1.本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及检测类器官最大截面积的方法及其应用。
背景技术：
：：2.近年来，肿瘤逐渐成为我国人口的主要死亡原因。2017年约221万人因肿瘤去世，占当年所有死亡人数的24.8％。此外，肿瘤属于较典型的老年性疾病，随着我国人口老龄化程度的加剧，未来几十年内，预计因肿瘤死亡的人口比例会大幅增加，给社会带来巨大的压力和挑战。肿瘤治疗主要有手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗及内分泌治疗等手段。其中约70％的患者需要放化疗，但由于患者个体差异，肿瘤耐药或辐射抵抗，目前临床肿瘤药物整体有效率低(30％左右)，肿瘤不必要的治疗和没有效果的治疗造成巨大浪费。因此，肿瘤个性化治疗迫在眉睫。加速肿瘤临床药物的研发进程，为上市肿瘤药物筛选到敏感治疗人群，是改变肿瘤治疗现状的重要支点。3.目前国际上主要的肿瘤药物研发模型有：肿瘤细胞系模型、患者肿瘤组织异源移植即pdx模型。2d细胞系筛选成本低，效率高，但细胞系为永生化单一类型，不能反映肿瘤的异质性、空间结构以及各类细胞间的交流。人源肿瘤异体移植模型虽然可以比较真实的反映肿瘤在体内的状态，保留肿瘤的异质性，但其存在物种差异，制作周期长、成本高等问题，且很多肿瘤尚未成功建系且不能较快的反映用药效果。2014年以来，类器官技术异军突起。相比主流的药物研发技术，类器官具有无可比拟的优势和先进性。4.类器官(organoid)是利用胚胎干细胞、多能干细胞或成体体细胞，在一定的培养环境和细胞外基质的支撑作用下形成的具有三维结构的，在功能上接近器官的多细胞结构。肿瘤类器官(patient‑derivedtumororganoids,pdtos)是指取自肿瘤患者自身的原发性肿瘤组织在实验室中培养起来的一种微型立体3d多细胞结构。相比于2d细胞系培养，肿瘤类器官具有三维结构，保留了肿瘤组织的异质性，更接近体内肿瘤的状态。相比于异体移植瘤模型，类器官效率高，成本低，能更好地实现高通量药物筛选，更为精确迅速地模拟出患者真实的药物治疗响应情况。5.由于类器官一般在近似半球形的基质胶固体上培养，会存在位置以及接触生长因子能力的差异，且类器官本身具有很强的异质性，导致它们的形态大小和分布不一。目前评价类器官大小的方法主要是图像分析法，该方法是将生长在基质胶上的类器官，在光学或荧光显微镜下选取某个视野进行拍照。将输出图片中的每个类器官进行面积以及存活率统计，从而判断加药后类器官的大小变化和细胞存活情况。另外一种方法是让类器官生长在特定的水凝胶包被的微腔内，使他们尽可能长在一个维度和焦平面上，从而拍摄单平面照片进行面积及存活统计，但这一方法会大大降低类器官的异质性。由于是3d培养模式，每个类器官所处的焦平面不同。因此形态不一以及可测量性有限，导致类器官难以进行高通量定量操作。目前已有的相对定量方法仅采用光学或荧光显微镜拍摄的一个截面进行统计，并不能精确的指示每个类器官的最大截面，因此不能很好的指示用药药效。现有的方法都无法在保持类器官原有的状态下摆脱上述弊端，进行精确的药效分析。技术实现要素：6.本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：7.发明人发现，将类器官采用显微镜连续断层拍摄扫描后进行最大光强度投影，找出每个类器官的最大截面进行定量分析，可以很好的解决拍摄一个截面不能精确的指示每个类器官的最大截面积的难题；连续断层拍摄获得的叠加图像与传统单焦平面类器官拍摄图相比，图像更加清晰。将断层图像叠加后计算类器官总最大截面积，根据不同药物处理组的类器官总最大截面积标准化值的变化测出药物药效结果，所得结果与类器官测定药物药效的国标法结果相吻合。因此，类器官连续断层拍摄计算面积的方法可以准确的评估肿瘤药物的药效。8.为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测类器官最大截面积的方法，所述方法包括：1)对待测类器官进行可见光断层扫描处理，以便获得多个断层图像；2)将步骤1)所获得的多个断层图像进行叠加处理，以便获得叠加图像；以及3)基于所述叠加图像，获得待测类器官的最大截面积。根据本发明的实施例，利用所述检测类器官最大截面积的方法生成的类器官图像清晰，相较于传统方法只拍摄一个截面观察到的类器官数量更加准确。9.根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：10.根据本发明的实施例，所述待测类器官预先培养于基质胶，所述基质胶呈半球状，所述可见光断层扫描是在以下条件的至少之一下进行的：基质胶的体积与拍摄区间的比值为1μl：150μm；层间高度为48～52μm或98～102μm；在多孔板顶部加入匀光板；lut值为50～55k。根据本发明的实施例，层间高度设置越小获得的断层图像越多，叠加图像就越能反应类器官的真实位置和大小，但层高设置越小，耗时越长，计算机及拍摄机器耗损越大；且光照不均匀、过度曝光或曝光太低等问题都会导致拍摄出的图像效果不佳，不利于进行断层图像的叠加，因此，发明人对可见光断层扫描的拍摄区间、层间高度、光路及曝光强度进行优化；根据本发明实施例优化后的断层扫描参数进行拍摄，获得的类器官图像清晰，断层图像的光强度一致，使得统计结果更加准确，药效评价结果更真实。11.根据本发明的实施例，所述可见光断层扫描是在自然光投射条件下，用倒置金相显微镜进行扫描或钙黄绿素对类器官染色的条件下用倒置荧光显微镜进行扫描。根据本发明的实施例，只有在类器官形态良好时，倒置金相显微镜拍摄的类器官才能较好的区分类器官的生存和死亡情况，得较好的统计结果。当病人来源的类器官因个体差异导致形态各异，根据倒置金相显微镜在明场条件下所拍摄类器官的形态很难判断死活时，可以选择用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞，利用荧光显微镜进行类器官最大截面积的检测。根据本发明实施例，当类器官形态良好时，所述可见光断层扫描对可见光显微镜并无限制，任何可准确进行观察的可见光显微镜均可使用。12.根据本发明的实施例，所述倒置荧光显微镜进行断层扫描时激发光为紫外光。13.根据本发明的实施例，所述紫外光的波长为488nm。14.在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物药效评价方法，所述方法包括：对类器官施加待筛选药物；基于类器官施药后的最大截面积，确认类器官施药后的总最大截面积；基于类器官施药后的总最大截面积，确定类器官施药后的总最大截面积的标准化值；以及基于所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值，确定所述待筛选药物是否为目标药物；其中，类器官的最大截面积是通过第一方面所述的方法获得的，总最大截面积是获得的多个类器官最大截面积之和与重复数的比值，所述处理重复数为预先设置的重复孔的数量。根据本发明实施例，利用所述检测类器官最大截面积的方法生成的类器官图像清晰、可观察到的类器官数量较拍摄一个截面更加准确，得到的肿瘤药物药效评价结果与病人用药后的临床反应具有很高的一致性。15.根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：16.根据本发明的实施例，所述重复孔的数量为3。根据本发明实施例，所述待测类器官预先培养于基质胶，基质胶置于48孔板的培养孔内，当m个培养孔进行相同处理时，这m个培养孔即为同一处理的重复孔，该处理的重复孔数量即为m，其中，m为大于0的整数。17.根据本发明的实施例，第n天所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值比第0天所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值减少，是所述待筛选药物为目标药物的指示，其中，n为不小于1的整数。