磷酸化Tau肽疫苗的安全施用方法与流程

磷酸化tau肽疫苗的安全施用方法
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2.发明领域本发明处于医药领域中。本发明尤其涉及磷酸化tau (ptau)肽的脂质体及其用于预防或治疗tau病变、诸如阿尔茨海默氏病的用途。
3.背景阿尔茨海默氏病(ad)是一种进行性衰弱性神经退行性疾病，其影响全世界估计4400万人(alzheimers.net)。目前商业化的ad疗法旨在对临床症状起作用，但不靶向作为疾病基础的致病过程(疾病改变作用)。不幸的是，目前的疗法只是最低限度地有效的，且因此迫切需要开发和测试额外的预防和治疗措施。
4.阿尔茨海默氏病的标志性病理是细胞外斑块的积聚，所述细胞外斑块包含显著聚集的淀粉样β蛋白和细胞内“缠结”或过度磷酸化的tau蛋白聚集物。导致这些蛋白积累的分子事件的表征不佳。对于淀粉样蛋白，假设淀粉样蛋白前体蛋白的异常切割导致包含氨基酸1
‑
42的易聚集片段的积累。对于tau，假设激酶、磷酸酶或两者的失调导致tau的异常磷酸化。一旦tau变得过度磷酸化，它就失去有效结合和稳定微管的能力，并且反而在受影响神经元的细胞质中积聚。未结合和过度磷酸化的tau似乎首先形成寡聚体，且然后形成更高级的聚集体，其存在据推测负面影响形成它们的神经元的功能，可能是经由正常轴突运输的中断。
5.在发达国家，被诊断具有阿尔茨海默氏病或其他痴呆tau蛋白病变的个体通常用胆碱酯酶抑制剂(例如aricept
®
)或美金刚(例如namenda
™
)进行治疗。这些药物，尽管被合理地良好耐受，但具有非常适度的效力。例如，在近似50%的治疗的个体中，aricept
®
将症状的恶化延迟6
‑
12个月。剩余的治疗是非药理学的，并且聚焦于使患者更有能力在其认知能力下降时管理日常任务。
6.目前正在开发用于预防和治疗ad的免疫疗法。用与ad相关的抗原的主动免疫可能刺激针对ad的基于抗体的免疫和细胞免疫的应答。然而，第一个广泛测试的人抗淀粉样蛋白β疫苗的评估在2002年停止。在ad患者中的靶向aβ的活性免疫治疗剂an
‑
1792的临床研究中观察到脑膜脑炎，一种可能致命的中枢神经系统炎症(orgogozo等人，2003)。在6%暴露于an
‑
1792的患者中发生的脑炎反应，被认为是由不需要的aβ
‑
特异性t
‑
细胞活化诱导。
7.迄今为止，很少用特异性靶向tau病理学的药剂进行研究。tau免疫疗法现在正在进入临床试验，但该领域仍处于其初期，并且对各种方法的效力和安全性的机制理解尚未完全确立(sigurdsson, neurodegener dis. 2016; 16(0): 34
–
38)。在针对全长tau蛋白免疫的小鼠中也报告了脑炎，即脑的炎症。然而，从在cns促炎环境下用单次注射磷酸化tau肽免疫的动物没有报告任何不良反应(rosenmann h., 2013. curr. alzheimer res. 10, 217
‑
228)。
8.最近已经公开了非磷酸化tau肽疫苗(aadvac1)在具有轻度至中度阿尔茨海默氏病的人患者中的长期安全性概况(novak等人, alzheimer's research & therapy (2018) 10:108)。该疫苗含有源自tau序列的氨基酸294至305的合成肽，其通过n
‑
末端半胱氨酸与钥孔
䗩
血蓝蛋白(klh)偶联。其以40
µ
g与klh偶联的肽(ckdnikhvpgggs)的剂量施用，其在0.3ml的磷酸盐缓冲液体积中具有氢氧化铝佐剂(含有0.5 mg al
3
)。在1期研究(fundamant研究)中，从26个研究中招募并与aadvac1治疗相关患者的观察到的不良事件(ae)是注射部位反应(红斑、肿胀、发热、瘙痒、疼痛、结节)。在50%的aadvac1治疗的患者中观察到这些ae中的一种或多种。注射部位反应是可逆的，并且主要表现是轻度的。观察到六种严重不良事件(sae)(腹绞痛、脱水、急性精神病、痴呆的行为和精神症状、二度房室传导阻滞和窦性心动过缓)。研究人员判断所述sae无一与aadvac1治疗有关。未观察到过敏或过敏反应。在实验室评价(凝血、血液生物化学、血液学和尿液分析)、生命体征评价或神经系统和身体检查中没有出现安全性信号。mri评价未检测到安全性信号。没有发生水肿性改变。没有观察到脑膜变化且没有观察到脑膜脑炎。在一个apoe4纯合子中观察到新的微出血，并且在一个apoe4杂合子中检测到浅层含铁血黄素，这两个事件在临床上都是沉默的。这被认为与ad患者群体中此类病变的背景发生率相符。
9.然而，尚未报道磷酸化tau肽疫苗在人患者中的安全性特征。需要一种安全且有效的神经元退行性疾病、诸如阿尔茨海默氏病的治疗。
10.发明概述本发明基于来自脂质体疫苗的临床研究的发现，所述脂质体疫苗包含呈递在脂质体的表面上的磷酸化tau肽。所述疫苗在人类中看起来被良好耐受。显示在比tau缀合物疫苗aadvac1试验中使用的剂量高得多的剂量下，ptau肽脂质体疫苗在人受试者中诱导抗磷酸化tau抗体，而不诱导严重的不良事件。
11.因此，在一个一般方面，本发明提供了在有此需要的人受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件、诸如脑炎的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含toll
‑
样受体4激动剂和tau磷酸肽的脂质体，所述tau磷酸肽包含选自seq id no:1至seq id no:3和seq id no:5至seq id no:12的氨基酸序列，其中所述tau磷酸肽以每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔、诸如每剂约29.7纳摩尔至约742.5纳摩尔、优选每剂约90纳摩尔至约715纳摩尔、诸如每剂约89.1纳摩尔至约712.8纳摩尔、或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔、诸如每剂约89.1纳摩尔至约534.6纳摩尔、或每剂约90纳摩尔至约275纳摩尔、诸如每剂约89.1纳摩尔至约267.3纳摩尔的量施用，且其中所述tau磷酸肽呈递于脂质体的表面上。在某些实施方案中，所述tau磷酸肽由选自seq id no:27至seq id no:29和seq id no:31至seq id no:38的氨基酸序列组成，优选地由seq id no:28的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，有效量的脂质体包含toll
‑
样受体4激动剂和由seq id no:28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化tau磷酸肽，其中所述四棕榈酰化tau磷酸肽呈递于脂质体的表面上且以每剂100μg至2500μg(对应于每剂29.7纳摩尔至742.5纳摩尔)、优选地每剂300μg至2400μg(对应于每剂89.1纳摩尔至712.8纳摩尔)、诸如每剂300μg、900μg、1800
µ
g或2400
µ
g(对应于每剂89.1纳摩尔、267.3纳摩尔、534.6纳摩尔或712.8纳摩尔)的量施用。
12.在一些实施方案中，本发明提供了在有此需要的人受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件、诸如脑炎的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含toll
‑
样受体4激动剂和呈递于脂质体的表面上的tau磷酸肽的脂质体，其中所述tau磷酸肽包含选自seq id no:1至seq id no:3和seq id no:5至seq id no:12的氨基酸序列，且所述tau磷酸肽以每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔的量施用，优选地所述tau磷酸肽是由seq id no:28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化tau磷酸肽且以每剂约300
µ
g、约900
µ
g、约1800
µ
g或约2400
µ
g的量或其之间的任何量施用。
13.在某些实施方案中，在有此需要的人受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件、诸如脑炎的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含toll
