一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明涉及物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒及其检测方法，属于免疫检测技术领域。


背景技术：

2.恩诺沙星(enrofloxacin，enr)是一种专门用于治疗动物组织感染的广谱杀菌药，随着近年来的广泛使用，用药带来的副作用日益显现，动物性食品中恩诺沙星的残留被人体摄入后越来越危害人体健康，因此对恩诺沙星进行有效的快速检测十分必要。
3.基于抗原抗体特异性结合反应的免疫分析技术因其独特的识别形式以及其特异性、可逆性及反应阶段性等优异的特点得到了广泛的关注及研究，并逐渐成为临床疾病诊断的重要检测手段。免疫诊断技术也与生化诊断和分子诊断技术构成了体外诊断的三大领域。在世界粮农组织(fao)的推荐下，免疫分析方法也被逐渐应用于食品安全检测分析领域，并已成为了食品安全检测的重要组成部分。包括elisa，化学发光酶免疫分析，荧光免疫分析，免疫层析传感分析(ics)在内的各种免疫测定已被广泛用于现场快速检测农产品和动物产品中的食品污染物残留。
4.以荧光信号代替比色信号的免疫分析具有灵敏度高、抗击质干扰能力强等特性，被广泛应用。目前荧光分析的主要标记材料多为荧光微球(fm)，量子点(qd)和上转换纳米粒子(ucnp)等，但qds重金属毒性大以及ucnps荧光种类少等问题成为了二者关键性的限制因素。碳量子点(cds)作为一类具有优异光致发光性能的零维(od)纳米材料，是继半导体量子点成功合成以来被广泛研究的荧光纳米材料。基于此，通过简单的方法在水溶液环境中制备了碳量子点，并建立了快速，高灵敏度的物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒。目前，碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒还未见报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了用于动物源性食品中恩诺沙星检测的碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒及其检测方法，为了实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的反应杯和设在盒体内的试剂；其中所述反应杯包被有包被抗原，所述试剂包括：辣根过氧化物酶标记抗体工作液；恩诺沙星系列标准溶液；20倍浓缩磷酸盐洗涤液；10倍浓缩磷酸盐复溶液；碳量子点荧光反应液a及碳量子点荧光反应液b。
7.优选的，碳量子点荧光反应液a包含过氧化氢和碳量子点，碳量子点荧光反应液b包含3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺和碳量子点。
8.碳量子点的制备包括如下步骤：
9.(1)碳量子点的合成：将3g柠檬酸和5g尿素添加到10ml超纯水中以形成透明溶液，然后将溶液在800w微波炉中加热5分钟，在此期间溶液从无色液体变为棕色，最后变为暗褐
色的簇状固体，冷却至室温后，加入20ml水以溶解产物；
10.(2)碳量子点的纯化：将溶解后的产物于5000rpm离心10min后，装入3500da透析袋，常温下用水透析过夜，得到棕色具有荧光的溶液，在365nm激发光激发下，在400nm
‑
600nm处有荧光。
11.所述反应杯为容积为300μl或500μl或其他容积的单孔或8联反应杯；所述恩诺沙星系列标准溶液分别是从恩诺沙星纯品中稀释得到，恩诺沙星标准品中恩诺沙星浓度分别为：0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml、8.1ng/ml和24.3ng/ml。
12.用所述的试剂盒检测待测物的方法，测定的基础是抗原
‑
抗体反应。顺次向反应杯中加入待测物标准品或处理好的样品提取液和辣根过氧化物酶标记抗体工作液，温育洗涤后加入碳量子点荧光反应液a和碳量子点荧光反应液b，并检测荧光值，以加入恩诺沙星标准品的荧光值求抑制率并绘制标准曲线，以加入被测样品的荧光值从标准曲线上计算被测样品中待测物的含量。
13.所述试剂盒检测方法，向反应杯中加入待测物标准溶液或处理好的待测样品，并加入抗体工作液，37℃温育20min后用磷酸盐洗涤液洗涤，在滤纸上拍干磷酸盐洗涤液后，向反应杯中加入荧光反应液a和荧光反应液b各50μl，37℃温育10min后检测荧光值。
14.所述试剂盒抑制率计算方法，抑制率(％)＝(f
x
‑
f0)/(f0‑
f
b
)
×
100％，其中f0为检测不含恩诺沙星的标准溶液时反应杯的检测荧光值，f
x
为检测含有恩诺沙星的标准溶液或待测样品溶液时反应杯的检测荧光值，f
b