根据本发明实施例，类器官施药当天为第0天；标准化值为第n天所述类器官施药后的总最大截面积与第0天所述类器官施药后的总最大截面积的比值，如，第1天类器官总最大截面积的标准化值为：s1＝第1天所述类器官施药后的总最大截面积/第0天所述类器官施药后的总最大截面积，s2＝第2天所述类器官施药后的总最大截面积/第0天所述类器官施药后的总最大截面积，s3＝第3天所述类器官施药后的总最大截面积/第0天所述类器官施药后的总最大截面积。18.根据本发明的实施例，第n天所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值比第0天所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值减少至少30％，是所述待筛选药物为目标药物的指示。根据本发明实施例，对待测药物进行15天类器官最大截面积标准化数值监测，其中，类器官面积标准化数值每隔3天检测一次，如果由于药物的药效作用而导致癌细胞灭忙、活性降低，则会出现肿瘤类器官面积变小、肿瘤类器官最大截面积标准化数值变小的结果，经过验证，得到类器官最大截面积后计算类器官总最大截面积标准化值，以类器官总最大截面积标准化值的变化为依据所得到的药物药效结果与病人用药后的临床反应具有很高的一致性。19.根据本发明的实施例，所述断层图像是从互不相同的多个截面取得的。根据本发明实施例，设置类器官半球基质胶的拍摄顶部和底部区间后进行可见光递进式断层拍摄扫描，其中，所拍摄的区间以及层间高度可依据实验需求自行设置参数，选择断层图像的拍摄截面时应保证在图像清晰的情况下该截面可以拍摄到尽量多的类器官，以最大程度还原类器官的位置和大小。20.根据本发明的实施例，所述断层图像是使用capture2.1软件拍摄。21.根据本发明的实施例，所述断层图像是使用capture2.1软件中的edf景深扩展功能拍摄。根据本发明实施例，所述方法对拍摄软件并无限制，任何可准确进行断层拍摄的软件均可使用。22.根据本发明的实施例，所述叠加图像是基于多张断层图像的吸光值和小波算法进行图像处理获得的。根据本发明实施例，所述方法对获得叠加图像的软件并无限制，任何可基于断层图像的吸光值和小波算法进行图像处理的软件均可使用。23.根据本发明的实施例，所述叠加图像是使用capture2.1软件叠加生成。24.根据本发明的实施例，所述类器官最大截面积是使用image‑proplus6.0和/或imagej软件计算。根据本发明实施例，所述方法对类器官最大截面积计算的软件并无限制，任何可对图像中类器官进行最大截面积计算的软件均可使用。25.根据本发明的实施例，所述类器官总最大截面积标准化值的变化是使用graphpadprism软件统计。根据本发明实施例，所述使用graphpadprism软件统计指使用graphpadprism软件进行绘图展示，所述方法对类器官总最大截面积标准化值的变化进行绘图的软件并无限制，任何可对类器官总最大截面积标准化值的变化进行绘图的软件均可使用。26.根据本发明的实施例，所述类器官总最大截面积的标准化值为类器官第n天的总最大截面积与第0天类器官总最大截面积的比值。27.根据本发明的实施例，类器官药物药效评价周期为15天。28.根据本发明的实施例，所述药效评价周期内从第0天开始每隔3天对类器官进行所述断层图像拍摄。根据本发明实施例，对待测药物进行15天类器官面积标准化值监测，其中，类器官面积标准化值每隔3天检测一次，得到的肠癌类药物药效结果与病人用药后的临床反应具有很高的一致性。29.根据本发明的实施例，所述类器官为肿瘤类器官。30.根据本发明的实施例，所述肿瘤类器官为肠癌类器官。31.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明32.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：33.图1是根据本发明实施例的肠癌类器官培养流程图；将肿瘤患者手术或活检的肿瘤组织，消化为细胞悬液，培养在基质胶内，生长成为具有三维结构的肿瘤类器官；34.图2是根据本发明实施例的肠癌类器官对肠癌药物进行药物实验的实验设计图；将类器官种植在48孔板中，待直径达到100μm时分别加入5‑氟尿嘧啶和伊立替康进行处理，每隔三天更换一次培养基，培养周期为15天；35.图3是根据本发明实施例的肠癌类器官对肠癌药物进行药物实验的过程中断层拍照的流程图及生成的叠加图像示例图；36.图4是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描，总最大截面积随z轴拍摄层间高度变化的趋势图；37.图5是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描，z轴拍摄层间高度为50μm(左)与150μm(右)截面积统计圈选结果的对比图；使用imagej进行圈选，150μm相较50μm丢失很多小型类器官的信号；38.图6是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描，更改光路前(左)、后(右)观察到的类器官断层图像对比图；39.图7是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描，高曝光度(左)及低曝光度(右)条件下观察到的类器官断层图像的对比图；40.图8是根据本发明实施例的肠癌类器官采用荧光显微镜连续断层扫描，总最大截面积随z轴拍摄层间高度变化的趋势图；41.图9是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜单层扫描获得的，第0天(左)及第6天(右)单焦平面类器官拍摄图；42.图10是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描获得的，第0天(左)及第6天(右)多张z‑stack焦平面叠加图；43.图11是根据本发明实施例的面积法采用倒置金相显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的，5‑氟尿嘧啶和伊立替康处理后类器官总最大截面积趋势图；44.图12是根据本发明实施例的面积法采用荧光显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的荧光标记断层叠加图像，其中，虚线框圈出的为代表性的大小形态各异的单个类器官；45.图13是根据本发明实施例的面积法采用荧光显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的，5‑氟尿嘧啶和伊立替康处理后类器官总最大截面积趋势图；46.图14是根据本发明实施例的三维建模法采用高倍显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的荧光标记断层图像；拍摄区间内共获得连续的56张图像，可以清楚的观察到类器官立体形态的变化，由最初无荧光信号，到渐渐拍摄到类器官上半部，中心部，下半部至信号丢失；47.图15是根据本发明实施例的三维建模法采用高倍显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的荧光标记断层图像采用matlab进行三维建模所得的示例图；左上为x轴方向横截面图，左下为z轴方向最大截面所在的铅垂面图，右上为y轴方向纵截面图，右下为z轴方向最大截面所在的铅垂面类器官圈选结果，虚线框圈出的即为每一个形态和大小不一的类器官；48.图16是根据本发明实施例的三维建模法采用高倍显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的，5‑氟尿嘧啶和伊立替康处理后类器官总表面积趋势图；以及49.图17是根据本发明实施例的肠癌类器官面积法对药物5‑氟尿嘧啶和伊立替康药效评价结果与病人临床用药后的反应结果对比图，其中，类器官药效结果分为敏感和不敏感(注：有些病人类器官依据其临床用药种类并未使用伊立替康处理，即临床上病人也未使用伊立替康)；临床病人的用药结果分为反应良好和反应差两类；图中可以看出，临床反应良好的病人，大多类器官药效为敏感，反应差的病人，类器官药效结果多数为不敏感，面积法测药效与临床结果相比具有很高的一致性，敏感性为81.03％，特异性为92.31％，准确率为86.36％。