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样受体4激动剂和呈递于脂质体的表面上的tau磷酸肽的脂质体，其中所述tau磷酸肽包含选自seq id no:27至seq id no:29和seq id no:31至seq id no:38的氨基酸序列，且所述tau磷酸肽以每剂约90纳摩尔至约715纳摩尔、诸如每剂约29.7纳摩尔、约267.3纳摩尔、约534.6纳摩尔或约712.8纳摩尔的量或其之间的任何量施用。在一个实施方案中，有效量的脂质体包含每剂265至275纳摩尔、例如每剂265、266、267、268、269、270、271、272、273、274或275纳摩尔或其之间的任何值、诸如每剂约267.3纳摩尔的量的tau磷酸肽。在另一个实施方案中，有效量的脂质体包含每剂530至540纳摩尔、诸如每剂530、531、532、533、534、535、536、537、538、539或540纳摩尔或其之间的任何值、诸如每剂534.6纳摩尔的量的tau磷酸肽。在另一个实施方案中，有效量的脂质体包含每剂710至720纳摩尔、诸如每剂710、711、712、713、714、715、716、717、718、719或720纳摩尔或其之间的任何值、诸如每剂712.8纳摩尔的量的tau磷酸肽。
14.在某些实施方案中，皮下施用所述脂质体。
15.在某些实施方案中，肌肉内施用所述脂质体。
16.在某些实施方案中，所述方法进一步包括在初始施用后1至24周向所述受试者施用第二剂的有效量的脂质体。
17.在某些实施方案中，所述脂质体进一步包含辅助t
‑
细胞表位和脂化cpg寡核苷酸中的至少一种。在某些实施方案中，所述脂化cpg寡核苷酸具有选自seq id no:18至seq id no:22的核苷酸序列，优选地具有seq id no:18的核苷酸序列，其中所述cpg寡核苷酸具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，且所述cpg寡核苷酸经由接头、优选地经由peg接头与至少一个亲脂基团共价连接。
18.在某些实施方案中，所述脂质体进一步包含一种或多种选自以下的脂质：1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dmpc)、1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰基
‑
3'
‑
外消旋
‑
甘油(dmpg)和胆固醇。
19.在某些实施方案中，所述辅助t
‑
细胞表位包含至少一个选自seq id no:23至seq id no:26的氨基酸序列，优选地包含seq id no:23至25的氨基酸序列。
20.在某些实施方案中，所述toll
‑
样受体4激动剂是单磷酰脂质a (mpla)。
21.在某些实施方案中，有效量的脂质体包含每剂30μg至900μg、优选地100μg至585μg的量的toll
‑
样受体4激动剂。在某些实施方案中，有效量的脂质体包含每剂30μg至900μg、优选地100μg至585μg的量的toll
‑
样受体激动剂3
‑
脱酰基的单磷酰六
‑
酰基脂质a。
22.在某些实施方案中，有效量的脂质体包含每剂25μg至625μg、优选地75μg至450μg的量的辅助t
‑
细胞表位。在某些实施方案中，有效量的脂质体包含每剂25μg至625μg、优选地75μg至450μg的量的由seq id no:13的氨基酸序列组成的t50辅助t
‑
细胞表位。
23.在某些实施方案中，有效量的脂质体包含每剂约2纳摩尔至约110纳摩尔、诸如每剂约4.02纳摩尔至约100.44纳摩尔、或每剂约4纳摩尔至约75纳摩尔、诸如每剂约4.02纳摩尔至约72.32纳摩尔、或每剂约10纳摩尔至约105纳摩尔、诸如每剂约12.06纳摩尔至约100.44纳摩尔、或每剂约70纳摩尔至约105纳摩尔、诸如每剂约72.32纳摩尔至约100.44纳摩尔的量的辅助t
‑
细胞表位。在某些实施方案中，有效量的脂质体包含每剂约3纳摩尔至约105纳摩尔、优选地每剂约10纳摩尔至约105纳摩尔、诸如每剂约12.06纳摩尔至约100.44纳摩尔的量的由seq id no:13的氨基酸序列组成的t50辅助t
‑
细胞表位。在一个实施方案中，有效量的脂质体包含每剂2至5纳摩尔、例如每剂2、3、4或5纳摩尔或其之间的任何值、诸如每剂约3.82、3.92、4.02或4.12纳摩尔的量的辅助t
‑
细胞表位。在另一个实施方案中，有效量的脂质体包含每剂10至15纳摩尔、诸如每剂10、11、12、13、14或15纳摩尔或其之间的任何值、诸如每剂11.86、11.96、12.06或12.16纳摩尔的量的辅助t
‑
细胞表位。在另一个实施方案中，有效量的脂质体包含每剂70至75纳摩尔、诸如每剂70、71、72、73、74或75纳摩尔或其之间的任何值、诸如每剂72.02、72.12、72.22、72.32、72.42纳摩尔的量的辅助t
‑
细胞表位。在又另一个实施方案中，有效量的脂质体包含每剂98至103纳摩尔、诸如每剂98、99、100、101、102或103纳摩尔或其之间的任何值、诸如每剂100.24、100.34、100.44、100.54或100.64纳摩尔的量的辅助t
‑
细胞表位。
24.在某些实施方案中，有效量的脂质体包含每剂50μg至1250μg、优选地150μg至800μg的量的脂化cpg寡核苷酸。在某些实施方案中，有效量的脂质体包含每剂50μg至1250μg、优选地150μg至800μg的量的由seq id no:18的核苷酸序列组成的cpg寡核苷酸。
25.在某些实施方案中，所述脂质体包含：(1)具有seq id no:28的氨基酸序列的tau磷酸肽；(2)包含3
‑
脱酰基的单磷酰六
‑
酰基脂质a的toll
‑
样受体4激动剂；(3)包含seq id no:39的氨基酸序列的辅助t
‑
细胞表位；(4)包含seq id no:18的核苷酸序列的脂化cpg寡核苷酸；和(5)至少一种选自以下的脂质：1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dmpc)、1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰基
‑
3'
‑
外消旋
‑
甘油(dmpg)和胆固醇。
26.在某些实施方案中，所述受试者需要治疗阿尔茨海默氏病，诸如早期阿尔茨海默氏病、由于阿尔茨海默氏病、轻度阿尔茨海默氏病或轻度至中度阿尔茨海默氏病导致的轻度认知损害(mci)。在其他实施方案中，所述受试者在脑中淀粉样蛋白阳性，但尚未显示显著的认知损害。
27.本发明还涉及疫苗组合，其用于在有此需要的人受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件、诸如脑炎，其中所述疫苗组合包含根据本发明的实施方案的引发疫苗和加强疫苗。本发明还提供了疫苗组合在制备药物中的用途，所述药物用于在有此需要的人受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件、诸如脑炎，其中所述疫苗组合包含根据本发明的实施方案的引发疫苗和加强疫苗。如本文所述的关于在人受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件、诸如脑炎的方法的本发明的所有方面和实施方案都可适用于所用的疫苗组合和/或疫苗组合在制备用于在有此需要的人受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件、诸如脑炎的药物中的用途。
28.在阅读本发明的以下详述和权利要求后，将更好地理解本发明的进一步方面、特
征和优点。
29.附图简述当结合附图阅读时，将更好地理解本技术的前述概述以及以下优选实施方案的详述。然而，应理解的是，本发明不限于附图中显示的精确实施方案。
30.图1显示向雌性c57bl/6小鼠每两周一次三次肌肉内施用35和80μg/剂的aci
‑
35.030后的ptau igg滴度；代表每组10只小鼠的几何平均值 95% ci。
31.图2显示1200μg/剂和2400μg/剂的aci
‑
35.030在恒河猴中诱导持续滴度的抗磷酸化tau抗体；代表以au/ml表示的每组抗体滴度的几何平均值，如通过elisa所测量。
32.图3显示2400μg/剂的aci
‑
35.030的三次注射诱导结合ad脑切片上的tau缠结(小图b)而与结肠切片没有交叉反应(小图d)的抗体。预处理样品不结合ad脑切片(小图a)或结肠切片(小图c)。
33.图4显示，与皮下注射相同剂量的相同疫苗相比，肌肉内注射1800μg/剂的aci
‑
35.030诱导抗ephfigg抗体滴度，其中组内变异性较低。
34.发明详述在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献各自均通过引用以其整体并入本文。已经包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、文章等的讨论是为了提供本发明的上下文的目的。这种讨论并不是承认任何或所有这些事项形成关于公开或请求保护的任何发明的现有技术的一部分。
