seq id no:1所示基因的第38位、125位、134位单核苷酸的多态性分析捻转血矛线虫对伊维菌素的敏感性。
15.进一步地，seq id no:1所示基因第38位呈g/a多态性，第125位呈t/c多态性，第134位呈c/a多态性；
16.待检测捻转血矛线虫基因中存在38g、125t、134c中至少一个，则对伊维菌素敏感。
17.seq id no:1或seq id no:2所示基因在制备检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的试剂盒中的应用。
18.一种检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的试剂盒，包括用于扩增seq id no:1或seq id no:2所示基因的上游引物和下游引物。
19.优选地，上游引物为hcis
‑
f：5
’‑
catgatgggcgtctcggagt
‑3’
，seq id no:3；
20.下游引物为hcis
‑
r：5
’‑
tcgatcatgccgcatcctca
‑3’
，seq id no:4。
21.优选地，上述检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的试剂盒，还包括标准对照品；
22.标准对照品为携带seq id no:1或seq id no:2所示基因的重组质粒。
23.一种检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的方法，包括如下步骤：
24.(1)提取待检测捻转血矛线虫基因组dna；
25.(2)以步骤(1)获得的dna为模板，扩增seq id no:1或seq id no:2所示基因；
26.(3)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对出现目的条带的扩增产物测序；
27.(4)对测序所得序列进行分析，确定待检测捻转血矛线虫所在群体是否对伊维菌素敏感。
28.优选地，使用上述试剂盒进行检测；
29.pcr扩增反应条件为：
30.95℃预变性5min；
31.95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；
32.72℃延伸5min；
33.保存于4℃。
34.综上所述，本发明提供了用于检测捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性的基因，利用该基因制备检测试剂盒进行捻转血矛线虫伊维菌素敏感性的检测，特异性强，使用方便，为兽医临床用药提供指导。
附图说明
35.图1所示为pcr产物琼脂糖凝胶电泳结果；
36.图中为部分样本结果，其余相同省略；
37.其中，泳道1
‑
5为待检测样本，泳道6为阴性对照(灭菌蒸馏水)。
38.图2所示为各样本cds区测序结果。
具体实施方式
39.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.实施例1
41.将新采集的捻转血矛线虫用75％酒精固定，开始检测时，取保存于75％酒精中的捻转血矛线虫成虫(包括对伊维菌素耐药(hc
‑
r)和对伊维菌素敏感(hc
‑
s)的样本)，用去离子水漂洗3～5次，用于dna提取。所有虫体基因组dna提取过程均按照dna提取试剂盒说明进行。dna提取完成后，全部使用核酸蛋白检测仪进行dna浓度测定。
42.以鉴定合格的样本dna为模板，扩增hcoi01200700基因(seq id no:2所示)：
43.catgatgggcgtctcggagttggagatagaattttagctgtgagacttttttttcataaaatccagatttctcttttaaatggctaggatgtactcttaaaaaaagactttcaggttgatgacatcggacttgagaatgttacacatgagtatgccgtcgatgtattgaagcgaaccggcacgaaagtcacattgttggtgcttaaagcagacccaaatgtgaatgtcagctcaattgaagaaactgcaagccgtcagtatgttgcatccactccacaatatcctcagacaacgccaatcagatgtgagcttcctccattttttatgtgttctcgtgtggtgctcatgagacttggaatcctgaagtgtatagaataccaatgggccgttttagctagttcaatgcaagatttcaatcgttcattcgattcrcaaagtgcactagcatacggtggacctcaagcaactccgattggagttggtgtagcgcctcaacaagttccgatcacaatggatccyagacctgtmccactctaccgaggaaatcaggcacggttattcctttattattgtagtgacggattatttcatgcttgcctttgtgttttttcattaagttttcgttcttccaaaagggttacagtgggtaagactcttgggcacagcatgagatgaggatgcggcatgatcga；
44.其中395
‑
549bp为cds区，如seq id no:1所示。
45.设计扩增引物如下：
46.上游引物hcis
‑
f：5
’‑
catgatgggcgtctcggagt
‑3’
，seq id no:3；
47.下游引物hcis
‑
r：5
’‑
tcgatcatgccgcatcctca
‑3’
，seq id no:4。
48.pcr反应体系：25μl体系中加入hcis
‑
f、hcis
‑
r(20mmol/l)各0.5μl，2
×
pcr mix 12.5μl，dna模板1μl，无菌无酶水10.5μl。
49.pcr扩增条件：95℃，5min；95℃，30s，56℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；4℃，保存。
50.经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，所有检测样本在琼脂糖凝胶上均出现了690bp左右的目的条带，表明基因扩增成功，产物可进行测序和用于特异性位点的snp分析。
51.将产物直接送公司测序(双向)。
52.对测序成功的捻转血矛线虫hcoi01200700基因cds区序列中第38位、125位、134位
单核苷酸的多态性进行分析，结果如图1、表1所示。
53.表1
[0054][0055]
所有测序成功的38个hc
‑
s样本中，在38(g)、125(t)和134(c)位点3个snp占比分别为52.6％、57.9％和57.9％，在13个hc
‑
r样本中，38(g)、125(t)和134(c)占比均为0％。表明38(g)、125(t)和134(c)3个snp只存在于对伊维菌素敏感的捻转血矛线虫中。在13个hc
‑
r样本中，38(a)、125(c)和134(a)占比均为100％。
[0056]
进一步地，分别以38(g)、125(t)和134(c)位点不同组合为评价指标来评价捻转血矛线虫对伊维菌素敏感性，如表2所示。
[0057]
表2
[0058][0059]
表中特异性指在符合对应评价标准的捻转血矛线虫中对伊维菌素敏感的样本比例；敏感性指符合对应评价标准的敏感捻转血矛线虫在敏感捻转血矛线虫总量中的占比。各组特异性均为100％，敏感性为52.6％到63.2％。可见，本发明检测方法特异性强，待检测捻转血矛线虫基因中存在38(g)、125(t)和134(c)中至少一个，则对伊维菌素敏感。
[0060]
进一步地，可将38(g)、125(t)、134(c)对应的seq id no:2所示基因插入载体构建重组质粒，作为敏感标准对照品。
[0061]
对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中
所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，也不仅限于所选基因片段，而是根据整个hcoi01200700基因获得的任何含有上述3个snp位点的基因片段。