蒽醌人工半抗原、免疫原、人工包被抗原及其抗体的制备与应用的制作方法

1.本发明属于小分子化合物的免疫分析检测领域，具体涉及有机合成，免疫化学，生物化学，物理化学测定等技术。特别涉及具有氨基丁酸分子结构的环境污染物蒽醌小分子化合物半抗原、人工抗原的设计合成，小鼠免疫，杂交瘤细胞筛选，特异性单克隆抗体的制备及其免疫分析方法的建立。


背景技术：

2.蒽醌类化合物为有机合成中高级染料中间体，如阴丹士林类还原染料、酸性染料、部份活性染料重要原料。用作造纸制浆蒸煮剂及双氧水原料等，可降低用碱量，缩短蒸煮时间，提高纸浆得率，减少废液负荷，目前使用蒽醌添加剂的造纸厂越来越多。蒽醌类化合物的基本母核为蒽醌，母核上常有羟基、羟甲基、甲基、甲氧基和羧基等取代基。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，蒽醌在2b类致癌物清单中。
3.其中，9,10
‑
蒽醌，用于造纸业和染料剂工业，在农业上曾用作驱鸟剂，我国尚未有蒽醌的登记使用。虽然9,10
‑
蒽醌被认为低毒，但是efsa(european food safety authority)在评估报告中指出，9,10
‑
蒽醌可能存在致癌风险。欧盟设定其在茶叶上的mrl限量为0.02mg/kg，其他国家现今还未有蒽醌在茶叶中的限量标准。目前，蒽醌在茶叶中的污染来源可能于茶叶种植过程和包装过程。
4.由于蒽醌类化合物在造纸业、纺织业、农业、食品行业中广泛使用，其残留造成环境污染以及生物安全问题，日益受到人们的关注。为此，国家对蒽醌残留限量要求越来越严格，并对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等方面，提出了新的要求和更高标准。常规的蒽醌检测仪器分析方法，如紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱质谱联用法，其操作复杂、成本较高、分析时间长、难以满足大量样品在较短时间内完成快速筛查的需求。因此，人们迫切希望有一种简便、快速、灵敏及价廉的蒽醌检测技术，能在野外现场和实验室内进行大批量的快速筛查试验。近些年来，基于抗原
‑
抗体特异性反应的免疫化学分析法是小分子化合物快速检测技术的研究热点之一，其中研究报道最多的是酶联免疫吸附法(elisa)，已研制出多类小分子化合物elisa试剂盒，具有潜在应用价值。
5.小分子化合物免疫分析比大分子难度更大，由于其分子结构不具备免疫原性，需要进行结构改造获得半抗原，并与蛋白载体连接后用于动物免疫。本研究的关键技术是蒽醌半抗原的设计、合成，蒽醌人工抗原和抗体的制备，以及蒽醌免疫分析方法的建立。蒽醌人工抗原和特异性单克隆抗体以及以此为基础建立的免疫分析方法尚未见报道。


技术实现要素：

6.本发明需要解决的技术问题是蒽醌半抗原的设计、合成，蒽醌人工抗原和抗体的制备。其目的是为了提供蒽醌半抗原和相应人工抗原和抗体的制备方法，并应用于样品中
蒽醌的免疫检测分析。
7.本发明选择9,10
‑
蒽醌为代表性蒽醌化合物，将其进行半抗原设计和结构改造，获得含氨基丁酸基团的蒽醌半抗原分子，再连接蛋白分子分别获得包被原和免疫原。
8.本发明独特之处在于克服了蒽醌半抗原化学合成困难，形成了一条蒽醌半抗原合成技术路线。用于免疫动物时，可产生亲和力很高的特异性抗体，并以此建立了elisa方法即酶联免疫分析方法，可准确检测蒽醌含量。
9.本发明的另一个独特之处在于选用钥孔血蓝蛋白偶联小分子作为免疫原，在偶联反应中提高溶剂比例，很大程度上克服了蒽醌半抗原难溶于水的问题，提高了半抗原分子与蛋白分子的偶联比，增强其免疫原性。
10.9,10
‑
蒽醌的结构如下所示：
[0011][0012]
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种蒽醌半抗原，分子结构式为：
[0013][0014]
一种蒽醌免疫原，是由蒽醌半抗原与钥孔血蓝蛋白(bcp)偶联合成，所述蒽醌免疫原分子结构式为：
[0015][0016]
一种蒽醌包被原，是由要蒽醌半抗原与鸡卵清蛋白(ova)偶联合成，所述蒽醌包被原分子结构式为：
[0017][0018]
抗蒽醌单克隆抗体，是能与蒽醌免疫原或蒽醌包被原、以及蒽醌化合物发生特异性免疫反应的单克隆抗体。