35.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。否则，本文使用的某些术语具有说明书中所阐述的含义。
36.必须注意，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
37.除非另有说明，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的
±
10%。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同样，1%至10%(w/v)的浓度范围包括0.9%(w/v)至11%(w/v)。如本文所用，数值范围的使用明确包括所有可能的子范围、该范围内的所有单独数值，包括此类范围内的整数和值的分数，除非上下文另有明确指示。
38.除非另有指示，一系列要素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明旨在涵盖此类等同方案。
39.如本文所用，将理解术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”或其任何其他变体将被理解为暗示包含规定的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含一系列要素的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的或此类组合物、混合物、过程、方法、制品或设备固有的其他要素。此外，除非有相反的明确说明，否则“或”是指包含性的或，且不是排除性的或。例如，以下中的任一者满足条件a或b：a为真(或存在)且b为假(或不存在)，a为假(或不存在)且b为真(或存在)，且a和b两者均为
真(或存在)。
40.还应当理解，当提及优选发明的组分的尺寸或特征时，本文使用的术语“约”、“近似”、“通常”、“实质上”和类似术语表明所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除与其在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的。至少，包括数值参数的此类指示物将包括使用本领域中接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效数字的变化。
41.本发明提供了诱导有此需要的人受试者中的抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件、诸如脑炎的方法。在具体实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的脂质体，所述脂质体包含呈递于脂质体的表面上的tau磷酸肽和toll
‑
样受体4激动剂。
42.如本文所用，术语“抗磷酸化tau抗体”是指结合tau的抗体，所述tau在tau的氨基酸序列的一个或多个位置处的氨基酸残基上已被磷酸化。磷酸化的氨基酸残基可以是例如丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)或酪氨酸(tyr)。抗磷酸化tau抗体结合的磷酸化tau上的位点优选是在神经退行性疾病、诸如阿尔茨海默氏病中特异性磷酸化的位点。抗磷酸化tau抗体结合的磷酸化tau位点的实例包括，例如，tyr18、ser199、ser202、thr205、thr212、ser214、ser396、ser404、ser409、ser422、thr427。如本技术通篇中所用，氨基酸位置参考具有genbank登录号np_005901.2中代表的氨基酸序列的人微管相关蛋白tau同种型2的序列给出。
43.施用后诱导抗磷酸化tau抗体的能力可以通过测试来自受试者的生物样品(例如，血液、血浆、血清、pbmc、尿液、唾液、粪便、csf或淋巴液)的抗体、例如igg或igm抗体的存在来确定，所述抗体针对药物组合物中施用的免疫原性tau肽(参见例如harlow, 1989, antibodies, cold spring harbor press)。例如，响应于施用提供免疫原的组合物而产生的抗体的滴度可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)、其他基于elisa的测定(例如，msd
‑
meso scale discovery)、斑点印迹、sds
‑
page凝胶、elispot或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)测定进行测量。
44.如本文所用，术语“不良事件”(ae)是指在施用药物产品的患者中发生的任何异常的医学事件，并且不一定与治疗具有因果关系。根据本发明的实施方案，使用以下定义在严重程度渐增的3点量表上对ae进行评级：轻度(1级)，是指受试者容易耐受的ae，其引起最小的不适并且不干扰日常活动；中度(2级)，是指不适足以干扰正常的日常活动并且可能需要干预的ae；重度(3级)，是指阻止正常的日常活动并且通常需要治疗或其他干预的ae。重度ae (sae)可以是在任何剂量下发生的导致任何以下结果的任何ae：死亡，其中死亡是结果，不是事件；危及生命，是指其中事件时患者处于死亡风险中的事件；它不是指如果其更严重可能假设可能引起死亡的事件；在患者住院，即未计划的过夜住院或延长现有住院中；进行正常生活功能的能力的持续或显著丧失或严重中断；先天性异常/出生缺陷；可能危害患者或可能需要医疗或手术干预以预防上面列出的其他结果之一的重要医疗事件(如研究者所认为的)(例如不导致住院的，在急诊室或家中对过敏性支气管痉挛或血液恶液质或抽搐的强化治疗)。住院是正式入院。住院或住院的延长构成ae变得严重的标准；然而，它本身并不被视为sae。在不存在ae的情况下，参与研究者不应将住院或住院延长报告为sae。在以下情况下，可能是这种情况：方案要求的程序需要住院或住院延长；或住院或延长延长是中心遵循的常规程序的一部分(例如手术后移除支架)。这应当记录在研究文件中。对在研究期间
未恶化的先前存在的病况的选择性治疗的住院不被视为ae。
45.在住院期间发生的并发症是ae。如果并发症延长住院，或符合任何其他sae标准，则该事件为sae。
46.如本文所用，术语“脑炎”是指可由感染性和非感染性原因导致的脑部炎症。如本文所用，术语“脑膜脑炎”是指特征在于脑膜和脑的感染或炎症的病况。脑炎或脑膜脑炎的诊断可以根据本公开通过本领域技术人员已知的技术、例如通过临床、神经学和精神病学检查、包括血液和csf采样的生物采样、mri扫描和脑电图(eeg)来确定。
47.如本文所用，术语“脂质体”通常是指由具有高脂质含量的材料、例如磷脂、胆固醇制成的脂质囊泡。这些囊泡的脂质通常以脂质双层的形式组织。脂质双层通常封装这样的体积，所述体积或者散布在脂质双层的多个洋葱状壳之间，形成多层脂质囊泡(mlv)，或者包含在无定形中央空腔内。具有无定形中央空腔的脂质囊泡是单层脂质囊泡，即具有围绕空腔的单个外围双层的那些。大单层囊泡(luv)通常具有100 nm至几微米、诸如100
‑
200 nm或更大的直径，而小单层脂质囊泡(suv)通常具有小于100 nm、诸如20
‑
100 nm、通常15
‑
30 nm的直径。
48.如本文所用，术语“tau”或“tau蛋白”，也称为微管相关蛋白tau、mapt、神经原纤维缠结蛋白、成对螺旋丝
‑
tau、phf
‑
tau、maptl、mtbt1，是指丰富的中枢和外周神经系统蛋白，其具有多种同种型。在人中枢神经系统(cns)中，由于可变剪接，存在大小范围为352至441个氨基酸长的六种主要tau同种型(hanger等人，trends mol med. 15:112
‑
9, 2009)。tau的实例包括但不限于cns中的tau同种型，诸如441个氨基酸的最长tau同种型(4r2n)，也称为微管相关蛋白tau同种型2，其具有四个重复和两个插入片段，诸如具有genbank登录号np_005901.2中代表的氨基酸序列的人tau同种型2。tau的其他实例包括352个氨基酸长的最短(胎儿)同种型(3r0n)，也称为微管相关蛋白tau同种型4，其具有三个重复且没有插入片段，诸如具有genbank登录号np_058525.1中代表的氨基酸序列的人tau同种型4。tau的实例还包括在外周神经中表达的“大tau”同种型，其含有300个额外的残基(外显子4a)。friedhoff等人, biochimica et biophysica acta 1502 (2000) 122
‑