具体实施方式50.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。51.以下实施例以肠癌类器官为模型，利用先进的显微摄影技术，精确的判定在加入肿瘤药物后，基质胶中类器官在整个用药周期过程中的大小变化，从而判断肿瘤药物药效，指导临床用药。52.在一些实施方案中，发明人用倒置倒置金相显微镜进行扫描或钙黄绿素对类器官染色的条件下用倒置荧光显微镜进行扫描。只有在类器官形态良好时，倒置金相显微镜拍摄的类器官才能较好的区分类器官的生存和死亡情况，得较好的统计结果。当病人来源的类器官因个体差异导致形态各异，倒置金相显微镜拍摄下类器官的形态很难判断死活时，可以选择用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞，利用荧光显微镜进行类器官最大截面积的检测。所用倒置荧光显微镜进行断层扫描时激发光为紫外光；所用紫外光的波长为488nm。53.在一些实施方案中，每个处理组中有3个重复培养孔，每个培养孔中有多个类器官，对于可以利用倒置金相显微镜进行可见光成像的形态良好的类器官，可以直接利用倒置金相显微镜进行断层扫描；当病人来源的类器官因个体差异导致形态各异，倒置金相显微镜拍摄下类器官的形态很难判断死活时，可以选择用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞，利用荧光显微镜进行类器官最大截面积的检测。54.在一些实施方案中，将每个培养孔中的断层图像生成一张叠加图像，利用叠加图像可以精确的找出基质胶中每一个类器官的位置和最大截面积，并获得单个培养孔中所有类器官最大截面积之和，再将同一个处理组的3个重复孔获得的3个最大截面积再次加和并取平均值，在本发明中称该平均值为类器官的总最大截面积。依据类器官的最大截面积计算出类器官的总最大截面积，依据类器官的总最大截面积计算出类器官的总最大截面积的标准化值，从而评价类器官大小，类器官的大小即可反映药物的药效。该方法排除了类器官在基质胶中的位置，分布，大小，形态和异质性差异带来的统计误差；而且在整个加药周期中，可以在保持类器官原有状态的情况下，选取不同时间节点进行统计，观察不同时间点类器官的大小差异，从而精确的判定加药后的药效，为临床诊断和用药提供依据。经临床药效一致性验证证明，所述方法所测得药物药效评价结果与临床药效评价结果一致，因此，该方法是目前最准确的肿瘤类器官药物药效判定方法。55.下面将对实施例作具体介绍。56.实施例1肠癌类器官培养57.将收集到的新鲜肠癌活检肿瘤样本拍照并记录具体信息，比对无误后用预冷的pbs(加入100×penicillin/streptomycin)洗5次，每次5min。在无菌操作台上，将无菌培养皿置于冰上，并倒入适量预冷灭菌的pbs，然后将癌组织置于其中，用无菌刀片将肿瘤样本切成细小碎片后移入8ml经37℃预热的消化液中。消化液配方为：7mldmem培养基(gibco,c1199500bt)，500u/ml胶原酶iv(sigma‑aldrich,c9407)，1.5mg/ml胶原酶ii(solarbio,c8150)、20μg/ml透明质酸酶(solarbio,h8030)、0.1mg/ml中性蛋白酶ii(sigma‑aldrich,d4693)、10μmrhok抑制剂ly27632(sigma‑aldrich,y0503)和1％胎牛血清。37℃水浴摇床消化40min。消化完毕后200g离心5min，用预冷的灭菌pbs洗5次，每次5min。然后200g离心沉淀所有细胞团(离心前取20μl镜下观察并计算细胞数量)。提取后用预冷1ml枪头加入适量基质胶(康宁，#356231)，使每50μl基质胶中细胞团数量为200个左右，随后用200μl预冷枪头悬浮混匀，接种于预热24孔板中，每孔50μl。接种后培养板置于37℃恒温培养箱中孵育5‑8min后拿出。每孔加入500μl类器官培养基(丹望医疗，cat#k20001)，镜下观察接种情况，随后置于培养箱中培养。每日观察类器官生长情况并用显微镜进行拍照记录，每3日更换一次培养基，整体流程如图1所示。[0058]1‑2周传代一次。传代时，将培养孔内培养基吸去，加入500ml预冷pbs将培养板置于冰盒上放置片刻，预冷枪头将基质胶吹散，移入15ml无菌离心管中吹打将基质胶完全吹散混匀，4℃离心机69g离心5min，将上清及沉淀在底部的基质胶吸去。再加入预冷pbs重复洗三次即可除去基质胶。加入5ml预冷pbs重新悬浮管底类器官，吹打50～100次将类器官吹打成细胞团(镜下观察细胞团已被吹打成单细胞或细胞团即可)，4℃离心机69g离心5min。按类器官培养流程继续培养，传代时按每孔1比4的比例接种，培养基成分如表1所示。[0059]表1：肠癌类器官培养基组分表[0060][0061][0062]实施例2倒置金相显微镜拍摄类器官参数优化[0063]选取培养状态良好的类器官，按实施例1的方法消化并传代至48孔板中。初始接种类器官密度为10‑15/μl基质胶，每孔加入300μl培养基。最终每个孔10μl基质胶中含有200±50个类器官，当类器官直径达到100μm时进行参数优化实验，共设置3个重复孔，拍摄周期为15天，从第0天开始每隔3天对每个孔的类器官进行光学成像，用capture2.1拍摄软件的edf景深扩展功能结合倒置金相显微镜，进行递进式断层扫描输出多张z‑stack图。拍摄软件会依据每层吸光值，运用小波算法将多张z‑stack图进行叠加，生成一张完整的包含所有拍摄到的类器官的叠加图像，具体操作流程如图3所示。[0064]1、拍摄区间优化[0065]由于基质胶与细胞不同为半球状固体，因此需要先确定基质胶的拍摄顶部和底部区间，即从哪里开始拍，到哪里结束。经过对该参数的优化，发明人得出10μl半球状基质胶的拍摄区间约为1500μm较佳。[0066]2、拍摄层间高度优化[0067]层间高度，即断层拍摄时，在拍摄区间内选择每隔多少微米拍一张照片才会使最终输出的图像最佳。发明人设置不同z轴的拍摄层高为10、25、50、75、100、150μm，具体结果如图4、5所示。由图4可知，随着z轴拍摄层间高度的增大，所得类器官总截面积越来越小，且图5所示的面积统计圈选可以看出层间高度150μm与50μm相比，丢失了很多小的类器官信号；10、25、50μm面积统计结果基本无差异；此外，层间高度设置越小，耗时越长，计算机及拍摄机器耗损越大。因此，综合上述结果，发明人选择50μm作为层间高度的设置值。[0068]3、光路和曝光度[0069]由于目前市面上的高内涵仪器在拍摄培养类器官或细胞的多孔板(平底板)时，聚光镜发散出平行光α，在孔板内部，形成光折射，产生β夹角，造成光照不均匀现象；使靠近孔板边缘的类器官，无法清晰观察。因此，发明人对光路进行改变，在所用48孔板顶部加入匀光板，打乱平行光路，使其成为均匀的散射光，如图6所示。为了输出准确的统计图像，还需要确定最佳曝光度，以统一叠加时使用的光强度，过度曝光或曝光太低都会导致拍出来的图像效果不佳，干扰统计结果。经过筛选，发明人发现，将lut(lookuptable)设置在50‑55k范围内效果最佳，所得图像如图7所示。[0070]实施例3荧光显微镜拍摄类器官层间高度参数优化[0071]选取培养状态良好的类器官，按实施例1的方法消化并传代至48孔板中。初始接种类器官密度为10‑15/μl基质胶，每孔加入300μl培养基。最终每个孔10μl基质胶中含有200±50个类器官，当类器官直径达到100μm时进行参数优化实验，共设置3个重复孔，拍摄周期为15天，从第0天开始每隔3天对每个孔的类器官进行光学成像，用capture2.1拍摄软件的edf景深扩展功能结合倒置荧光显微镜，进行递进式断层扫描输出多张z‑stack图。拍摄软件会依据每层吸光值，运用小波算法将多张z‑stack图进行叠加，生成一张完整的包含所有拍摄到的类器官的叠加图像，具体操作流程如图4所示。[0072]发明人采用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞。在培养周期的15天里，从第0天开始每隔3天对每个孔的多个类器官进行钙黄绿素标记和荧光成像。