以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒3种点突变S基因鉴别试剂盒及其鉴别方法与流程

技术特征：
1.以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒n501y、a570d、d1118h位点突变的s基因特异性鉴别引物，序列如下：n501y
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。2.以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变s基因鉴别试剂盒，包括如下成分：1）n501y、a570d、d1118h位点突变的s基因特异性鉴别引物：n501y
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；2）pcr混合液：faststart taq dna聚合酶，反应缓冲液，dntp混合液，resolight饱和荧光染料；3）包含n501y、a570d、d1118h突变位点的新型冠状病毒s基因puc57载体重组质粒；4）ddh2o；5）25 mm mgcl2。3.一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变s基因鉴别方法，包括如下步骤：1）高分辨率熔解曲线模板：包含n501y、a570d、d1118h突变位点的新型冠状病毒病毒s基因puc57载体重组质粒，重组质粒的制备：从ncbi网站获取新型冠状病毒s基因（geneid：43740568）序列，并根据n501y、a570d、d1118h突变位点将突变处基因进行修改，将含有突变位点的s基因序列进行基因合成并构建至puc57质粒，获得突变s基因puc57载体重组质粒；2）高分辨率熔解曲线反应体系：30 μl反应体系包括：引物f 0.6 μl（10 μm工作浓度），引物r 0.6 μl（10 μm工作浓度），模板2 μl，反应缓冲液3 μl，faststart taq dna聚合酶0.5 μl，dntp混合液2 μl，mgcl
2 3.6 μl，resolight饱和荧光染料 1 μl，ddh2o 16.7 μl；3）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性3min； 94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸3min；pcr结束后直接运行高分辨率熔解曲线；95℃变性1min；40℃降温1min；65
‑
95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）；40℃冷却10s；使用lightcycler
®ꢀ
480 gene scanning software 软件分析高分辨率熔解曲线。

技术总结
本发明公开了一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒3种点突变S基因鉴别试剂盒及其鉴别方法，属于生物医药领域，其特点是根据新型冠状病毒S基因的3个不同突变位点设计扩增引物，通过优化的高分辨率熔解曲线反应体系鉴别不同位点突变的S基因。本试剂盒操作简单、反应速度快、PCR产物无需后处理、具备可操作性与重现性，可用于不同位点突变的新型冠状病毒S基因的鉴别。状病毒S基因的鉴别。


技术研发人员：刘迪 滕新栋 张瑾 杜建森 陈晓光 张娟 徐翮飞 徐颖
受保护的技术使用者：青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部)
技术研发日：2021.08.05
技术公布日：2021/12/3