132。tau的实例包括人类大tau，其为由6762个核苷酸长的mrna转录物(nm_016835.4)编码的758个氨基酸长的蛋白或其同种型。例举的人类的大tau的氨基酸序列呈现在genbank登录号np_058519.3中。如本文所用，术语“tau”包括来自除了人以外的物种(诸如食蟹猴(食蟹猴)、恒河猴或黑猩猩(黑猩猩))的tau的同源物。如本文所用，术语“tau”包括包含全长野生型tau的突变、例如点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白。术语“tau”还涵盖tau氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于磷酸化。
49.如本文所用，术语“肽”或“多肽”是指由经由肽键连接的氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。该术语是指任何大小、结构或功能的肽。通常，肽为至少三个氨基酸长。肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或其任何组合。合成肽可以合成，例如，使用自动化多肽合成仪合成。tau肽的实例包括长度约5至约30个氨基酸、优选长度约10至约25个氨基酸、更优选长度约16至约21个氨基酸的tau蛋白的任何肽。在本公开中，使用标准的三字母或一字母氨基酸缩写从n至c末端列出肽，其中磷酸残基用“p”指示。可用于本发明中的tau肽的实例包括但不限于包含seq id no:1
‑
12中任一个的氨基酸序列的tau肽，或具有与seq id no:1
‑
12中任一个的氨基酸序列具有至少
75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列的tau肽。
50.如本文所用，术语“磷酸肽”或“磷酸表位”是指在一个或多个氨基酸残基处磷酸化的肽。tau磷酸肽的实例包括包含一个或多个磷酸化氨基酸残基的任何tau肽。
51.本发明的tau肽可以通过固相肽合成或通过重组表达系统合成。自动化肽合成仪可商购自许多供应商，诸如applied biosystems (foster city, ca)。重组表达系统可以包括细菌，诸如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。重组表达的程序由sambrook等人, molecular cloning: a laboratory manual (c.s.h.p. press, ny 第2版, 1989)描述。
52.根据具体实施方案，脂质体包含一种或多种tau肽。根据具体实施方案，脂质体中的tau肽可以相同或不同。鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何合适的tau肽均可用于本发明中。根据具体实施方案，所述tau肽中的一种或多种包含seq id no:1
‑
12之一的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述tau肽中的一种或多种包含与seq id no:1
‑
12之一的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列，其中氨基酸残基无一被磷酸化，或者一个或多个氨基酸残基被磷酸化。
53.根据具体实施方案，所述tau肽中的一种或多种是tau磷酸肽。根据具体实施方案，一种或多种tau磷酸肽包含seq id no:1
‑
3或5
‑
12之一的氨基酸序列，或与seq id no:1
‑
3或5
‑
12之一的氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列，其中指定的氨基酸残基中的一个或多个被磷酸化。优选地，所述tau磷酸肽包含seq id no:1
‑
3之一的氨基酸序列。所述tau肽可以具有酰胺化的c
‑
末端。
54.根据本技术的实施方案，tau肽呈递在脂质体的表面上。鉴于本公开内容，可以使用本领域已知的方法将tau肽、优选地tau磷酸肽呈递在脂质体的表面上。参见，例如，美国专利号8,647,631和9,687,447以及国际专利申请号pct/us18/57286中的相关公开内容，其内容通过引用并入本文。根据具体实施方案，一种或多种tau肽，包括磷酸肽，进一步包含一种或多种修饰，诸如棕榈酰化或十二烷基修饰，以允许tau肽呈递在脂质体的表面上。额外的氨基酸残基，诸如lys、cys或有时ser或thr，可以添加至tau肽以促进修饰。据报道，脂质锚的位置诱导肽序列的不同构象(hickman等人, j. biol. chem. vol. 286, no. 16, pp. 13966
–
13976, april 22, 2011)。不希望受理论束缚，据信在两个末端添加疏水部分可增加tau肽的病理性β
‑
折叠构象。因此，一种或多种tau肽在两个末端进一步包含疏水部分。修饰的tau肽可以具有酰胺化的c
‑
末端。优选地，呈递在脂质体的表面上的tau肽由seq id no:27至seq id no:38之一的氨基酸序列组成。
55.可用于本发明的tau脂质体的实例包括但不限于美国专利号8,647,631和9,687,447以及国际专利申请号pct/us18/57286(各自的公开内容以其整体并入本文)中描述的tau脂质体。
56.如本文所用，术语“有效量”是指在受试者中引发期望的生物学或医学应答的活性成分或组分的量。特定有效剂量的选择可由本领域技术人员基于几种因素的考虑来确定(例如，经由临床试验)，所述因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态和技术人员已知的其他因素。制剂中采用的精确剂量还将取决于施用模式、施用途径、靶部位、患者的生理状态、施用的其他药物和疾病的严重程度，并且应根据实施者的判断和和每个病人的情况来决定。例如，tau磷酸肽的有效量还取决于是否还施用佐
剂，其中在不存在佐剂的情况下需要更高的剂量。有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量
‑
应答曲线外推。
57.根据本技术的实施方案，有效量的脂质体包含足以增加抗磷酸化tau抗体的水平而不诱导严重不良事件、诸如脑炎的量的tau磷酸肽。在具体实施方案中，有效量的脂质体包含每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔、诸如每剂约29.7纳摩尔至约742.5纳摩尔、优选地每剂约90纳摩尔至约715纳摩尔、诸如每剂约89.1纳摩尔至约712.8纳摩尔、或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔、诸如每剂约89.1纳摩尔至约534.6纳摩尔、或每剂约90纳摩尔至约275纳摩尔、诸如每剂约89.1纳摩尔至约267.3纳摩尔的量的tau磷酸肽。施用的tau磷酸肽的量也可以通过重量表示。例如，每剂29.7纳摩尔对应于每剂100
µ
g的由seq id no:28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化tau磷酸肽，每剂742.5纳摩尔对应于每剂2500
ꢀµ
g的由seq id no:28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化tau磷酸肽，每剂89.1纳摩尔对应于每剂300
ꢀµ
g的由seq id no:28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化tau磷酸肽，每剂712.8纳摩尔对应于每剂2400
ꢀµ
g的由seq id no:28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化tau磷酸肽，且每剂534.6纳摩尔对应于每剂1800
ꢀµ
g的由seq id no:28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化tau磷酸肽。四棕榈酰化tau磷酸肽具有四个允许tau磷酸肽呈递在脂质体的表面上的脂质链。300、900、1800
µ
g的剂量的由seq id no:28的氨基酸序列组成的四棕榈酰化tau磷酸肽分别对应于169、508、1016
µ
g的没有任何脂质链的对应“裸”肽。
58.根据本技术的实施方案，有效量的脂质体包含每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔的量的tau磷酸肽，诸如每剂约25纳摩尔、约30纳摩尔、约35纳摩尔、约40纳摩尔、约45纳摩尔、约50纳摩尔、约55纳摩尔、约60纳摩尔、约65纳摩尔、约70纳摩尔、约75纳摩尔、约80纳摩尔、约85纳摩尔、约90纳摩尔、约95纳摩尔、约100纳摩尔、约125纳摩尔、约150纳摩尔、约175纳摩尔、约200纳摩尔、约225纳摩尔、约250纳摩尔、约275纳摩尔、约300纳摩尔、约325纳摩尔、约350纳摩尔、约375纳摩尔、约400纳摩尔、约425纳摩尔、约450纳摩尔、约475纳摩尔、约500纳摩尔、约525纳摩尔、约550纳摩尔、约575纳摩尔、约600纳摩尔、约625纳摩尔、约650纳摩尔、约675纳摩尔、约700纳摩尔、约725纳摩尔、约750纳摩尔的包含seq id no:1
