一种提高母牛繁殖效率的方法与流程

1.本发明涉及一种提高母牛繁殖效率的方法。


背景技术：

2.牛是单胎动物，自然状态下其繁殖周期较长、繁殖率较低。通常为3年2胎、1胎1犊，偶见1胎双犊、1胎3犊。若按照母牛繁殖年龄10岁计算，其一生最多只能留下7
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8个后代。对奶牛而言，只能留下3
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4头母犊。发育正常的后备母牛初配年龄一般在1.5
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2岁，发情周期一般为21天，妊娠期平均为280天。从牛的生殖特点和生殖周期上看，牛具备1年1胎、1胎多犊的基本条件。因此，研发一种提高母牛繁殖效率、实现1年1胎、1胎多犊的方法对提高养牛效益具有十分重要的意义。
3.现有技术主要有两种： 一、人工授精（ai） 胚胎移植（et）技术； 二、外源激素诱导法：利用促性腺激素如：孕马血清(pmsg)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)、三合激素(itc)、抗血促性素血清(抗pmsg)等诱导母牛产双胎。两种现有技术。
4.现有技术一的技术方案：人工授精（ai） 胚胎移植（et）技术方案主要是在母牛发情后（发情当天计为第0天）第1天进行人工授精使其怀孕，到第7天时在怀孕一侧子宫角的对侧（即：黄体对侧的子宫角）移植1枚胚胎（鲜胚、冻胚均可）以达到提高母牛繁殖率的目的。
5.现有技术一的缺点：人工授精（ai） 胚胎移植（et）技术方案有如下缺点：一是人工授精不能保证母牛怀孕；二是第7天进行胚胎移植时需要做直肠检查，以判断人工授精是否怀孕以及怀孕的位置（子宫角的左侧还是右侧），以此来确定胚胎移植的位置（怀孕一侧子宫角的对侧，即：黄体对侧的子宫角）。此操作容易引起已怀孕的母牛流产；三是如果人工授精一旦怀孕，母牛子宫颈将呈紧缩闭合状态，此时进行胚胎移植时移植枪不容易穿过子宫颈，移植难度增大，且容易导致细菌入侵子宫，进而导致流产，得不偿失。
6.现有技术二的技术方案：外源激素诱导法主要是利用注射促性腺激素如：孕马血清(pmsg)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)、三合激素(itc)、抗血促性素血清(抗pmsg)等诱导母牛在一个排卵期内排多个卵，进而达到提母牛高繁殖率的目的。
7.现有技术二的缺点：外源激素诱导法存在以下缺点：一是外源激素种类繁多、成分各异，效果也不一样，因此选择起来比较困难；二是由于母牛个体差异的存在，无法准确控制用量，即不能保证使用效果；三是使用外源激素后无法准确获知具体排卵数量，一旦排卵数超过2个（多数会超过2个），则怀孕流产的概率大大提高。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的是有效解决现有技术一中操作难度大、易人为导致流产；现有
技术二中激素种类难以选择、使用剂量难以控制以及多胎流产的技术问题。
9.为了解决上述技术问题，本发明采用双胚胎移植技术方案，即：利用胚胎移植技术对受体母牛进行一次移植2枚胚胎的技术方案，从而达到提高母牛繁殖效率的目的。
10.一种提高母牛繁殖效率的方法，包括如下步骤：步骤1：胚胎获取；步骤2：受体母牛同期发情pg法：受体母牛的同期发情与供体母牛在时间上保持一致，即分别在第12天、第26天、第27天上午按2支/头的剂量肌肉注射pg，第28