在培养基中加入终浓度4μm的钙黄绿素染色60min，用capture2.1拍摄软件的edf景深扩展功能结合倒置荧光显微镜，用488nm激发光显现绿色荧光图片。发明人对z轴的拍摄层间高度进行筛选，将层间高度设置为25、50、100、150、200μm，结果表明10μl半球状基质胶的拍摄层高设置为100μm较佳，其余参数与实施例2一致，具体结果如图8所示。[0073]实施例4连续断层拍摄与传统单层拍摄图像对比[0074]将实施例2中获得的类器官用倒置金相显微镜分别获得传统单视野图像，及根据实施例2中的参数进行断层扫描获得的叠加图像。单层拍摄得到的图片经常包含很多虚焦面类器官，既无法观测类器官存活情况，也为面积统计带来困难，往往导致实验结果误差偏大。在第0天时，寻找到一个大多数类器官都在同拍摄焦面内的视野，使用单焦平面拍摄；在第6天时，与第0天同视野内，类器官经过培养增大，焦平面变得不统一，如图9所示，不能被聚焦的类器官，在成像时，形成光斑虚影，导致可观察到的类器官数量丢失，形成误差。连续断层拍摄很好的避免了上述弊端，生成的图像类器官清晰，面积统计便捷。在第0天时，寻找到一个，大多数类器官都在同拍摄焦面内的视野，使用z‑stack多层焦平面拍摄，并使用edf功能合成为一张叠加图像。第6天时采用同样的方法拍摄，能较好的在一张叠加图像上观察到不同焦平面的多个类器官，如图10所示。[0075]实施例5面积法评价药物药效准确性验证[0076]选取培养状态良好的类器官，按实施例1的方法消化并传代至48孔板中。初始接种类器官密度为10‑15/μl基质胶，每孔加入300μl培养基。最终每个孔10μl基质胶中含有200±50个类器官，当类器官直径达到100μm时进行药物处理。2个实验组，包括5‑氟尿嘧啶(5‑fu)组和伊立替康(cpt‑11)组。分别将实验组类器官的培养基中加入10mm5‑fu(selleck,s1209)或10mmcpt‑11(selleck,s2217)，3天后用加入药物的培养基更换旧培养基，后续用不含药物的培养基每3天更换一次。从进行加药时起，进行为期15天的培养，如图2所示，具体操作流程同实施例2，为期15天培养结束后对获得的类器官进行如下实验操作：[0077]1、面积法评价药物药效[0078]1)倒置金相显微镜拍摄类器官[0079]本实验设置2个实验组，每个处理组设置3个重复孔。[0080]在加药后的15天里，从第0天开始每隔3天对两种药物5‑fu和cpt‑11处理的每个孔的类器官进行光学成像，具体操作流程及参数设置同实施例2。[0081]使用image‑proplus6.0(mediacybernetics,inc.)或imagej软件(nationalinstituteofhealth,usa)测量每个培养孔叠加图像中类器官个数及每个类器官最大截面积，将每个培养孔中多个类器官的最大截面积相加，再计算每个处理组中3个重复培养孔最大截面积加和后的平均值，获得该处理组的总最大截面积。将第0天的类器官总最大截面积标准化为100％，第1天及随后天数统计的类器官总最大截面积与第0天总最大截面积的比值为标准化值，即获得培养周期内每3天的类器官总最大截面积百分比，具体结果如表2所示。用graphpadprism制作不同处理方式下类器官加药前后总最大截面积变化，如图11所示。依据加药后类器官总最大截面积的标准化值变化的结果推断肿瘤药物的药效，用于临床用药指导。[0082]表2：[0083]天数5‑氟尿嘧啶组伊立替康组0100±8.2100±7.53110±10.7147±8.9680±7.250±11.7960±8.140±6.61248±5.020±4.81536±6.216±8.5[0084]2)倒置荧光显微镜拍摄类器官[0085]本实验设置2个实验组，每个处理组设置18个孔。[0086]发明人采用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞。在加药后的15天里，从第0天开始每隔3天对每个处理的3个孔的类器官进行钙黄绿素标记和荧光成像。在每次检测的3个孔的培养基中加入终浓度4μm的钙黄绿素染色60min，染色后的类器官不再使用；用capture2.1拍摄软件的edf景深扩展功能结合倒置荧光显微镜，用488nm激发光显现绿色荧光，具体操作流程及参数设置与实施例3一致，所得荧光标记的断层叠加图像如图13所示。[0087]使用image‑proplus6.0(mediacybernetics,inc.)或imagej软件(nationalinstituteofhealth,usa)测量每个培养孔叠加图像中类器官个数及每个类器官最大截面积，将每个培养孔中多个类器官的最大截面积相加，再计算每个处理组中3个重复培养孔最大截面积加和后的平均值，获得该处理组的总最大截面积。将第0天的类器官总最大截面积标准化为100％，第1天及随后天数统计的类器官总最大截面积与第0天总最大截面积的比值为标准化值，即获得培养周期内每3天的类器官总最大截面积百分比，具体结果如表3所示。用graphpadprism制作不同处理方式下类器官加药前后总最大截面积变化，如图13所示。[0088]表3:[0089]天数5‑氟尿嘧啶组伊立替康组0100±7.5100±6.53123±11.7167±6.8688±8.264±10.4966±8.144±8.61251±6.431±5.71537±5.224±8.5[0090]2、三维建模法评价药物药效[0091]本实验设置2个实验组，每个处理组设置18个孔。[0092]发明人采用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞。在加药后的15天里，从第0天开始每隔3天对每个处理的3个孔的类器官进行钙黄绿素标记和荧光成像。在每次检测的3个孔的培养基中加入终浓度4μm的钙黄绿素染色60min，染色后的类器官不再使用；利用荧光染色后的类器官结合40倍以上可过滤杂光的高倍显微镜对类器官进行断层拍摄，如图14所示。[0093]采用matlab对获得的断层图像进行三维建模，如图15所示，利用三维建模统计加药后类器官的表面积。将第0天的类器官总表面积标准化为100％，随后天数统计的总表面积与第0天总表面积的比值为标准化值，获得培养周期内每隔3天类器官的总表面积百分比，具体结果如表4所示。用graphpadprism制作不同处理方式下类器官加药前后总面积标准化值的变化结果图，如图16所示。依据加药后类器官总表面积的标准化随时间变化的结果推断肿瘤药药效，用于临床用药指导。[0094]由上述三部分实验结果可以看出，采用面积法利用倒置金相显微镜或荧光标记后通过荧光显微镜连续断层扫描类器官叠加统计其最大截面变化以评价药物药效，与采用三维建模的方法统计类器官表面积变化以评价药物药效，两种方法所得到的药效评价结果一致。[0095]表4：[0096]天数5‑氟尿嘧啶组伊立替康组0100±10.2100±9.43177±12.7201±10.76145±8.384±11.9977±8.056±7.51262±7.135±5.81536±6.021±8.0[0097]实施例6面积法测药效与临床药效一致性验证[0098]发明人采用面积法测量110个肠癌患者来源的类器官对临床药物5‑氟尿嘧啶和伊立替康的敏感性，并与病人临床用药后的反应进行一致性验证。如图17所示，类器官药效结果分为敏感和不敏感(注：有些病人类器官依据其临床用药种类并未使用伊立替康处理，即临床上病人也未使用伊立替康)，临床病人的用药结果分为反应良好和反应差两类；从图中可以看出，临床反应良好的病人，大多类器官药效为敏感，反应差的病人，类器官药效结果多数为不敏感。面积法测药效与临床结果相比具有很高的一致性，敏感性为81.03％，特异性为92.31％，准确率为86.36％。这表明在后续的临床试验和临床实践中，进行包含更多药物的类器官药敏试验不仅可以替患者找到真正有效的治疗药物，同时也提示那些没有发现有效药物的患者去尝试新的治疗方式或策略。[0099]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。[0100]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12当前第1页12