‑
3或5
‑
12之一的氨基酸序列的tau磷酸肽。优选地，所述tau磷酸肽由seq id no:27至seq id no:38之一的氨基酸序列组成。更优选地，所述tau磷酸肽由seq id no:28的氨基酸序列组成。
59.根据本技术的实施方案，有效量的脂质体包含每剂100μg至2500μg、300μg至2400μg、300μg至1800μg或300μg至900μg、诸如每剂100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg、1100μg、1200μg、1300μg、1400μg、1500μg、1600μg、1700μg、1800μg、1900μg、2000μg、2100μg、2200μg、2300μg、2400μg或2500μg的量的四棕榈酰化tau磷酸肽。
60.根据本技术的实施方案，所述tau磷酸肽呈递于脂质体的表面上。根据本技术的实施方案，所述tau磷酸肽包含seq id no:1
‑
3或5
‑
12之一的氨基酸序列。优选地，所述tau磷酸肽由seq id no:27至seq id no:38之一的氨基酸序列组成。更优选地，所述tau磷酸肽由seq id no:28的氨基酸序列组成。
61.根据本技术的其他实施方案，有效量的脂质体进一步包含每剂30μg至900μg、优选地100μg至585μg的量的toll
‑
样受体4激动剂。例如，有效量的脂质体可以包含每剂30μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、330μg、360μg、390μg、420μg、450μg、480μg、500μg、
520μg、540μg、560μg、580μg、600μg、700μg、800μg或900μg的量的toll
‑
样受体4激动剂。
62.根据本技术的实施方案，所述toll
‑
样受体4包含3d
‑
(6
‑
酰基) phad
®
。
63.根据本技术的其他实施方案，有效量的脂质体进一步包含每剂25μg至625μg、优选地75μg至450μg的量的辅助t
‑
细胞表位。例如，有效量的脂质体可以包含每剂25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、425μg、450μg、475μg、500μg、525μg、550μg、575μg、600
ꢀµ
g或625μg的量的辅助t
‑
细胞表位。
64.根据本技术的其他实施方案，有效量的脂质体进一步包含每剂约3纳摩尔至约105纳摩尔、诸如每剂约4纳摩尔、约5纳摩尔、约6纳摩尔、约7纳摩尔、约8纳摩尔、约9纳摩尔、约10纳摩尔、约15纳摩尔、约20纳摩尔、约25纳摩尔、约30纳摩尔、约35纳摩尔、约40纳摩尔、约45纳摩尔、约50纳摩尔、约55纳摩尔、约60纳摩尔、约65纳摩尔、约70纳摩尔、约75纳摩尔、约80纳摩尔、约85纳摩尔、约90纳摩尔、约95纳摩尔、约100纳摩尔或约105纳摩尔的量的辅助t
‑
细胞表位。
65.根据本技术的实施方案，所述辅助t
‑
细胞表位是由seq id no:13的氨基酸序列组成的t50辅助t
‑
细胞表位，由seq id no:14的氨基酸序列组成的t46辅助t
‑
细胞表位，由seq id no:15的氨基酸序列组成的t48辅助t
‑
细胞表位，由seq id no:16的氨基酸序列组成的t51辅助t
‑
细胞表位，或由seq id no:17的氨基酸序列组成的t52辅助t
‑
细胞表位，优选地所述辅助t
‑
细胞表位是由seq id no:13的氨基酸序列组成的t50辅助t
‑
细胞表位。
66.在某些实施方案中，有效量的脂质体进一步包含每剂50μg至1250μg、优选地150μg至800μg的量的脂化cpg寡核苷酸。例如，有效量的脂质体可以包含每剂50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg、1050μg、1100μg、1200μg或1250μg的量的脂化cpg寡核苷酸。
67.根据本技术的实施方案，所述脂化cpg寡核苷酸是包含seq id no:18
‑
22之一的核苷酸序列的cpg寡核苷酸，优选地，所述脂化cpg寡核苷酸是包含seq id no:18的核苷酸序列的cpg寡核苷酸。根据本技术的实施方案，所述脂化cpg寡核苷酸是包含seq id no:18的核苷酸序列的cpg寡核苷酸，其具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键并经由包含聚乙二醇(peg)的接头与胆固醇共价连接。
68.根据实施方案，有效量的脂质体包含每剂50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg、1050μg、1100μg、1200μg或1250μg的经由peg接头与胆固醇共价连接的cpg寡核苷酸。
69.根据具体实施方案，所述人受试者需要神经退行性疾病、病症或病况的治疗。
70.如本文所用，“神经退行性疾病、病症或病况”包括本领域技术人员鉴于本公开内容已知的任何神经退行性疾病、病症或病况。神经退行性疾病、病症或病况的实例包括由神经原纤维病变的形成引起或与之相关的神经退行性疾病或病症，诸如tau
‑
相关疾病、病症或病况，称为tau蛋白病变。根据具体实施方案，所述神经退行性疾病、病症或病况包括显示tau和淀粉样蛋白病理的共存的任何疾病或病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、克
‑
雅二氏病、拳击手痴呆症、唐氏综合征、gerstmann
‑
str
ä
ussler
‑
scheinker病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化症、关岛帕金森病
‑
痴
呆复合症、非关岛运动神经元病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性、痴呆路易氏肌萎缩侧索硬化症、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、额颞叶痴呆、优选具有与染色体17相关的帕金森综合征的额颞叶痴呆(ftdp
‑
17)、额颞叶痴呆、hallevorden
‑
spatz病、多系统萎缩、niemann
‑
pick病c型、pick病、进行性皮质下神经胶质过多症、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆、脑炎后帕金森病、肌强直性营养不良、慢性创伤性脑病(cte)、原发性年龄相关的tau蛋白病(part)、脑血管病或路易体痴呆(lbd)。根据具体实施方案，神经退行性疾病、病症或病况是阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病。根据优选的实施方案，神经退行性疾病、病症或病况是阿尔茨海默氏病。
71.阿尔茨海默氏病的临床过程可分为数个阶段，具有进行性模式的认知和功能损害。可以使用本领域已知的分级标度来定义阶段，包括例如nia
‑
aa研究框架。参见，例如dubois等人, alzheimer’s & dementia 12 (2016) 292
‑
323, dubois等人, lancet neurol 2014; 13: 614
–
29, jack等人, alzheimer’s & dementia 14 (2018) 535
‑
562，其各自的内容通过引用以其整体并入本文。
72.根据优选实施方案，所述神经退行性疾病、病症或病况是早期阿尔茨海默氏病、由于阿尔茨海默氏病、轻度阿尔茨海默氏病或轻度至中度阿尔茨海默氏病导致的轻度认知损害(mci)。
73.在一些实施方案中，需要治疗的受试者在脑中是淀粉样蛋白阳性的但尚未显示显著的认知损害。可以使用本领域已知的方法检测脑中的淀粉样蛋白沉积，诸如pet扫描、免疫沉淀质谱法或其他方法。
74.如本文所用，术语“toll
‑
样受体”或“tlr”是指在先天免疫应答中起关键作用的一类模式识别受体(prr)蛋白。tlr识别来自微生物病原体(诸如细菌、真菌、寄生虫和病毒)的病原体相关分子模式(pamp)，可将其与宿主分子区分开。tlr是跨膜蛋白，其通常作为二聚体发挥功能，并且由参与先天免疫应答的细胞(包括抗原呈递树突细胞和吞噬性巨噬细胞)表达。存在至少十个人类tlr家族成员，tlr1至tlr10，以及至少十二个鼠类tlr家族成员，tlr1至tlr9和tlr11至tlr13，并且它们的不同在于它们识别的抗原的类型。例如，tlr4识别脂多糖(lps，许多革兰氏阴性细菌中存在的组分)，以及病毒蛋白、多糖和内源性蛋白，诸如低密度脂蛋白、β