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29天观察发情并做好记录；步骤3：胚胎装管；步骤4：装枪移植：1）将装有2枚胚胎的细管装入移植枪，移植枪外加套管，套管外加软塑料外套；2）采用直肠把握法将2枚胚胎移植于经同期发情处理好的受体母牛距离子宫角顶端1/2
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1/4深处。移植时注意动作轻柔，避免戳破子宫颈和子宫体造成出血。移植时间尽量控制在5 min内完成；步骤5：受体母牛移植后管理：移植后受体牛的营养水平、应激大小等因素均会影响受胎率。因此在做好常规饲养管理之外，还应注意以下几点：1）移植后的受体牛与其他牛分群饲养；2）保证营养需要，确保移植后成功妊娠、产犊；3）注意观察返情情况，及时进行妊娠检查。移植后28
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60天内可以采用b超或者直肠检查法对受体母牛进行妊娠及胎儿数确认；4）经妊娠检查确定未怀孕的受体牛，应及时配种或移植。
11.所述胚胎获取为购买冷冻胚胎，要求：a级胚胎。
12.所述胚胎获取采用超数排卵 人工授精后第7天对供体母牛活体冲胚获取的a级和/或b级胚胎，包括如下步骤：步骤1：供体母牛选择：选取年龄在2
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5岁、体质健硕，生殖器官发育完整，无繁殖系统疾病的青年母牛或者经产1胎母牛作为供体；步骤2：供体母牛同期发情pg法、超排和人工授精程序：第1天按2支/头剂量肌肉注射pg。第12天再次按2支/头剂量肌肉注射pg；第24天早上7点和晚上7点按3ml/头各肌肉注射fsh 1次；第25天减量按2.5ml/头早、晚7点各肌肉注射fsh 1次。第26天早上7点按2ml/头肌肉注射fsh 1次；晚上7点按2ml/头肌肉注射fsh 1次，2支/头注射pg 1次。第27天早上7点按1ml/头肌肉注射fsh 1次，2支/头注射pg 1次；晚上7点按1ml/头肌肉注射fsh 1次。第28
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29天，观察发情并对发情母牛进行人工授精，人工授精当天记为0天；第29天肌肉注射促排三号20
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30μg/头；步骤3：冲胚：第35天，即人工授精后第7天，进行活体冲胚。
13.所述胚胎获取是通过体外受精培养获得的胚胎；要求：a级胚胎，包括如下步骤：步骤1：处理精子：1）解冻冻精：37℃水浴5秒左右；2）15 ml洗精液中加入200 μl的双抗混匀；
3）取7 ml洗精液加入离心管，先剪开冻精无棉塞一端，将此段浸入离心管洗精液中，再剪开棉塞端，将冻精完全吹入管中，混匀离心5 min，转速1500 r/min；4）离心完毕，去上清，再加入7 ml洗精液离心5 min，转速1500 r/min，完毕去上清；5）测量剩余离心管中洗精液量，添至750 μl，再加入750μl洗卵液混匀；6）做成100 μl液滴受精盘盖油，温箱平衡待用；步骤2：处理卵母细胞：1）卵母细胞成熟后，在洗盘中用100 μl移液枪轻轻吹打物理脱颗粒细胞，尽可能完全去除；2）将去除颗粒细胞后的卵母细胞用洗卵液洗净；步骤3：受精：1）将洗净的卵母细胞放入受精滴盘中；2）100 μl液滴放15