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：：2.近年来，肿瘤逐渐成为我国人口的主要死亡原因。2017年约221万人因肿瘤去世，占当年所有死亡人数的24.8％。此外，肿瘤属于较典型的老年性疾病，随着我国人口老龄化程度的加剧，未来几十年内，预计因肿瘤死亡的人口比例会大幅增加，给社会带来巨大的压力和挑战。肿瘤治疗主要有手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗及内分泌治疗等手段。其中约70％的患者需要放化疗，但由于患者个体差异，肿瘤耐药或辐射抵抗，目前临床肿瘤药物整体有效率低(30％左右)，肿瘤不必要的治疗和没有效果的治疗造成巨大浪费。因此，肿瘤个性化治疗迫在眉睫。加速肿瘤临床药物的研发进程，为上市肿瘤药物筛选到敏感治疗人群，是改变肿瘤治疗现状的重要支点。3.目前国际上主要的肿瘤药物研发模型有：肿瘤细胞系模型、患者肿瘤组织异源移植即pdx模型。2d细胞系筛选成本低，效率高，但细胞系为永生化单一类型，不能反映肿瘤的异质性、空间结构以及各类细胞间的交流。人源肿瘤异体移植模型虽然可以比较真实的反映肿瘤在体内的状态，保留肿瘤的异质性，但其存在物种差异，制作周期长、成本高等问题，且很多肿瘤尚未成功建系且不能较快的反映用药效果。2014年以来，类器官技术异军突起。相比主流的药物研发技术，类器官具有无可比拟的优势和先进性。4.类器官(organoid)是利用胚胎干细胞、多能干细胞或成体体细胞，在一定的培养环境和细胞外基质的支撑作用下形成的具有三维结构的，在功能上接近器官的多细胞结构。肿瘤类器官(patient‑derivedtumororganoids,pdtos)是指取自肿瘤患者自身的原发性肿瘤组织在实验室中培养起来的一种微型立体3d多细胞结构。相比于2d细胞系培养，肿瘤类器官具有三维结构，保留了肿瘤组织的异质性，更接近体内肿瘤的状态。相比于异体移植瘤模型，类器官效率高，成本低，能更好地实现高通量药物筛选，更为精确迅速地模拟出患者真实的药物治疗响应情况。5.由于类器官一般在近似半球形的基质胶固体上培养，会存在位置以及接触生长因子能力的差异，且类器官本身具有很强的异质性，导致它们的形态大小和分布不一。目前评价类器官大小的方法主要是图像分析法，该方法是将生长在基质胶上的类器官，在光学或荧光显微镜下选取某个视野进行拍照。将输出图片中的每个类器官进行面积以及存活率统计，从而判断加药后类器官的大小变化和细胞存活情况。另外一种方法是让类器官生长在特定的水凝胶包被的微腔内，使他们尽可能长在一个维度和焦平面上，从而拍摄单平面照片进行面积及存活统计，但这一方法会大大降低类器官的异质性。由于是3d培养模式，每个类器官所处的焦平面不同。因此形态不一以及可测量性有限，导致类器官难以进行高通量定量操作。目前已有的相对定量方法仅采用光学或荧光显微镜拍摄的一个截面进行统计，并不能精确的指示每个类器官的最大截面，因此不能很好的指示用药药效。现有的方法都无法在保持类器官原有的状态下摆脱上述弊端，进行精确的药效分析。技术实现要素：6.本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：7.发明人发现，将类器官采用显微镜连续断层拍摄扫描后进行最大光强度投影，找出每个类器官的最大截面进行定量分析，可以很好的解决拍摄一个截面不能精确的指示每个类器官的最大截面积的难题；连续断层拍摄获得的叠加图像与传统单焦平面类器官拍摄图相比，图像更加清晰。将断层图像叠加后计算类器官总最大截面积，根据不同药物处理组的类器官总最大截面积标准化值的变化测出药物药效结果，所得结果与类器官测定药物药效的国标法结果相吻合。因此，类器官连续断层拍摄计算面积的方法可以准确的评估肿瘤药物的药效。8.为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测类器官最大截面积的方法，所述方法包括：1)对待测类器官进行可见光断层扫描处理，以便获得多个断层图像；2)将步骤1)所获得的多个断层图像进行叠加处理，以便获得叠加图像；以及3)基于所述叠加图像，获得待测类器官的最大截面积。根据本发明的实施例，利用所述检测类器官最大截面积的方法生成的类器官图像清晰，相较于传统方法只拍摄一个截面观察到的类器官数量更加准确。9.根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：10.根据本发明的实施例，所述待测类器官预先培养于基质胶，所述基质胶呈半球状，所述可见光断层扫描是在以下条件的至少之一下进行的：基质胶的体积与拍摄区间的比值为1μl：150μm；层间高度为48～52μm或98～102μm；在多孔板顶部加入匀光板；lut值为50～55k。根据本发明的实施例，层间高度设置越小获得的断层图像越多，叠加图像就越能反应类器官的真实位置和大小，但层高设置越小，耗时越长，计算机及拍摄机器耗损越大；且光照不均匀、过度曝光或曝光太低等问题都会导致拍摄出的图像效果不佳，不利于进行断层图像的叠加，因此，发明人对可见光断层扫描的拍摄区间、层间高度、光路及曝光强度进行优化；根据本发明实施例优化后的断层扫描参数进行拍摄，获得的类器官图像清晰，断层图像的光强度一致，使得统计结果更加准确，药效评价结果更真实。11.根据本发明的实施例，所述可见光断层扫描是在自然光投射条件下，用倒置金相显微镜进行扫描或钙黄绿素对类器官染色的条件下用倒置荧光显微镜进行扫描。根据本发明的实施例，只有在类器官形态良好时，倒置金相显微镜拍摄的类器官才能较好的区分类器官的生存和死亡情况，得较好的统计结果。当病人来源的类器官因个体差异导致形态各异，根据倒置金相显微镜在明场条件下所拍摄类器官的形态很难判断死活时，可以选择用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞，利用荧光显微镜进行类器官最大截面积的检测。根据本发明实施例，当类器官形态良好时，所述可见光断层扫描对可见光显微镜并无限制，任何可准确进行观察的可见光显微镜均可使用。12.根据本发明的实施例，所述倒置荧光显微镜进行断层扫描时激发光为紫外光。13.根据本发明的实施例，所述紫外光的波长为488nm。14.在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物药效评价方法，所述方法包括：对类器官施加待筛选药物；基于类器官施药后的最大截面积，确认类器官施药后的总最大截面积；基于类器官施药后的总最大截面积，确定类器官施药后的总最大截面积的标准化值；以及基于所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值，确定所述待筛选药物是否为目标药物；其中，类器官的最大截面积是通过第一方面所述的方法获得的，总最大截面积是获得的多个类器官最大截面积之和与重复数的比值，所述处理重复数为预先设置的重复孔的数量。根据本发明实施例，利用所述检测类器官最大截面积的方法生成的类器官图像清晰、可观察到的类器官数量较拍摄一个截面更加准确，得到的肿瘤药物药效评价结果与病人用药后的临床反应具有很高的一致性。15.根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：16.根据本发明的实施例，所述重复孔的数量为3。根据本发明实施例，所述待测类器官预先培养于基质胶，基质胶置于48孔板的培养孔内，当m个培养孔进行相同处理时，这m个培养孔即为同一处理的重复孔，该处理的重复孔数量即为m，其中，m为大于0的整数。17.根据本发明的实施例，第n天所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值比第0天所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值减少，是所述待筛选药物为目标药物的指示，其中，n为不小于1的整数。