为未添加待测物标准溶液或待测样品时反应杯的检测荧光值，以加入不同浓度恩诺沙星标准品的荧光值求抑制率，以抑制率为纵坐标，恩诺沙星标准品浓度的对数为横坐标作标准曲线，检测限以及灵敏度即抑制率为50％时所对应的恩诺沙星浓度(ic50)可以从标准曲线上读出；每一个样品的浓度可以通过样品测定荧光值计算抑制率，并根据抑制率从标准曲线上读出。
15.进一步，试剂盒对恩诺沙星的检测限为0.3ng/ml，灵敏度为1.02ng/ml。
16.进一步，所述荧光值是在365nm激发波长下用荧光检测仪测定各反应杯在560nm处的荧光值。
17.与现有国内外小分子物质免疫吸附检测技术相比，本发明具有以下突出的优点：
18.1、本发明利用碳量子点荧光信号代替酶联免疫分析的比色信号，实现恩诺沙星的高灵敏度荧光免疫检测分析；
19.2、本发明试剂盒无需酸溶液终止即可读数。
20.3、本发明试剂盒内的反应杯的数量可以根据检测需要选择数量，可在1h内完成100
‑
500个样品的快速检测分析，适用于大量样品的快速筛选，可作为食品中小分子待测物快速检测的有效筛检手段。
附图说明
21.构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
22.图1为本发明碳量子点的荧光图谱。
23.图2为酶联免疫分析方法及碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测恩诺沙星结果
图(待测物的浓度从左到右分别为0.3、0.9、2.7、8.1、24.3ng/ml)。
具体实施方式
24.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造，但所举实例不作为对本发明的限定。
25.实施例l(制备实施例)
26.碳量子点制备
27.(1)碳量子点的合成：将3g柠檬酸和5g尿素添加到10ml超纯水中以形成透明溶液。然后将溶液在800w微波炉中加热5分钟，在此期间溶液从无色液体变为棕色，最后变为暗褐色的簇状固体。冷却至室温后，加入20ml水以溶解产物。
28.(2)碳量子点的纯化：将溶解后的产物于5000rpm离心10min后，装入3500da透析袋，常温下用水透析过夜，得到棕色具有荧光的溶液，荧光光谱如图1所示，在365nm激发光激发下，在400nm
‑
600nm处有荧光。
29.实施例2(制备实施例)
30.恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒制备
31.(1)包被抗原：用ph 9.6碳酸钠缓冲液将恩诺沙星包被抗原稀释至0.1μg/ml，取100
‑
300μl加入到反应杯中，4℃孵育过夜。
32.(2)洗涤反应杯：次日弃掉反应液后加入200
‑
500μl磷酸盐洗涤液，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将反应杯在滤纸上拍干。
33.(3)封闭：向反应杯中加入200μl酪蛋白封闭液，37℃下孵育1.5h，弃掉酪蛋白封闭液，真空密封后在4℃保存。
34.实施例3(应用实施例)
35.恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒的应用
36.1.检测步骤
37.(1)加标准品溶液和辣根过氧化物酶标记抗体工作液：将100μl含有一定浓度恩诺沙星的标准品稀释液加入各反应杯后将100μl酶标记抗体混合物加入各反应杯，每个浓度两个平行，37℃下孵育20min，弃掉反应液后加入200
‑
500μl磷酸盐洗涤液，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将板在滤纸上拍干。
38.(2)显色：向各反应杯中加入碳量子点荧光反应液a和碳量子点荧光反应液b各50μl，37℃下显色10min。
39.(3)荧光读数：在365nm激发波长下用荧光检测仪测定各反应杯在560nm处的荧光值。
40.2.结果判定
41.本发明所述碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒以恩诺沙星结合酶标记抗体抑制底物氧化从而导致荧光恢复，待测反应杯中溶液在365nm激发下，560nm处的荧光强度值随待测样品中恩诺沙星含量增加而增加。结果判断标准：抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(f
x
‑
f0)/(f0‑
f
b
)
×
100％，f0为测定不含恩诺沙星的标准溶液时反应杯的检测荧光值，f
x
为检测含有恩诺沙星的标准溶液时反应杯的检测荧光值，f
b
为未添加待测物标准溶液时反应杯的检测荧光值，以抑制率为纵坐标，待测物浓度的对数为横坐标作标准曲线，灵敏度即抑
制率为50％时所对应的恩诺沙星浓度(ic
50
)可以从标准曲线上读出。如图2所示，本发明所述方法的ic
50
为1.02ng/ml。
42.实施例4(应用实施例)