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20枚卵母细胞；3）受精时间达8 h后，尽快将受精卵从受精盘转移至培养盘中；步骤4：体外培养：1）做ivc滴状洗盘一个，培养盘用四孔板每孔500 μl，盖油平衡过夜；2）受精卵外粘连杂质尽可能去除干净；3）洗净后转移至培养盘，每孔不超过50枚。
14.所述胚胎装管，采用的胚胎为冷冻胚胎时，就从液氮罐中取出后在空气中缓慢挥舞10s，即空气浴，然后投入37℃水中解冻，待冰晶全部融化后取出，用细管剪剪开无泡沫塞一端，将胚胎移入保护液中，重复上述程序解冻另一枚胚胎，100倍显微镜下检查胚胎质量，符合a级胚胎的则按照每支细管2枚重新装入细管。重装的时候采用“保护液 空气段 保护液 胚胎 保护液 胚胎 保护液”的方式装管。
15.所述胚胎装管，采用的胚胎为活体冲胚获得的鲜胚和体外受精获得的体外培养胚胎a级和/或b级，则按照“保护液 空气段 保护液 胚胎 保护液 胚胎 保护液”的方式直接装管。
16.所述冲胚包括如下步骤：步骤1：供体牛保定：将供体牛赶至保定架保定；步骤2：直肠检查及外阴清洗：将保定好的供体牛直肠粪便清理干净，检查两侧卵巢黄体发育情况，记录个数；对供体牛外阴用卫生纸或者清水、肥皂水、生理盐水等进行彻底清洗，然后用酒精喷壶喷洒酒精消毒；步骤3：扩张子宫颈：对于育成青年母牛，由于子宫颈闭合较紧，需用扩张棒对子宫颈进行扩张，以便抽取粘液和冲胚管进入子宫。对于经产母牛，此步骤可根据直肠检查情况而定，可用可不用。原则是使粘液泵和冲胚管能够顺利通过子宫颈到达子宫相应位置；步骤4：抽取粘液：术者将清洁的粘液泵经阴道缓慢插入供体牛子宫颈，助手将粘液泵手柄迅速抽出，类似于注射器手柄，使粘液泵胶管瞬间形成真空负压，将子宫颈及子宫体内粘液吸入粘液泵胶管内，缓慢将粘液泵从子宫颈抽出。此步骤可根据粘液抽取情况重复1
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2次，直到粘液基本抽取干净为止；步骤5：麻醉：将4ml盐酸普鲁卡因，或者其它麻醉剂，注射进第二尾椎和第三尾椎
空腔内，对供体母牛进行局部麻醉。麻醉成功判断标准：注射麻醉剂几分钟后轻轻左右晃动牛尾巴无阻力即表示麻醉成功。若有阻力，则需加大麻醉剂量，直到麻醉成功；步骤6：插入冲胚管：将专用的冲胚管通过直肠把握缓慢穿过子宫颈、插入到子宫角。快到子宫角细处的时候将冲胚管内引导钢芯缓慢抽出10
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15cm，使冲胚管前段胶管变成柔性，以便适应子宫角的自然弯曲。当冲胚管到达相应位置后，越深入子宫角细处越好，用20 ml注射器通过冲胚管气孔注射10
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15 ml空气，具体注射的空气量视子宫颈粗细而定，此操作目的是使冲胚管前端“气球”充盈，堵住子宫颈向外的出口，使冲胚液只能通过冲胚管排入漏斗，便于收集胚胎。然后缓慢抽出冲胚管引导钢芯；步骤7：用三通管连接冲胚管和漏斗：通过三通管一端连接冲胚管，一端连接集胚漏斗，另一端预留注射冲胚液，拧紧各部分接口；步骤8：冲胚：冲胚管和三通管连接完毕后，先用止血钳，尖端锯齿部分用医用白胶布绑好，以免损伤透明软管，夹住集胚漏斗端软管；此时用大号注射器100 ml抽取冲胚液37.6℃恒温水浴、60 ml，接入连接软管开口处，轻轻回抽，然后缓慢注射冲胚液进入子宫，直到略微有注射阻力为止；然后将止血钳松开，并夹住连接注射器这根软管，使子宫内冲胚液回流至集胚漏斗，如此反复操作冲洗数次，后期注射速度可以加快，类似于用冲胚液冲涮子宫，使游离的胚胎，配种后7天左右为最佳冲胚时机，此时胚胎尚未在子宫内着床；随着冲胚液回流至集胚漏斗，每次注射30