根据本发明实施例，类器官施药当天为第0天；标准化值为第n天所述类器官施药后的总最大截面积与第0天所述类器官施药后的总最大截面积的比值，如，第1天类器官总最大截面积的标准化值为：s1＝第1天所述类器官施药后的总最大截面积/第0天所述类器官施药后的总最大截面积，s2＝第2天所述类器官施药后的总最大截面积/第0天所述类器官施药后的总最大截面积，s3＝第3天所述类器官施药后的总最大截面积/第0天所述类器官施药后的总最大截面积。18.根据本发明的实施例，第n天所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值比第0天所述类器官施药后的总最大截面积的标准化值减少至少30％，是所述待筛选药物为目标药物的指示。根据本发明实施例，对待测药物进行15天类器官最大截面积标准化数值监测，其中，类器官面积标准化数值每隔3天检测一次，如果由于药物的药效作用而导致癌细胞灭忙、活性降低，则会出现肿瘤类器官面积变小、肿瘤类器官最大截面积标准化数值变小的结果，经过验证，得到类器官最大截面积后计算类器官总最大截面积标准化值，以类器官总最大截面积标准化值的变化为依据所得到的药物药效结果与病人用药后的临床反应具有很高的一致性。19.根据本发明的实施例，所述断层图像是从互不相同的多个截面取得的。根据本发明实施例，设置类器官半球基质胶的拍摄顶部和底部区间后进行可见光递进式断层拍摄扫描，其中，所拍摄的区间以及层间高度可依据实验需求自行设置参数，选择断层图像的拍摄截面时应保证在图像清晰的情况下该截面可以拍摄到尽量多的类器官，以最大程度还原类器官的位置和大小。20.根据本发明的实施例，所述断层图像是使用capture2.1软件拍摄。21.根据本发明的实施例，所述断层图像是使用capture2.1软件中的edf景深扩展功能拍摄。根据本发明实施例，所述方法对拍摄软件并无限制，任何可准确进行断层拍摄的软件均可使用。22.根据本发明的实施例，所述叠加图像是基于多张断层图像的吸光值和小波算法进行图像处理获得的。根据本发明实施例，所述方法对获得叠加图像的软件并无限制，任何可基于断层图像的吸光值和小波算法进行图像处理的软件均可使用。23.根据本发明的实施例，所述叠加图像是使用capture2.1软件叠加生成。24.根据本发明的实施例，所述类器官最大截面积是使用image‑proplus6.0和/或imagej软件计算。根据本发明实施例，所述方法对类器官最大截面积计算的软件并无限制，任何可对图像中类器官进行最大截面积计算的软件均可使用。25.根据本发明的实施例，所述类器官总最大截面积标准化值的变化是使用graphpadprism软件统计。根据本发明实施例，所述使用graphpadprism软件统计指使用graphpadprism软件进行绘图展示，所述方法对类器官总最大截面积标准化值的变化进行绘图的软件并无限制，任何可对类器官总最大截面积标准化值的变化进行绘图的软件均可使用。26.根据本发明的实施例，所述类器官总最大截面积的标准化值为类器官第n天的总最大截面积与第0天类器官总最大截面积的比值。27.根据本发明的实施例，类器官药物药效评价周期为15天。28.根据本发明的实施例，所述药效评价周期内从第0天开始每隔3天对类器官进行所述断层图像拍摄。根据本发明实施例，对待测药物进行15天类器官面积标准化值监测，其中，类器官面积标准化值每隔3天检测一次，得到的肠癌类药物药效结果与病人用药后的临床反应具有很高的一致性。29.根据本发明的实施例，所述类器官为肿瘤类器官。30.根据本发明的实施例，所述肿瘤类器官为肠癌类器官。31.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明32.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：33.图1是根据本发明实施例的肠癌类器官培养流程图；将肿瘤患者手术或活检的肿瘤组织，消化为细胞悬液，培养在基质胶内，生长成为具有三维结构的肿瘤类器官；34.图2是根据本发明实施例的肠癌类器官对肠癌药物进行药物实验的实验设计图；将类器官种植在48孔板中，待直径达到100μm时分别加入5‑氟尿嘧啶和伊立替康进行处理，每隔三天更换一次培养基，培养周期为15天；35.图3是根据本发明实施例的肠癌类器官对肠癌药物进行药物实验的过程中断层拍照的流程图及生成的叠加图像示例图；36.图4是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描，总最大截面积随z轴拍摄层间高度变化的趋势图；37.图5是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描，z轴拍摄层间高度为50μm(左)与150μm(右)截面积统计圈选结果的对比图；使用imagej进行圈选，150μm相较50μm丢失很多小型类器官的信号；38.图6是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描，更改光路前(左)、后(右)观察到的类器官断层图像对比图；39.图7是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描，高曝光度(左)及低曝光度(右)条件下观察到的类器官断层图像的对比图；40.图8是根据本发明实施例的肠癌类器官采用荧光显微镜连续断层扫描，总最大截面积随z轴拍摄层间高度变化的趋势图；41.图9是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜单层扫描获得的，第0天(左)及第6天(右)单焦平面类器官拍摄图；42.图10是根据本发明实施例的肠癌类器官采用倒置金相显微镜连续断层扫描获得的，第0天(左)及第6天(右)多张z‑stack焦平面叠加图；43.图11是根据本发明实施例的面积法采用倒置金相显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的，5‑氟尿嘧啶和伊立替康处理后类器官总最大截面积趋势图；44.图12是根据本发明实施例的面积法采用荧光显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的荧光标记断层叠加图像，其中，虚线框圈出的为代表性的大小形态各异的单个类器官；45.图13是根据本发明实施例的面积法采用荧光显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的，5‑氟尿嘧啶和伊立替康处理后类器官总最大截面积趋势图；46.图14是根据本发明实施例的三维建模法采用高倍显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的荧光标记断层图像；拍摄区间内共获得连续的56张图像，可以清楚的观察到类器官立体形态的变化，由最初无荧光信号，到渐渐拍摄到类器官上半部，中心部，下半部至信号丢失；47.图15是根据本发明实施例的三维建模法采用高倍显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的荧光标记断层图像采用matlab进行三维建模所得的示例图；左上为x轴方向横截面图，左下为z轴方向最大截面所在的铅垂面图，右上为y轴方向纵截面图，右下为z轴方向最大截面所在的铅垂面类器官圈选结果，虚线框圈出的即为每一个形态和大小不一的类器官；48.图16是根据本发明实施例的三维建模法采用高倍显微镜对肠癌类器官连续断层扫描获得的，5‑氟尿嘧啶和伊立替康处理后类器官总表面积趋势图；以及49.图17是根据本发明实施例的肠癌类器官面积法对药物5‑氟尿嘧啶和伊立替康药效评价结果与病人临床用药后的反应结果对比图，其中，类器官药效结果分为敏感和不敏感(注：有些病人类器官依据其临床用药种类并未使用伊立替康处理，即临床上病人也未使用伊立替康)；临床病人的用药结果分为反应良好和反应差两类；图中可以看出，临床反应良好的病人，大多类器官药效为敏感，反应差的病人，类器官药效结果多数为不敏感，面积法测药效与临床结果相比具有很高的一致性，敏感性为81.03％，特异性为92.31％，准确率为86.36％。具体实施方式50.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。