[0019]
蒽醌半抗原由2
‑
氨基蒽醌与丁二酸酐经酰化反应制备，合成路线如下：
[0020]
蒽醌半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0021]
(1)将2
‑
氨基蒽醌溶于5
‑
10倍的乙酸中，升温至50
‑
80℃搅拌；
[0022]
(2)将1
‑
1.5当量的丁二酸酐溶于2
‑
3倍的乙酸中，滴加到2
‑
氨基蒽醌溶液中；
[0023]
(3)搅拌反应3
‑
8h，然后冷却至5
‑
10℃；
[0024]
(4)抽滤，滤饼用1,4
‑
二氧六环重结晶，烘干，得到蒽醌半抗原晶体，结构经hplc
‑
ms和1h
‑
nmr表征。
[0025]
蒽醌免疫原和包被原的制备方法为碳二亚胺法，包括以下步骤：
[0026]
(1)称0.01mmol蒽醌半抗原溶于1ml dmf中，加入含0.03mmol n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)的0.2ml dmf溶液，搅拌反应15min，再加入含0.03mmol二环己基碳二亚胺(dcc)的0.2ml dmf溶液，室温搅拌反应过夜。
[0027]
(2)反应完成后，取反应液至离心管中，在4℃条件下4000r/min离心10min，取上清液弃黄色沉淀，上清液即为蒽醌半抗原活化液。
[0028]
(3)取步骤(2)中0.8ml反应活化液，逐滴加入到含7.5
‑
15mg bcp的2ml 0.01m碳酸缓冲液(ph 9.0)，蒽醌人工半抗原与bcp的偶联比为150:1。另外，取步骤(2)中1ml反应活化液，逐滴加入到含10mg
‑
30mg ova的2ml 0.01mol/l碳酸缓冲液(ph 9.0)，蒽醌人工半抗原与ova的偶联比为20:1。室温下，先快速磁力搅拌反应0.5h，再改为缓慢磁力搅拌反应3.5h。
[0029]
(4)将步骤(3)反应完成后的溶液装入到预处理好的透析袋中，在4℃条件下，先用5％甲醇
‑
超纯水透析1次，再改用0.01m硼酸缓冲液(ph 7.4)透析5次，每12h换液一次，共透析3天。
[0030]
(5)透析结束后将透析液取出，混匀后分装至无吸附性的1.5ml离心管中，得到蒽醌
‑
bcp和蒽醌
‑
ova，并于－20℃条件下保存。
[0031]
抗蒽醌单克隆抗体的制备方法包括动物免疫、杂交瘤细胞筛选、腹水制备，包括以下步骤：
[0032]
(1)免疫：免疫动物选用6周龄的balb/c雌性小鼠，免疫方法采用皮下多点弗氏佐剂注射方式，初次免疫后21天进行加强免疫，每隔14天进行一次加强免疫，共进行4次加强免疫以及1次末次免疫，具体试验方法如下：
[0033]
初次免疫：取0.1mg蒽醌免疫原(蒽醌
‑
bcp)溶于0.9％生理盐水，取等体积的弗氏完全佐剂，分别将蒽醌免疫原溶液和弗氏完全佐剂吸入注射器，并将两支注射器用透明软管对接。快速将免疫原注射器一端的溶液推向佐剂注射器一端的液体中，再快速来回推动300次左右，使蒽醌免疫原充分乳化。进行小鼠皮下7个点注射，分别为颈部、背部、四肢、腹部皮下注射免疫。
[0034]
加强免疫：取0.05mg蒽醌免疫原溶于0.9％生理盐水，取等体积的弗氏不完全佐剂，分别将蒽醌免疫原溶液和弗氏完全佐剂吸入注射器，并将两支注射器用透明软管对接。快速将免疫原注射器一端的溶液推向佐剂注射器一端的液体中，再快速来回推动300次左右，使蒽醌免疫原充分乳化。进行小鼠腹腔注射免疫。
[0035]
末次免疫：取0.05mg蒽醌免疫原溶于0.9％生理盐水，直接进行腹腔注射免疫。
[0036]
(2)杂交瘤细胞筛选：定期监测小鼠抗体效价，加强免疫2次后每隔一周测定小鼠尾血效价，以吸光度度值od
450nm
≥1为阳性。当尾血效价达到1:10000－1:20000时，进行末次免疫，待末次免疫3d后断颈取脾，进行杂交瘤细胞融合，筛选单克隆杂交瘤细胞。采用同源间接elisa，包被5μg/ml蒽醌
‑
ova，以蒽醌标准溶液100ng/ml作为竞争药物，挑出强阳性od
450nm
≥0.5且抑制率≥50％的细胞株，连续亚克隆3
‑
4次，获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
[0037]