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50 ml；整个过程使用冲胚液500 ml；完毕后将注射器20 ml连接至冲胚管打气孔，使冲胚管前端“气球”空气回流，轻抽注射器便于冲胚管前端“气球”不再充盈扩张，缓慢抽出冲胚管，将冲胚管前端举高，使管内冲胚液全部进入集胚漏斗。取下集胚漏斗，在漏斗盖上用记号笔标注供体母牛号、冲胚子宫角左、右后送检胚处；如此重复操作步骤6、步骤7、步骤8冲另一侧子宫角；步骤9：注射p：冲胚完毕后肌肉注射4 ml pg，促进黄体溶解，进入下一个发情周期；解绑供体牛，更换供体牛重复上述步骤1至步骤9。
17.所述pg为氯前列烯醇。
18.所述洗精液为sof 15 ml、肝素0.3 mg和caffeine 0.03183g。
19.所述双抗为青霉素和链霉素。
20.所述洗卵液为sof 8 ml、肝素0.16 mg 和 bsa 0.048 g。
21.所述保护液为10%的199液，即1ml fbs 9ml 199基础液。
22.采用上述技术方案的有益效果是：本发明无论是通过购买冷冻胚胎、还是对供体母牛进行超数排卵、人工授精和活体冲胚（体内胚胎），以及体外受精和胚胎的体外培养（体外胚胎），并结合对受体母牛进行双胚胎移植，能够充分发掘繁殖母牛的繁殖潜力，提高母牛的繁殖效率，将自然状态下的3年2胎、1胎1犊提高至1年1胎、1胎1犊、甚至是1胎双犊。
具体实施方式
23.下面对本发明作进一步详细说明：一种提高母牛繁殖效率的方法，具体操作步骤如下：一、胚胎的获取
胚胎的获取可以有以下3种途径：（一）购买冷冻胚胎，要求：a级胚胎。
24.（二）采用超数排卵 人工授精后第7天对供体母牛活体冲胚获取的a级和/或b级胚胎。
25.操作程序如下：1.供体母牛选择：选取年龄在2
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5岁、体质健硕，生殖器官发育完整，无繁殖系统疾病的青年母牛或者经产1胎母牛作为供体。
26.2.供体母牛同期发情（pg法）、超排和人工授精程序：第1天按2支/头剂量肌肉注射pg。第12天再次按2支/头剂量肌肉注射pg（氯前列烯醇）。第24天早上7点和晚上7点按3ml/头各肌肉注射fsh（促性腺激素，加拿大产，规格20ml，700mg）1次。第25天减量按2.5ml/头早、晚7点各肌肉注射fsh 1次。第26天早上7点按2ml/头肌肉注射fsh 1次；晚上7点按2ml/头肌肉注射fsh 1次，2支/头注射pg 1次。第27天早上7点按1ml/头肌肉注射fsh 1次，2支/头注射pg 1次；晚上7点按1ml/头肌肉注射fsh 1次。第28
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29天，观察发情并对发情母牛进行人工授精（人工授精当天记为0天）。第29天肌肉注射促排三号20
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30μg/头。
27.3.冲胚：第35天（人工授精后第7天）进行活体冲胚。
28.（1）供体牛保定：将供体牛赶至保定架保定。
29.（2）直肠检查及外阴清洗：将保定好的供体牛直肠粪便清理干净，检查两侧卵巢黄体发育情况，记录个数（目的是冲胚检胚的时候便于判断胚胎个数）。对供体牛外阴用卫生纸或者清水（肥皂水）、生理盐水等进行彻底清洗，然后用酒精喷壶喷洒酒精消毒。
30.（3）扩张子宫颈：对于育成青年母牛，由于子宫颈闭合较紧，需用扩张棒对子宫颈进行扩张，以便抽取粘液和冲胚管进入子宫。对于经产母牛，此步骤可根据直肠检查情况而定，可用可不用。原则是使粘液泵和冲胚管能够顺利通过子宫颈到达子宫相应位置。