51.以下实施例以肠癌类器官为模型，利用先进的显微摄影技术，精确的判定在加入肿瘤药物后，基质胶中类器官在整个用药周期过程中的大小变化，从而判断肿瘤药物药效，指导临床用药。52.在一些实施方案中，发明人用倒置倒置金相显微镜进行扫描或钙黄绿素对类器官染色的条件下用倒置荧光显微镜进行扫描。只有在类器官形态良好时，倒置金相显微镜拍摄的类器官才能较好的区分类器官的生存和死亡情况，得较好的统计结果。当病人来源的类器官因个体差异导致形态各异，倒置金相显微镜拍摄下类器官的形态很难判断死活时，可以选择用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞，利用荧光显微镜进行类器官最大截面积的检测。所用倒置荧光显微镜进行断层扫描时激发光为紫外光；所用紫外光的波长为488nm。53.在一些实施方案中，每个处理组中有3个重复培养孔，每个培养孔中有多个类器官，对于可以利用倒置金相显微镜进行可见光成像的形态良好的类器官，可以直接利用倒置金相显微镜进行断层扫描；当病人来源的类器官因个体差异导致形态各异，倒置金相显微镜拍摄下类器官的形态很难判断死活时，可以选择用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞，利用荧光显微镜进行类器官最大截面积的检测。54.在一些实施方案中，将每个培养孔中的断层图像生成一张叠加图像，利用叠加图像可以精确的找出基质胶中每一个类器官的位置和最大截面积，并获得单个培养孔中所有类器官最大截面积之和，再将同一个处理组的3个重复孔获得的3个最大截面积再次加和并取平均值，在本发明中称该平均值为类器官的总最大截面积。依据类器官的最大截面积计算出类器官的总最大截面积，依据类器官的总最大截面积计算出类器官的总最大截面积的标准化值，从而评价类器官大小，类器官的大小即可反映药物的药效。该方法排除了类器官在基质胶中的位置，分布，大小，形态和异质性差异带来的统计误差；而且在整个加药周期中，可以在保持类器官原有状态的情况下，选取不同时间节点进行统计，观察不同时间点类器官的大小差异，从而精确的判定加药后的药效，为临床诊断和用药提供依据。经临床药效一致性验证证明，所述方法所测得药物药效评价结果与临床药效评价结果一致，因此，该方法是目前最准确的肿瘤类器官药物药效判定方法。55.下面将对实施例作具体介绍。56.实施例1肠癌类器官培养57.将收集到的新鲜肠癌活检肿瘤样本拍照并记录具体信息，比对无误后用预冷的pbs(加入100×penicillin/streptomycin)洗5次，每次5min。在无菌操作台上，将无菌培养皿置于冰上，并倒入适量预冷灭菌的pbs，然后将癌组织置于其中，用无菌刀片将肿瘤样本切成细小碎片后移入8ml经37℃预热的消化液中。消化液配方为：7mldmem培养基(gibco,c1199500bt)，500u/ml胶原酶iv(sigma‑aldrich,c9407)，1.5mg/ml胶原酶ii(solarbio,c8150)、20μg/ml透明质酸酶(solarbio,h8030)、0.1mg/ml中性蛋白酶ii(sigma‑aldrich,d4693)、10μmrhok抑制剂ly27632(sigma‑aldrich,y0503)和1％胎牛血清。37℃水浴摇床消化40min。消化完毕后200g离心5min，用预冷的灭菌pbs洗5次，每次5min。然后200g离心沉淀所有细胞团(离心前取20μl镜下观察并计算细胞数量)。提取后用预冷1ml枪头加入适量基质胶(康宁，#356231)，使每50μl基质胶中细胞团数量为200个左右，随后用200μl预冷枪头悬浮混匀，接种于预热24孔板中，每孔50μl。接种后培养板置于37℃恒温培养箱中孵育5‑8min后拿出。每孔加入500μl类器官培养基(丹望医疗，cat#k20001)，镜下观察接种情况，随后置于培养箱中培养。每日观察类器官生长情况并用显微镜进行拍照记录，每3日更换一次培养基，整体流程如图1所示。[0058]1‑2周传代一次。传代时，将培养孔内培养基吸去，加入500ml预冷pbs将培养板置于冰盒上放置片刻，预冷枪头将基质胶吹散，移入15ml无菌离心管中吹打将基质胶完全吹散混匀，4℃离心机69g离心5min，将上清及沉淀在底部的基质胶吸去。再加入预冷pbs重复洗三次即可除去基质胶。加入5ml预冷pbs重新悬浮管底类器官，吹打50～100次将类器官吹打成细胞团(镜下观察细胞团已被吹打成单细胞或细胞团即可)，4℃离心机69g离心5min。按类器官培养流程继续培养，传代时按每孔1比4的比例接种，培养基成分如表1所示。[0059]表1：肠癌类器官培养基组分表[0060][0061][0062]实施例2倒置金相显微镜拍摄类器官参数优化[0063]选取培养状态良好的类器官，按实施例1的方法消化并传代至48孔板中。初始接种类器官密度为10‑15/μl基质胶，每孔加入300μl培养基。最终每个孔10μl基质胶中含有200±50个类器官，当类器官直径达到100μm时进行参数优化实验，共设置3个重复孔，拍摄周期为15天，从第0天开始每隔3天对每个孔的类器官进行光学成像，用capture2.1拍摄软件的edf景深扩展功能结合倒置金相显微镜，进行递进式断层扫描输出多张z‑stack图。拍摄软件会依据每层吸光值，运用小波算法将多张z‑stack图进行叠加，生成一张完整的包含所有拍摄到的类器官的叠加图像，具体操作流程如图3所示。[0064]1、拍摄区间优化[0065]由于基质胶与细胞不同为半球状固体，因此需要先确定基质胶的拍摄顶部和底部区间，即从哪里开始拍，到哪里结束。经过对该参数的优化，发明人得出10μl半球状基质胶的拍摄区间约为1500μm较佳。[0066]2、拍摄层间高度优化[0067]层间高度，即断层拍摄时，在拍摄区间内选择每隔多少微米拍一张照片才会使最终输出的图像最佳。发明人设置不同z轴的拍摄层高为10、25、50、75、100、150μm，具体结果如图4、5所示。由图4可知，随着z轴拍摄层间高度的增大，所得类器官总截面积越来越小，且图5所示的面积统计圈选可以看出层间高度150μm与50μm相比，丢失了很多小的类器官信号；10、25、50μm面积统计结果基本无差异；此外，层间高度设置越小，耗时越长，计算机及拍摄机器耗损越大。因此，综合上述结果，发明人选择50μm作为层间高度的设置值。[0068]3、光路和曝光度[0069]由于目前市面上的高内涵仪器在拍摄培养类器官或细胞的多孔板(平底板)时，聚光镜发散出平行光α，在孔板内部，形成光折射，产生β夹角，造成光照不均匀现象；使靠近孔板边缘的类器官，无法清晰观察。因此，发明人对光路进行改变，在所用48孔板顶部加入匀光板，打乱平行光路，使其成为均匀的散射光，如图6所示。为了输出准确的统计图像，还需要确定最佳曝光度，以统一叠加时使用的光强度，过度曝光或曝光太低都会导致拍出来的图像效果不佳，干扰统计结果。经过筛选，发明人发现，将lut(lookuptable)设置在50‑55k范围内效果最佳，所得图像如图7所示。[0070]实施例3荧光显微镜拍摄类器官层间高度参数优化[0071]选取培养状态良好的类器官，按实施例1的方法消化并传代至48孔板中。初始接种类器官密度为10‑15/μl基质胶，每孔加入300μl培养基。最终每个孔10μl基质胶中含有200±50个类器官，当类器官直径达到100μm时进行参数优化实验，共设置3个重复孔，拍摄周期为15天，从第0天开始每隔3天对每个孔的类器官进行光学成像，用capture2.1拍摄软件的edf景深扩展功能结合倒置荧光显微镜，进行递进式断层扫描输出多张z‑stack图。拍摄软件会依据每层吸光值，运用小波算法将多张z‑stack图进行叠加，生成一张完整的包含所有拍摄到的类器官的叠加图像，具体操作流程如图4所示。[0072]发明人采用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞。在培养周期的15天里，从第0天开始每隔3天对每个孔的多个类器官进行钙黄绿素标记和荧光成像。在培养基中加入终浓度4μm的钙黄绿素染色60min，用capture2.1拍摄软件的edf景深扩展功能结合倒置荧光显微镜，用488nm激发光显现绿色荧光图片。