(3)抗体制备：选用7周龄f1代小鼠，先用降脂烷500μl/只进行腹腔注射。7天后，将步骤(2)筛选获得的稳定单克隆杂交瘤细胞株(细胞密度约2
×
106/ml)500μl/只接种至小鼠腹腔。7～10天后，小鼠腹腔膨胀，收集腹水，采用辛酸
‑
硫酸铵沉淀法纯化。纯化后的腹水以蒽醌
‑
ov包被，间接法测定抗体的效价和对蒽醌的抑制率。
[0038]
所述的蒽醌单克隆抗体应用于环境(水、土壤、大气)、农产品、食品和纸板箱等包装材料中污染物蒽醌含量的免疫检测，所述的免疫检测为酶联免疫快速测定(elisa)。蒽醌抗体的应用于蒽醌含量的免疫检测，包括以下步骤：
[0039]
(1)包被：将蒽醌
‑
ova溶于0.05mol/l碳酸缓冲液(ph 9.6)，以100μl/孔包被于酶标板，于4℃冷藏环境包被过夜，取出后用0.01m pbst洗涤3次。
[0040]
(2)封闭：包被完成后，用0.01mol/l pbs(ph 7.4)配置2％脱脂奶粉，以300μl/孔封闭酶标板，于37℃培养箱封闭30分钟，取出后用0.01mol/l pbst洗涤2次。
[0041]
(3)竞争反应：将待测样品溶解于30％甲醇的0.01mol/l pbs溶液，以50μl/孔加入酶标板，再加入蒽醌抗体溶液50μl/孔，于37℃培养箱反应1小时，取出后洗板3次。
[0042]
(4)酶标二抗反应：将兔抗鼠酶标二抗(甘油稀释1倍保存)用0.01mol/l pbs(ph 7.4)稀释20000倍，加入100μl/孔，于37℃培养箱反应1小时，取出后洗板4次。
[0043]
(5)显色与终止：显色底物为四甲基联苯胺(tmb)溶液，使用时a液和b液等体积混合，现配现用，显色时加入100μl/孔，显色15分钟后加入2mol/l h2so
4 50μl/孔终止。
[0044]
(6)显色终止后，将酶标板置于酶标仪上读数，读取od
450nm
数值，计算和分析数据。
[0045]
本发明相对于现有分析技术具有如下的优点及效果：
[0046]
(1)该设计、合成的蒽醌半抗原与目标待测物相似度高，对蒽醌的特征结构保留完整，为制备特异性良好的蒽醌抗体奠定了基础；
[0047]
(2)蒽醌抗体具有良好的特异性和灵敏度，ic
50
达到0.02mg/l，而且抗体的稀释倍数达到16000。
[0048]
(3)经试验验证，上述半抗原其合成方法简便，合成效率高，反应步骤少，半抗原只需要3步反应即可合成，从而提高了反应的可控性和时效性。
[0049]
因此，本发明合成半抗原的方法与其他方法相比较，更加易于推广普及。本发明涉及的抗体活性高，并成功应用于酶联免疫快速检测方法，其操作简便快速，检测过程只需要2小时15分钟，而且检测的精确度可达到90％以上。因此，本发明不仅在实验室环境下呈现良好的检测效果，并为开发出成本低、效率高、操作快的免疫快速检测胶体金试纸条工具奠定了基础，适合现场快速检测需求，具备良好的应用前景，既有经济效益又有社会效益。
附图说明
[0050]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0051]
图1为蒽醌半抗原的质谱图
[0052]
图2为蒽醌半抗原的核磁氢谱图
[0053]
图3为本发明的蒽醌酶联免疫分析标准曲线图
具体实施方式
[0054]
实施例1
[0055]
(1)蒽醌半抗原的合成
[0056]
称取2.23g(0.01mol)2
‑
氨基蒽醌置于100ml三口瓶中，加入20ml冰醋酸，升温至65℃搅拌溶解，再称取1.1g(0.011mol)丁二酸酐溶于溶剂3ml冰醋酸中，将其逐滴滴加至三口瓶中，保温反应6h。降温至5
‑
10℃，抽滤，将得到的固体干燥后，用1，4
‑
二氧六环重结晶。重结晶后有黄色固体析出，过滤干燥后得到黄色固体1.62g，收率为50.1％。1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6),δ(ppm):12.22(s,1h),10.62(s,1h),8.41(d,j＝2.15,1h),8.17
‑
8.14(m,2h),8.12(d,j＝8.5,1h),8.03(dd,j＝2.2,2.2,1h),7.92
‑
7.86(m,2h),2.67(t,j＝6.1,6.45,2h),2.59(t,j＝6.45,6.5,2h).