‑
防御素和热休克蛋白；且tlr9是一种核苷酸感应性tlr，其被未甲基化的胞嘧啶
‑
磷酸
‑
鸟嘌呤(cpg)单链或双链二核苷酸激活，其在原核基因组中很丰富，但在脊椎动物基因组中少见。tlr的激活导致一系列信号传导事件，导致i型干扰素(ifn)、炎性细胞因子和趋化因子的产生，以及免疫应答的诱导。最终，这种炎症还激活适应性免疫系统，其然后导致入侵的病原体和受感染的细胞的清除。
75.如本文所用，术语“激动剂”是指结合一种或多种tlr并诱导受体介导的应答的分子。例如，激动剂可以诱导、刺激、增加、激活、促进、增强或上调受体的活性。该活性被称为“激动性活性”。例如，tlr4或tlr9激动剂可以通过结合受体激活或增加细胞信号传导。激动剂包括但不限于核酸、小分子、蛋白、碳水化合物、脂质或与受体结合或相互作用的任何其他分子。激动剂可以模拟天然受体配体的活性。激动剂在序列、构象、电荷或其他特征方面可以与这些天然受体配体同源，使得它们可以被受体识别。这种识别可以导致细胞内的生理和/或生物化学变化，使得细胞以与天然受体配体存在时相同的方式对激动剂的存在作出反应。根据具体实施方案，toll
‑
样受体激动剂是toll
‑
样受体4激动剂和toll
‑
样受体9激
动剂中的至少一种。
76.如本文所用，术语“诱导”和“刺激”及其变体是指细胞活性的任何可测量的增加。免疫应答的诱导可以包括，例如，免疫细胞群体的活化、增殖或成熟，增加细胞因子的产生和/或增加免疫功能的另一个指标。在某些实施方案中，免疫应答的诱导可以包括增加b细胞的增殖、产生抗原特异性抗体、增加抗原特异性t
‑
细胞的增殖、改善树突细胞抗原呈递和/或增加某些细胞因子、趋化因子和共刺激标志物的表达。
77.如本文所用，术语“toll
‑
样受体4激动剂”是指充当tlr4的激动剂的任何化合物。鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何合适的toll
‑
样受体4激动剂均可用于本发明中。可用于本发明的toll
‑
样受体4配体的实例包括tlr4激动剂，包括但不限于单磷酰脂质a (mpla)。如本文所用，术语“单磷酰脂质a”或“mpla”是指脂质a的修饰形式，其是革兰氏阴性细菌脂多糖(lps)内毒素的生物活性部分。mpla的毒性低于lps，同时维持免疫刺激活性。作为疫苗佐剂，mpla刺激对疫苗抗原的细胞和体液应答。mpla的实例包括但不限于3
‑
o
‑
脱酰基
‑
4'
‑
单磷酰脂质a、3
‑
脱酰基的单磷酰六
‑
酰基脂质a (合成的)(也称为3d
‑
(6
‑
酰基)phad
®
)、单磷酰3
‑
脱酰基脂质a及其结构相关的变体。可用于本发明的mpla可使用本领域已知的方法或从商业来源获得，诸如来自avanti polar lipids (alabaster, alabama, usa)的3d
‑
(6
‑
酰基) phad
®
、phad
®
、phad
®‑
504、3d
‑
phad
®
或来自各种商业来源的mpl
tm
。根据具体实施方案，所述toll
‑
样受体4激动剂是mpla。根据具体实施方案，包含tau磷酸肽和toll
‑
样受体4激动剂的脂质体还包含能够结合大多数或所有hla dr(人白细胞抗原
‑
抗原d相关)分子的辅助t
‑
细胞表位。然后辅助t
‑
细胞表位能够激活cd4
t
‑
细胞并向tau
‑
特异性b
‑
细胞提供必要的成熟和存活信号。所述tau脂质体可用于在同源或异源免疫方案中生成针对ptau抗原的高质量抗体，其中脂质体用于引发和/或加强中。
78.如本文所用，术语“辅助t
‑
细胞表位”是指包含能够被辅助t
‑
细胞识别的表位的多肽。辅助t
‑
细胞表位的实例包括但不限于破伤风类毒素(例如p2和p30表位，也分别称为t2和t30)、乙型肝炎表面抗原、霍乱毒素b、类毒素、白喉类毒素、麻疹病毒f蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、恶性疟原虫环子孢子t、恶性疟原虫cs抗原、曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶、百日咳博德特氏菌、破伤风梭状芽孢杆菌、粗果鸡皮衣(pertusaria trachythallina)、大肠杆菌trat和流感病毒血凝素(ha)。
79.鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何合适的辅助t
‑
细胞表位均可用于本发明中。根据具体实施方案，辅助t
‑
细胞表位包含至少一种选自seq id no:23至seq id no:26的氨基酸序列。优选地，辅助t
‑
细胞表位包含经由接头(诸如包含一个或多个氨基酸，例如val (v)、ala (a)、arg (r)、gly (g)、ser (s)、lys (k)的肽接头)融合在一起的seq id no:23至seq id no:26的氨基酸序列中的两个或更多个。接头的长度可以变化，优选地1
‑
5个氨基酸。优选地，所述辅助t
‑
细胞表位包含经由一个或多个选自vvr、gs、rr、rk的接头融合在一起的seq id no:23至seq id no:26的氨基酸序列中的三个或更多个。所述辅助t
‑
细胞表位的c
‑
末端可以被酰胺化。
80.根据本技术的实施方案，所述辅助t
‑
细胞表位可以并入至脂质体表面上，例如，由共价结合的疏水部分锚定，其中所述疏水部分是烷基、脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、类固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，特别是烷基或脂肪酸，特别是具有至少3个碳原子、特别是至少4个碳原子、特别是至少6个碳原子、特别是至少8个碳原子、特别是至少12个碳原子、特别是至少
16个碳原子的碳主链。在本发明的一个实施方案中，所述疏水部分是棕榈酸。或者，所述辅助t
‑
细胞表位可以被封装在脂质体中。根据具体实施方案，所述辅助t
‑
细胞表位被封装在脂质体中。
81.鉴于本公开内容，可以使用本领域已知的方法针对其在脂质体中的期望位置来修饰辅助t
‑
细胞表位。根据具体实施方案，可用于本发明的辅助t
‑
细胞表位包含seq id no:39至seq id no:44之一的氨基酸序列。优选地，所述辅助t
‑
细胞表位由选自seq id no:13至seq id no:17的氨基酸序列组成。
82.根据具体实施方案，包含tau磷酸肽和toll
‑
样受体4激动剂的脂质体还包含toll
‑
样受体9激动剂。如本文所用，术语“toll
‑
样受体9激动剂”是指充当tlr9的激动剂的任何化合物。鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何合适的toll
‑
样受体9激动剂均可用于本发明中。可用于本发明的toll
‑
样受体9配体的实例包括tlr9激动剂，包括但不限于cpg寡核苷酸。
83.如本文所用，术语“cpg寡核苷酸”、“cpg寡脱氧核苷酸”或“cpg odn”是指包含至少一个cpg基序的寡核苷酸。如本文所用，“寡核苷酸”、“寡脱氧核苷酸”或“odn”是指由多个连接的核苷酸单元形成的多核苷酸。此类寡核苷酸可以从现有核酸来源获得或可通过合成方法产生。如本文所用，术语“cpg基序”是指含有通过磷酸酯键或磷酸二酯骨架或其他核苷酸间键连接的未甲基化的胞嘧啶
‑
磷酸酯
‑
鸟嘌呤(cpg)二核苷酸(即，胞嘧啶(c)和随后的鸟嘌呤(g))的核苷酸序列。
84.根据具体实施方案，cpg寡核苷酸是脂化的，即缀合(共价连接)至脂质部分。
85.如本文所用，“脂质部分”是指包含亲脂结构的部分。脂质部分，诸如烷基、脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、类固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，特别是甾醇，诸如胆固醇或脂肪酸，当与高度亲水的分子(诸如核酸)连接时，可以实质上增强血浆蛋白结合，且因此增强亲水性分子的循环半衰期。此外，与某些血浆蛋白(诸如脂蛋白)的结合已被显示增加表达对应脂蛋白受体(例如，ldl受体、hdl受体或清道夫受体sr
‑
b1)的特定组织中的摄取。具体而言，与磷酸肽和/或cpg寡核苷酸缀合的脂质部分允许经由疏水部分将所述肽和/或寡核苷酸锚定至脂质体的膜中。
86.根据具体实施方案，鉴于本公开内容，cpg寡核苷酸可以包含任何合适的核苷酸间键。