43.恩诺沙星酶联免疫检测方法的使用技术
44.1.检测步骤
45.(1)加标准品溶液和辣根过氧化物酶标记抗体工作液：将100μl含有一定浓度恩诺沙星的标准品稀释液加入各反应杯后将100μl酶标记抗体混合物加入各反应杯，每个浓度两个平行，37℃下孵育20min，弃掉反应液后加入200
‑
500μl磷酸盐洗涤液，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将板在滤纸上拍干。
46.(2)显色：向各反应杯中加入过氧化脲溶液和3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺溶液各50μl，37℃下显色10min。
47.(3)终止：用50μl硫酸终止液终止显色反应后在10min内读数。
48.(4)读数：用酶标仪测定各反应杯在450nm处的吸光度值。
49.2.结果判定
50.本发明所述酶联免疫快速检测方法以恩诺沙星结合酶标记抗体抑制底物氧化从而导致吸光度值降低，待测反应杯中溶液在450nm处的吸光度值随待测样品中恩诺沙星含量增加而降低。结果判断标准：抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(a0‑
a
x
)/(a0‑
a
b
)
×
100％，a0为测定不含恩诺沙星的标准溶液时反应杯的检测吸光度值，a
x
为检测含有恩诺沙星的标准溶液时反应杯的吸光度值，a
b
为未添加待测物标准溶液时反应杯的检测吸光度值，以抑制率为纵坐标，待测物浓度的对数为横坐标作标准曲线，灵敏度即抑制率为50％时所对应的恩诺沙星浓度(ic
50
)可以从标准曲线上读出。如图2所示，本发明所述酶联免疫分析方法的ic
50
为2.15ng/ml。
51.实施例5(应用实施例)
52.恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒的使用技术
53.1.水产品的预处理
54.取2g去除脂肪的肉样匀浆置于50ml离心管中，向其中加入2ml饱和氯化钠溶液和4ml乙腈
‑
0.1m naoh(v/v＝84：16)，混合震荡5min后4000rpm离心5min，转移1ml上层清液到5ml离心管中，60℃温和气流蒸发吹干，残留物溶于1ml正己烷，并加入1ml样品复溶液。涡旋30s后4000rpm离心3min。吸取100μl下层溶液用于检测。最终检测结果应乘以稀释倍数3。
55.2.畜禽产品的预处理
56.取2g去除脂肪的肉样匀浆置于50ml离心管中，向其中加入4ml乙腈
‑
0.1m naoh(v/v＝84：16)，混合震荡5min后4000rpm离心5min，转移1ml上层清液到5ml离心管中，60℃温和气流蒸发吹干，残留物溶于1ml正己烷，并加入1ml样品复溶液。涡旋30s后4000rpm离心3min。吸取100μl下层溶液用于检测。最终检测结果应乘以稀释倍数2。
57.3.检测步骤
58.(1)加恩诺沙星标准溶液或待测样品及辣根过氧化物酶标记抗体工作液：将100μl恩诺沙星标准溶液或待测样品溶液加入各反应杯后将100μl酶标记抗体混合物加入各反应杯，每个浓度两个平行，37℃下孵育20min，弃掉反应液后加入200
‑
500μl磷酸盐洗涤液，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将反应杯在滤纸上拍干。
59.(2)显色：向各反应杯中加入碳量子点荧光反应液a和碳量子点荧光反应液b各50μl，37℃下显色10min。
60.(3)荧光读数：在365nm激发波长下用荧光检测仪测定各反应杯在560nm处的荧光值。
61.4.结果判定
62.待测反应杯中溶液在365nm激发下，560nm处的荧光强度值随待测样品中恩诺沙星含量增加而增加。结果判断标准：抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(f
x
‑
f0)/(f0‑
f
b
)
×
100％，f0为检测不含恩诺沙星的标准溶液时反应杯的检测荧光值，f
x
为检测含有恩诺沙星的标准溶液或待测样品溶液时反应杯的检测荧光值，f
b
为未添加待测物标准溶液或待测样品时反应杯的检测荧光值，以加入不同浓度恩诺沙星标准品的荧光值求抑制率，以抑制率为纵坐标，恩诺沙星标准品浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以通过样品测定荧光值计算抑制率，并根据抑制率从标准曲线上读出。本发明所述试剂盒用于水产品样品检测限为0.9ng/g，畜禽产品样品检测限为0.6ng/g。如表1所示，本发明所述试剂盒检测水产品样品中恩诺沙星的检测值和添加值一致。
63.表1碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测水产品中恩诺沙星回收率
64.