[0057]
(2)蒽醌免疫原和包被原的制备
[0058]
称0.01mmol蒽醌半抗原溶于1ml dmf中，加入含0.03mmol n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)的0.2ml dmf溶液，搅拌反应15min，再加入含0.03mmol二环己基碳二亚胺(dcc)的0.2ml dmf溶液，室温搅拌反应过夜。反应完成后，取反应液至离心管中，在4℃条件下4000r/min离心10min，取上清液弃黄色沉淀，上清液即为蒽醌半抗原活化液。取0.8ml半抗原活化液，逐滴加入到含12mg bcp的2ml 0.01m碳酸缓冲液(ph 9.0)，蒽醌人工半抗原与bcp的理论偶联比为160:1。另外，取1ml半抗原活化液，逐滴加入到含15mg ova的2ml 0.01mol/l碳酸缓冲液(ph 9.0)，蒽醌人工半抗原与ova的理论偶联比为15:1。室温下，先快速磁力搅拌反应0.5h，再改为缓慢磁力搅拌反应3.5h。反应完成后的溶液装入到预处理好的透析袋中，在4℃条件下，先用5％甲醇
‑
超纯水透析1次，再改用0.01m硼酸缓冲液(ph 7.4)透析5次，每12h换液一次，共透析3天。透析结束后将透析液取出，混匀后分装至无吸附性的1.5ml离心管中，得到蒽醌
‑
bcp和蒽醌
‑
ova，并于－20℃条件下保存。
[0059]
(3)蒽醌抗体的制备
[0060]
免疫动物选用6周龄的balb/c雌性小鼠，免疫方法采用皮下多点弗氏佐剂注射方式，初次免疫后21天进行加强免疫，每隔14天进行一次加强免疫，共进行4次加强免疫以及1次末次免疫。具体步骤为，初次免疫：取0.1mg蒽醌免疫原溶于0.9％生理盐水，取等体积的弗氏完全佐剂，分别将蒽醌免疫原溶液和弗氏完全佐剂吸入注射器，并将两支注射器用透明软管对接。快速将免疫原注射器一端的溶液推向佐剂注射器一端的液体中，再快速来回推动300次左右，使蒽醌免疫原充分乳化，进行小鼠皮下7个点注射，分别为颈部、背部、四肢、腹部皮下注射免疫。加强免疫：取0.05mg蒽醌免疫原溶于0.9％生理盐水，取等体积的弗氏不完全佐剂，分别将蒽醌免疫原溶液和弗氏完全佐剂吸入注射器，并将两支注射器用透明软管对接，乳化方法同初次免疫，乳化后进行小鼠腹腔注射免疫。加强免疫分别于初次免疫后每隔2周进行一次，共加强免疫4次。分别于第二次、第三次、第四次加强免疫后一周测
定效价，第三次加强免疫后效价达到1:12800。末次免疫：取0.05mg蒽醌免疫原溶于0.9％生理盐水，直接进行腹腔注射免疫。
[0061]
杂交瘤细胞筛选：定期监测小鼠抗体效价，加强免疫2次后每隔一周测定小鼠尾血效价，以吸光度度值od
450nm
≥1为阳性。当尾血效价达到1:10000－1:20000时，进行末次免疫，待末次免疫3d后断颈取脾，进行杂交瘤细胞融合，筛选单克隆杂交瘤细胞。采用同源间接elisa，包被5μg/ml蒽醌
‑
ova，以蒽醌标准溶液100ng/ml作为竞争药物，挑出强阳性od
450nm
≥0.5且抑制率≥50％的细胞株，连续亚克隆3
‑
4次，获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
[0062]
抗体制备：选用7周龄f1代小鼠，先用降脂烷500μl/只进行腹腔注射。7天后，将筛选获得的稳定单克隆杂交瘤细胞株(细胞密度约2
×
106/ml)500μl/只接种至小鼠腹腔。7～10天后，小鼠腹腔膨胀，收集腹水，采用辛酸
‑
硫酸铵沉淀法纯化。纯化后的腹水以蒽醌
‑
ova包被，间接法测定抗体的效价和对蒽醌的抑制率。
[0063]
实施例2
[0064]