87.如本文所用，术语“核苷酸间键”是指通过其由磷原子和相邻核苷之间的带电或中性基团组成的糖连接两个核苷酸的化学键。核苷酸间键的实例包括磷酸二酯(po)、硫代磷酸酯(ps)、二硫代磷酸酯(ps2)、甲基膦酸酯(mp)和甲基硫代磷酸酯(rp)。硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和甲基硫代磷酸酯稳定核苷酸间键，而磷酸二酯是天然存在的核苷酸间键。寡核苷酸硫代磷酸酯通常合成为rp和sp硫代磷酸酯键的随机外消旋混合物。
88.鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何合适的cpg寡核苷酸均可用于本发明中。此类cpg寡核苷酸的实例包括但不限于cpg2006 (也称为cpg7909) (seq id no:18)、cpg 1018 (seq id no:19)、cpg2395 (seq id no:20)、cpg2216 (seq id no:21)或cpg2336(seq id no:22)。
89.鉴于本公开内容，可以使用本领域已知的方法脂化cpg寡核苷酸。在一些实施方案中，cpg寡核苷酸与胆固醇分子直接共价连接。在一些实施方案中，cpg寡核苷酸的3'末端通
过磷酸酯键、任选地经由peg接头与胆固醇分子共价连接。在一些实施方案中，cpg寡核苷酸的5’末端通过磷酸酯键、任选地经由peg接头与胆固醇分子共价连接。其他亲脂性部分也可以与cpg寡核苷酸的5'或3'末端共价连接。例如，cpg寡核苷酸可以任选地经由peg接头和与来自脂质体的磷脂长度相同的脂质锚共价连接：一条棕榈酸链(使用pal
‑
oh或类似物，激活用于偶联)或两个棕榈酸(例如，使用1,2
‑
二棕榈酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺
‑
n
‑
(琥珀酰基)或类似物，激活用于偶联)。参见，例如，美国专利号7,741,297(其内容通过引用并入本文)中的相关公开内容。peg的长度可以从例如1至5个peg单元变化。
90.其他接头也可用于将cpg寡核苷酸共价连接至亲脂性部分(诸如胆固醇分子)，其实例包括但不限于具有3至12个碳的烷基间隔基。需要与寡核苷酸化学相容的短接头作为氨基二醇。在一些实施方案中，没有接头用于共价键合。参见，例如,
ꢀ“
convenient synthesis and application of versatile nucleic acid lipid membrane anchors in the assembly and fusion of liposomes, org. biomol. chem., 2015, 13, 9673，其相关公开内容通过引用并入本文。
91.根据具体实施方案，可用于本发明的脂化cpg寡核苷酸包含选自seq id no:18至seq id no:22的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，且所述核苷酸序列经由接头与至少一种胆固醇共价连接。根据优选的实施方案，脂化cpg寡核苷酸包含seq id no:18的核苷酸序列，具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且与胆固醇共价连接。可以使用任何合适的接头将cpg寡核苷酸与胆固醇分子共价连接。优选地，所述接头包含聚乙二醇(peg)。
92.根据具体实施方案，所述脂质体进一步包含一种或多种选自以下的脂质：1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dmpc)、1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰基
‑
3'
‑
外消旋
‑
甘油(dmpg)和胆固醇。
93.根据具体实施方案，所述脂质体进一步包含缓冲液。鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何合适的缓冲液均可用于本发明中。在一个实施方案中，所述脂质体包含磷酸盐缓冲盐水。根据具体实施方案，所述缓冲液包含组氨酸和蔗糖。
94.本发明中使用的示例性脂质体包含tau四棕榈酰化磷酸肽(ptau肽t3，seq id no:28)，其经由在tau肽的每个末端的两个棕榈酸呈递在脂质体的表面上；tlr
‑
9配体，其包含经由胆固醇分子并入脂质体膜的脂化cpg (佐剂cpg7909
‑
chol；seq id no:18)，所述胆固醇分子经由peg接头与cpg共价连接；并入膜中的tlr
‑
4配体(单磷酰脂质a(例如，3d
‑
(6
‑
酰基)phad
®
))；封装的辅助t
‑
细胞表位(pan
‑
dr结合剂t50；seq id no:13)；和1,2
‑
二肉豆蔻酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸
‑
胆碱(dmpc)、1,2
‑
二肉豆蔻酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
[磷酸
‑
外消旋
‑
(1
‑
甘油)]钠盐(dmpg)和胆固醇作为脂质体的脂质组分。
[0095]
鉴于本公开内容，可以使用本领域已知的方法制备本发明的脂质体。鉴于本公开内容，可以通过本领域技术人员已知的技术来确定脂质体的每种组分的最佳比率。
[0096]
脂质体可以通过合适的方式施用以进行预防和/或治疗性处理。根据优选的实施方案，脂质体通过皮下或肌肉内注射进行施用。肌肉内注射最通常在手臂或腿部肌肉中进行。
[0097]
在一个一般方面，本发明涉及包含治疗有效量的脂质体连同药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。药学上可接受的赋形剂和/或载体是本领域众所周知的(参见
remington’s pharmaceutical science (第15版), mack publishing company, easton, pa., 1980)。药物组合物的优选制剂取决于预期的施用模式和治疗应用。所述组合物可以包括药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以不影响组合的生物学活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外，所述药物组合物或制剂还可以包括其他载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等。应当理解，所述载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于用于特定应用的施用途径。
[0098]
疫苗的靶抗原位于脑中，并且脑通过称为血
‑
脑屏障(bbb)的特有细胞结构与循环分离。bbb限制物质从循环穿入脑中。这防止毒素、微生物等进入中枢神经系统。bbb还具有阻止免疫介体(诸如抗体)有效进入围绕脑的间质和脑脊液的潜在不太期望的作用。
[0099]
近似0.1%存在于全身循环中的抗体穿过bbb并进入脑。这表明由靶向cns抗原的疫苗诱导的全身滴度必须比在脑中有效的最小有效滴度高至少1000倍。触发效力所需的血清中抗体的最低滴度并不明显。此外，对于靶向cns病症(诸如神经退行性疾病、病症或病况)的安全且有效的免疫疗法不仅必须考虑免疫应答的数量，而且还必须考虑免疫应答的质量(例如亲合力)。
[0100]
根据具体实施方案，本发明的药物组合物因此进一步包含一种或多种合适的佐剂以在受试者中实现期望的免疫应答。合适的佐剂可以在施用脂质体之前、之后或同时进行施用。优选的佐剂增强对免疫原的固有应答而不引起影响应答的定性形式的免疫原的构象变化。佐剂的实例是铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。此类佐剂可以与或不与其他特定免疫刺激剂一起使用，所述免疫刺激剂诸如mpla类别(3脱
‑
o
‑
酰化单磷酰脂质a (mpl
tm
)、合成的3
‑
脱酰基的单磷酰六
‑
酰基脂质a (3d
‑
(6
‑
酰基)phad
®
、phad
™
、phad
®‑
504、3d
‑
phad
®
)脂质a)、聚合或单体氨基酸，诸如聚谷氨酸或聚赖氨酸。此类佐剂可以与或不与其他特定免疫刺激剂一起使用，所述免疫刺激剂诸如胞壁酰肽(例如，n
‑
乙酰胞壁酰
‑
l
‑
苏氨酰
‑
d
‑
异谷氨酰胺(thr
‑
mdp)、n
‑
乙酰基
‑
正胞壁酰
‑
l
‑
丙氨酰
‑
d
‑
异谷氨酰胺(nor
‑
mdp)、n
‑
乙酰胞壁酰
‑
l
‑
丙氨酰
‑
d
‑
异谷氨酰胺酰
‑
l
‑
丙氨酸
‑2‑
(1'
‑
2'二棕榈酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
羟基磷酰氧基)
‑
乙胺(mtp
‑