发明人对z轴的拍摄层间高度进行筛选，将层间高度设置为25、50、100、150、200μm，结果表明10μl半球状基质胶的拍摄层高设置为100μm较佳，其余参数与实施例2一致，具体结果如图8所示。[0073]实施例4连续断层拍摄与传统单层拍摄图像对比[0074]将实施例2中获得的类器官用倒置金相显微镜分别获得传统单视野图像，及根据实施例2中的参数进行断层扫描获得的叠加图像。单层拍摄得到的图片经常包含很多虚焦面类器官，既无法观测类器官存活情况，也为面积统计带来困难，往往导致实验结果误差偏大。在第0天时，寻找到一个大多数类器官都在同拍摄焦面内的视野，使用单焦平面拍摄；在第6天时，与第0天同视野内，类器官经过培养增大，焦平面变得不统一，如图9所示，不能被聚焦的类器官，在成像时，形成光斑虚影，导致可观察到的类器官数量丢失，形成误差。连续断层拍摄很好的避免了上述弊端，生成的图像类器官清晰，面积统计便捷。在第0天时，寻找到一个，大多数类器官都在同拍摄焦面内的视野，使用z‑stack多层焦平面拍摄，并使用edf功能合成为一张叠加图像。第6天时采用同样的方法拍摄，能较好的在一张叠加图像上观察到不同焦平面的多个类器官，如图10所示。[0075]实施例5面积法评价药物药效准确性验证[0076]选取培养状态良好的类器官，按实施例1的方法消化并传代至48孔板中。初始接种类器官密度为10‑15/μl基质胶，每孔加入300μl培养基。最终每个孔10μl基质胶中含有200±50个类器官，当类器官直径达到100μm时进行药物处理。2个实验组，包括5‑氟尿嘧啶(5‑fu)组和伊立替康(cpt‑11)组。分别将实验组类器官的培养基中加入10mm5‑fu(selleck,s1209)或10mmcpt‑11(selleck,s2217)，3天后用加入药物的培养基更换旧培养基，后续用不含药物的培养基每3天更换一次。从进行加药时起，进行为期15天的培养，如图2所示，具体操作流程同实施例2，为期15天培养结束后对获得的类器官进行如下实验操作：[0077]1、面积法评价药物药效[0078]1)倒置金相显微镜拍摄类器官[0079]本实验设置2个实验组，每个处理组设置3个重复孔。[0080]在加药后的15天里，从第0天开始每隔3天对两种药物5‑fu和cpt‑11处理的每个孔的类器官进行光学成像，具体操作流程及参数设置同实施例2。[0081]使用image‑proplus6.0(mediacybernetics,inc.)或imagej软件(nationalinstituteofhealth,usa)测量每个培养孔叠加图像中类器官个数及每个类器官最大截面积，将每个培养孔中多个类器官的最大截面积相加，再计算每个处理组中3个重复培养孔最大截面积加和后的平均值，获得该处理组的总最大截面积。将第0天的类器官总最大截面积标准化为100％，第1天及随后天数统计的类器官总最大截面积与第0天总最大截面积的比值为标准化值，即获得培养周期内每3天的类器官总最大截面积百分比，具体结果如表2所示。用graphpadprism制作不同处理方式下类器官加药前后总最大截面积变化，如图11所示。依据加药后类器官总最大截面积的标准化值变化的结果推断肿瘤药物的药效，用于临床用药指导。[0082]表2：[0083]天数5‑氟尿嘧啶组伊立替康组0100±8.2100±7.53110±10.7147±8.9680±7.250±11.7960±8.140±6.61248±5.020±4.81536±6.216±8.5[0084]2)倒置荧光显微镜拍摄类器官[0085]本实验设置2个实验组，每个处理组设置18个孔。[0086]发明人采用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞。在加药后的15天里，从第0天开始每隔3天对每个处理的3个孔的类器官进行钙黄绿素标记和荧光成像。在每次检测的3个孔的培养基中加入终浓度4μm的钙黄绿素染色60min，染色后的类器官不再使用；用capture2.1拍摄软件的edf景深扩展功能结合倒置荧光显微镜，用488nm激发光显现绿色荧光，具体操作流程及参数设置与实施例3一致，所得荧光标记的断层叠加图像如图13所示。[0087]使用image‑proplus6.0(mediacybernetics,inc.)或imagej软件(nationalinstituteofhealth,usa)测量每个培养孔叠加图像中类器官个数及每个类器官最大截面积，将每个培养孔中多个类器官的最大截面积相加，再计算每个处理组中3个重复培养孔最大截面积加和后的平均值，获得该处理组的总最大截面积。将第0天的类器官总最大截面积标准化为100％，第1天及随后天数统计的类器官总最大截面积与第0天总最大截面积的比值为标准化值，即获得培养周期内每3天的类器官总最大截面积百分比，具体结果如表3所示。用graphpadprism制作不同处理方式下类器官加药前后总最大截面积变化，如图13所示。[0088]表3:[0089]天数5‑氟尿嘧啶组伊立替康组0100±7.5100±6.53123±11.7167±6.8688±8.264±10.4966±8.144±8.61251±6.431±5.71537±5.224±8.5[0090]2、三维建模法评价药物药效[0091]本实验设置2个实验组，每个处理组设置18个孔。[0092]发明人采用钙黄绿素对类器官进行荧光标记，钙黄绿素仅标记活细胞。在加药后的15天里，从第0天开始每隔3天对每个处理的3个孔的类器官进行钙黄绿素标记和荧光成像。在每次检测的3个孔的培养基中加入终浓度4μm的钙黄绿素染色60min，染色后的类器官不再使用；利用荧光染色后的类器官结合40倍以上可过滤杂光的高倍显微镜对类器官进行断层拍摄，如图14所示。[0093]采用matlab对获得的断层图像进行三维建模，如图15所示，利用三维建模统计加药后类器官的表面积。将第0天的类器官总表面积标准化为100％，随后天数统计的总表面积与第0天总表面积的比值为标准化值，获得培养周期内每隔3天类器官的总表面积百分比，具体结果如表4所示。用graphpadprism制作不同处理方式下类器官加药前后总面积标准化值的变化结果图，如图16所示。依据加药后类器官总表面积的标准化随时间变化的结果推断肿瘤药药效，用于临床用药指导。[0094]由上述三部分实验结果可以看出，采用面积法利用倒置金相显微镜或荧光标记后通过荧光显微镜连续断层扫描类器官叠加统计其最大截面变化以评价药物药效，与采用三维建模的方法统计类器官表面积变化以评价药物药效，两种方法所得到的药效评价结果一致。[0095]表4：[0096]天数5‑氟尿嘧啶组伊立替康组0100±10.2100±9.43177±12.7201±10.76145±8.384±11.9977±8.056±7.51262±7.135±5.81536±6.021±8.0[0097]实施例6面积法测药效与临床药效一致性验证[0098]发明人采用面积法测量110个肠癌患者来源的类器官对临床药物5‑氟尿嘧啶和伊立替康的敏感性，并与病人临床用药后的反应进行一致性验证。如图17所示，类器官药效结果分为敏感和不敏感(注：有些病人类器官依据其临床用药种类并未使用伊立替康处理，即临床上病人也未使用伊立替康)，临床病人的用药结果分为反应良好和反应差两类；从图中可以看出，临床反应良好的病人，大多类器官药效为敏感，反应差的病人，类器官药效结果多数为不敏感。面积法测药效与临床结果相比具有很高的一致性，敏感性为81.03％，特异性为92.31％，准确率为86.36％。这表明在后续的临床试验和临床实践中，进行包含更多药物的类器官药敏试验不仅可以替患者找到真正有效的治疗药物，同时也提示那些没有发现有效药物的患者去尝试新的治疗方式或策略。[0099]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。[0100]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12当前第1页12
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