31.（4）抽取粘液：术者将清洁的粘液泵经阴道缓慢插入供体牛子宫颈，助手将粘液泵手柄迅速抽出（类似于注射器手柄），使粘液泵胶管瞬间形成真空负压，将子宫颈及子宫体内粘液吸入粘液泵胶管内，缓慢将粘液泵从子宫颈抽出。此步骤可根据粘液抽取情况重复1
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2次，直到粘液基本抽取干净为止。
32.（5）麻醉：将4ml盐酸普鲁卡因（或者其它麻醉剂）注射进第二尾椎和第三尾椎空腔内，对供体母牛进行局部麻醉。麻醉成功判断标准：注射麻醉剂几分钟后轻轻左右晃动牛尾巴无阻力即表示麻醉成功。若有阻力，则需加大麻醉剂量，直到麻醉成功。
33.（6）插入冲胚管：将专用的冲胚管通过直肠把握缓慢穿过子宫颈、插入到子宫角。快到子宫角细处的时候将冲胚管内引导钢芯缓慢抽出10
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15cm，使冲胚管前段胶管变成柔性，以便适应子宫角的自然弯曲。当冲胚管到达相应位置后（越深入子宫角细处越好），用20 ml注射器通过冲胚管气孔注射10
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15 ml空气（具体注射的空气量视子宫颈粗细而定），此操作目的是使冲胚管前端“气球”充盈，堵住子宫颈向外的出口，使冲胚液只能通过冲胚管排入漏斗，便于收集胚胎。然后缓慢抽出冲胚管引导钢芯。
34.（7）用三通管连接冲胚管和漏斗：通过三通管一端连接冲胚管，一端连接集胚漏斗，另一端预留注射冲胚液，拧紧各部分接口。
35.（8）冲胚：冲胚管和三通管连接完毕后，先用止血钳（尖端锯齿部分用医用白胶布绑好，以免损伤透明软管）夹住集胚漏斗端软管。此时用大号注射器（100 ml）抽取冲胚液
（37.6℃恒温水浴、60 ml左右）接入连接软管开口处，轻轻回抽（目的是尽量抽尽冲胚管内空气），然后缓慢注射冲胚液进入子宫，直到略微有注射阻力为止。然后将止血钳松开，并夹住连接注射器这根软管，使子宫内冲胚液回流至集胚漏斗，如此反复操作冲洗数次（后期注射速度可以加快，类似于用冲胚液冲涮子宫，使游离的胚胎（配种后7天左右为最佳冲胚时机，此时胚胎尚未在子宫内着床。）随着冲胚液回流至集胚漏斗，每次注射30
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50 ml）。整个过程使用冲胚液500 ml左右。完毕后将注射器（20 ml）连接至冲胚管打气孔，使冲胚管前端“气球”空气回流，轻抽注射器便于冲胚管前端“气球”不再充盈扩张，缓慢抽出冲胚管，将冲胚管前端举高，使管内冲胚液全部进入集胚漏斗。取下集胚漏斗，在漏斗盖上用记号笔标注供体母牛号、冲胚子宫角（左、右）后送检胚处。
36.如此重复操作（6）（7）（8）步骤冲另一侧子宫角。
37.（9）注射pg（氯前列烯醇）：冲胚完毕后肌肉注射4 ml pg，促进黄体溶解，进入下一个发情周期。
38.解绑供体牛，更换供体牛重复上述（1）至（9）步骤。
39.（三）通过体外受精（ivf）培养获得的胚胎。要求：a级胚胎。
40.操作程序如下：1.处理精子（1）解冻冻精：37℃水浴5秒左右。
41.（2）15 ml洗精液（sof 15 ml 肝素0.3 mg caffeine 0.03183g）中加入200 μl的双抗（青霉素 链霉素）混匀。
42.（3）取7 ml洗精液加入离心管，先剪开冻精无棉塞一端，将此段浸入离心管洗精液中，再剪开棉塞端，将冻精完全吹入管中，混匀离心5 min，（转速1500 r/min）。