使用实施例1得到的蒽醌单克隆抗体进行免疫检测。
[0065]
(1)包被：将蒽醌
‑
ova溶于0.05mol/l碳酸缓冲液(ph 9.6)，以100μl/孔包被于酶标板，于4℃冷藏环境包被过夜，取出后用0.01m pbst洗涤3次。
[0066]
(2)封闭：包被完成后，用0.01mol/l pbs(ph 7.4)配置2％脱脂奶粉，以300μl/孔封闭酶标板，于37℃培养箱封闭30分钟，取出后用0.01mol/l pbst洗涤2次。
[0067]
(3)竞争反应：将待测样品溶解于30％甲醇的0.01mol/l pbs溶液，以50μl/孔加入酶标板，再加入蒽醌抗体溶液50μl/孔，于37℃培养箱反应1小时，取出后洗板3次。
[0068]
(4)酶标二抗反应：将兔抗鼠酶标二抗(甘油稀释1倍保存)用0.01mol/l pbs(ph 7.4)稀释20000倍，加入100μl/孔，于37℃培养箱反应1小时，取出后洗板4次。
[0069]
(5)显色与终止：显色底物为四甲基联苯胺(tmb)溶液，使用时a液和b液等体积混合，现配现用，显色时加入100μl/孔，显色15分钟后加入2mol/l h2so
4 50μl/孔终止。
[0070]
(6)显色终止后，将酶标板置于酶标仪上读数，读取od
450nm
数值，计算和分析数据。
[0071]
目标分析物浓度对抗体的抑制率i＝(amax－amin)－(ai－amin)/(amax－amin)
×
100，抗体与抗原的结合率b/b0＝(ai－amin)/(amax－amin)，式中：amax为空白孔平均吸光度值；amin为免疫前blab/c小鼠血清对照孔平均吸光度值；ai为加样孔平均吸光度值。以抑制率i或结合率b/b0为纵坐标、分析物浓度c为横坐标绘制标准曲线，如图1，检测限可以稳定达到0.02mg/l，分别以5％和95％抑制率对应的目标分析物浓度作为最小检测浓度和最大检测浓度，则检测范围为0.02mg/kg～56.94mg/kg。
[0072]
实施例3
[0073]
使用实施例1得到的蒽醌抗体进行交叉反应测定。
[0074]
利用棋盘试验方法确定包被原的包被浓度为5μg/l，包被体积为100μl每孔，抗体反应浓度为1μg/l，兔抗鼠酶标二抗稀释倍数为1:40000，在此条件下测定抗体特异性。以抗体与蒽醌类化合物的交叉反应程度，以抑制抗体50％(ic
50
)所需目标分析物的浓度与近似目标分析物ic
50
的浓度之比的百分数表示，即交叉反应率c.r(％)。c.r(％)＝s＝y/z
×
100％，y：ic
50
时目标分析物的浓度，z：ic
50
时近似目标分析物的浓度。交叉反应率越小，抗体特异性越高；交叉反应率越大，抗体识别蒽醌类化合物广谱性越高。具体内容见表1。
[0075]
表1蒽醌抗体对9,10
‑
蒽醌及其他蒽醌类化合物的交叉反应率
[0076][0077]
[0078][0079]
实施例4
[0080]
使用实施例1得到的蒽醌抗体制备成胶体金试纸条，采用胶体金试纸条和elisa法进行实际样品检测。
[0081]
实际样品检测采用了茶叶样品、纸箱样品，elisa检测结果显示，纸箱样品检测到9,10
‑
蒽醌和蒽酮浓度为2.25～3.15mg/kg，试纸条检测结果呈阳性，茶叶样品中未检测到9,10
‑
蒽醌和蒽酮，试纸条检测结果呈阴性。具体数据结果见表2。
[0082]
表2实际样品中9,10
‑
蒽醌检测结果
[0083][0084]
最后，需要声明的是，本发明并不限于以上4种实施例，还可以有其他衍生用途。本领域的技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的其他变化模式，均应认为是本发明的保护范围。