43.（4）离心完毕，去上清，再加入7 ml洗精液离心5 min（转速1500 r/min），完毕去上清。
44.（5）测量剩余离心管中洗精液量，添至750 μl，再加入750μl洗卵液（sof 8 ml 肝素0.16 mg bsa 0.048 g）混匀。
45.（6）做成100 μl液滴受精盘盖油，温箱平衡待用。
46.2.处理卵母细胞（1）卵母细胞成熟后，在洗盘中用100 μl移液枪轻轻吹打物理脱颗粒细胞，尽可能完全去除。
47.（2）将去除颗粒细胞后的卵母细胞用洗卵液（sof 8 ml 肝素0.16 mg bsa 0.048 g）洗净。
48.3.受精（1）将洗净的卵母细胞放入受精滴盘中。
49.（2）100 μl液滴放15
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20枚卵母细胞。
50.（3）受精时间达8 h后，尽快将受精卵从受精盘转移至培养盘中。
51.4.体外培养（1）做ivc滴状洗盘一个，培养盘用四孔板每孔500 μl，盖油平衡过夜。
52.（2）受精卵外粘连杂质尽可能去除干净。
53.（3）洗净后转移至培养盘，每孔不超过50枚。
54.二、受体母牛同期发情（pg法）受体母牛的同期发情与供体母牛在时间上保持一致，即分别在第12天、第26天、第27天上午按2支/头的剂量肌肉注射pg，第28
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29天观察发情并做好记录。
55.三、胚胎装管1.对于冷冻胚胎，从液氮罐中取出后在空气中缓慢挥舞10s（空气浴），然后投入37℃水中解冻，待冰晶全部融化后取出，用细管剪剪开无泡沫塞一端，将胚胎移入保护液（10%的199液，即1ml fbs 9ml 199基础液）中。重复上述程序解冻另一枚胚胎，100倍显微镜下检查胚胎质量，符合a级胚胎的则按照每支细管2枚重新装入细管。重装的时候采用“保护液 空气段 保护液 胚胎 保护液 胚胎 保护液”的方式装管。
56.2.对于活体冲胚获得的鲜胚和体外受精获得的体外培养胚胎（a级和/或b级），则按照“保护液 空气段 保护液 胚胎 保护液 胚胎 保护液”的方式直接装管。
57.四、装枪移植1.将装有2枚胚胎的细管装入移植枪，移植枪外加套管，套管外加软塑料外套。
58.2.采用直肠把握法将2枚胚胎移植于经同期发情处理好的受体母牛距离子宫角顶端1/2
‑
1/4深处。移植时注意动作轻柔，避免戳破子宫颈和子宫体造成出血。移植时间尽量控制在5 min内完成。
59.五、受体母牛移植后管理移植后受体牛的营养水平、应激大小等因素均会影响受胎率。因此在做好常规饲养管理之外，还应注意以下几点：1.移植后的受体牛与其他牛分群饲养。
60.2.保证营养需要，确保移植后成功妊娠、产犊。
61.3.注意观察返情情况，及时进行妊娠检查。移植后28
‑
60天内可以采用b超或者直肠检查法对受体母牛进行妊娠及胎儿数确认。
62.4.经妊娠检查确定未怀孕的受体牛，应及时配种或移植。
63.本发明所述牛供体超排和受体同期发情处理方案（pg法），详见表1：表1：牛供体超排和受体同期发情处理方案（pg法）
备注：（1）pg：上海计生所生产，0.2mg/2ml/支。（2）fsh：加拿大生产，20ml，400mg。
64.本发明供体母牛超排和受体母牛的同期发情处理，除了pg法之外，还可以采用埋置阴道栓的方法（cidr法），详见表2；表2：牛供体超排及受体同期发情处理方案（cidr法）
备注：（1）pg：上海计生所生产，0.2mg/2ml/支。（2）fsh：加拿大生产，20ml，400mg。