pe)、n
‑
乙酰氨基葡萄糖
‑
n
‑
乙酰胞壁酰
‑
l
‑
al
‑
d
‑
异谷氨酸
‑
l
‑
ala
‑
二棕榈氧基丙基酰胺(dtp
‑
dpp) theramide
™
)或其他细菌细胞壁组分。水包油乳液包括mf59 (参见wo90/14837)，其含有5%角鲨烯、0.5% tween 80和0.5% span 85(任选地含有各种量的mtp
‑
pe)，其使用微流化器配制成亚微米颗粒；saf，含有10%角鲨烯、0.4% tween 80、5%普朗尼克
‑
封闭的聚合物l121和thr
‑
mdp，其被微流化为亚微米乳液或涡旋以生成更大粒径的乳液；和ribi
™
佐剂系统(ras) (ribi immunochem, hamilton, mont.) 0.2% tween 80和一种或多种选自单磷酰脂质a (mpl
tm
)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)和细胞壁骨架(cws)的细菌细胞壁组分，优选mpl
tm
cws (detox
™
)。其他佐剂包括完全弗氏佐剂(cfa)和细胞因子，诸如白介素(il
‑
1、il
‑
2和il
‑
12)、巨噬细胞集落刺激因子(m
‑
csf)和肿瘤坏死因子(tnf)。
[0101]
如本文所用，在向受试者施用两种或更多种疗法的上下文中，术语“组合”是指使用多于一种疗法。术语“组合”的使用不限制对受试者施用疗法的顺序。例如，可以在向受试者施用第二疗法之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12
周)、同时或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一疗法(例如，本文所述的组合物)。
[0102]
施用的时机可以从每天一次、到每年一次、到每十年一次显著变化。典型的方案由以下组成：免疫，随后以时间间隔(诸如1至24周间隔)进行加强注射。另一种方案由以下组成：免疫，随后在1、2、4、6、8、10和12个月后进行加强注射。另一种方案需要终生每两个月注射一次。或者，如通过监测免疫应答所指示，加强注射可以是不定期的。
[0103]
本领域技术人员容易理解，可以基于施用后测量的免疫应答来调整引发和加强施用的方案。例如，加强组合物通常在施用引发组合物后数周或数月(例如约1周、或2周、或3周、或4周、或8周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周、或36周、或40周、或44周、或48周、或52周、或56周、或60周、或64周、或68周、或72周、或76周)或在施用引发组合物后一至两年进行施用。
[0104]
根据具体方面，可以施用一种或多种加强免疫。分别的初免和加强组合物中的抗原，无论采用多少加强组合物，不必相同，而应共享抗原决定簇或与彼此实质上相似。
[0105]
鉴于本公开内容，本发明的药物组合物可以根据本领域已知的方法配制。鉴于本公开内容，可以通过本领域技术人员已知的技术确定组合物中各组分的最佳比率。
[0106]
在本发明的一个优选实施方案中，经由施用根据本发明的一个实施方案的药物组合物，施用tau肽诱导受试者中对tau肽和tau的病理形式的活性免疫应答，由此促进相关tau聚集体的清除，减慢tau病理学相关行为的进展和/或治疗潜在的tau病变。
[0107]
tau是人类“自身”蛋白。这意味着，原则上，所有携带tau特异性受体的淋巴细胞都应当在发育期间被删除(中枢耐受)或被外周耐受机制导致无应答。该问题已证明是开发针对自身或“改变的自身”蛋白(例如肿瘤抗原)的疫苗的重大障碍。生成针对抗原(自身或感染性)的高质量抗体不仅需要产生抗体的b淋巴细胞的作用，而且还需要cd4
t“辅助”淋巴细胞的作用。cd4
t
‑
细胞为b淋巴细胞提供了关键的存活和成熟信号，并且cd4
t
‑
细胞缺陷的动物受到显著的免疫抑制。cd4
t
‑
细胞也受耐受机制的影响，并且生成强烈的抗自身(例如抗tau)抗体应答的额外障碍是tau反应性cd4
t
‑
细胞也可能在人类/动物库中很少或不存在。
[0108]
根据本发明的该方面，免疫应答涉及发展针对tau肽的有益体液(抗体介导的)应答和针对t
‑
细胞表位或免疫原性载体的细胞(由抗原特异性t
‑
细胞或其分泌产物介导)应答。
[0109]
如本文所用，tau
‑
病理学相关的行为表型包括但不限于认知损害、早期人格改变和去抑制、冷漠、意志力丧失、缄默、失用症、持续症、刻板的运动/行为、口齿不清、混乱、不能计划或组织连续任务、自私/冷酷、反社会特征、缺乏同理心、犹豫不决、语法失能与经常转述错误但相对保留的理解力、理解力受损和找词缺陷、缓慢进行性步态不稳、后退、僵硬、频繁跌倒、非左旋多巴反应性轴向强直、核上性凝视麻痹、方波抽搐、缓慢的垂直扫视、假性延髓麻痹、肢体失用、肌张力障碍、皮质感觉丧失和震颤。
[0110]
在实施本发明的方法时，根据本发明的具体实施方案，优选选择具有阿尔茨海默氏病或其他tau病变或处于具有阿尔茨海默氏病或其他tau病变的风险中的受试者、在脑中具有tau聚集体的受试者，或在施用本发明的免疫原性肽或抗体之前表现出缠结相关行为
表型的受试者。适合于治疗的受试者包括处于疾病的风险中但未显示症状的个体，以及目前显示症状的患者。在阿尔茨海默氏病的情况下，几乎任何人都处于患有阿尔茨海默氏病的风险中。因此，本方法可以预防性地施用于一般群体而无需对受试者患者的风险进行任何评价。本方法对具有阿尔茨海默氏病的已知遗传风险的个体特别有用。此类个体包括具有已经经历该疾病的亲戚的那些，以及其风险通过遗传或生物化学标志物分析确定的那些。在优选的实施方案中，所述受试者需要治疗阿尔茨海默氏病，优选早期阿尔茨海默氏病、由于阿尔茨海默氏病、轻度阿尔茨海默氏病或轻度至中度阿尔茨海默氏病导致的轻度认知损害(mci)。
[0111]
在无症状患者中，治疗可以在任何年龄(例如，10、20、30岁)开始。然而，通常直到患者达到40、50、60或70岁才必要开始治疗。治疗通常需要在一段时间内多次给药。治疗可以通过随时间测定抗体、或活化的t
‑
细胞或b
‑
细胞对治疗剂的应答来监测。如果应答降低，则指示加强剂量。
[0112]
在预防性应用中，将含有tau肽的药物组合物以足以消除或降低风险、减轻严重程度或延迟阿尔茨海默氏病或其他tau病变的开始(包括该疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在该疾病发展期间呈现的中间病理表型)的量施用于易患该疾病或以其他方式处于该疾病的风险中的患者。在治疗性应用中，将含有tau肽的药物组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病的症状(生物化学、组织学和/或行为)(包括其并发症和疾病发展中的中间病理表型)的量施用于怀疑患有或已经患有这种疾病的患者。
[0113]
如果期望，所述组合物可以呈现于试剂盒、包装或分配器中，所述试剂盒、包装或分配器可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，所述试剂盒可以包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。所述试剂盒、包装或分配器可以附有施用说明书。
[0114]
实施方案本发明还提供了以下非限制性实施方案。
[0115]
实施方案1是在有此需要的受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含tau磷酸肽和toll
‑
样受体4激动剂的脂质体，所述tau磷酸肽包含选自seq id no:1至seq id no:3和seq id no:5至seq id no:12的氨基酸序列，所述tau磷酸肽的量为每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔，优选地每剂约90纳摩尔至约715纳摩尔，每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔或每剂约90纳摩尔至约275纳摩尔，诸如每剂约25纳摩尔、约30纳摩尔、约35纳摩尔、约40纳摩尔、约45纳摩尔、约50纳摩尔、约55纳摩尔、约60纳摩尔、约65纳摩尔、约70纳摩尔、约75纳摩尔、约80纳摩尔、约85纳摩尔、约90纳摩尔、约95纳摩尔、约100纳摩尔、约125纳摩尔、约150纳摩尔、约175纳摩尔、约200纳摩尔、约225纳摩尔、约250纳摩尔、约275纳摩尔、约300纳摩尔、约325纳摩尔、约350纳摩尔、约375纳摩尔、约400纳摩尔、约425纳摩尔、约450纳摩尔、约475纳摩尔、约500纳摩尔、约525纳摩尔、约550纳摩尔、约575纳摩尔、约600纳摩尔、约625纳摩尔、约650纳摩尔、约675纳摩尔、约700纳摩尔、约725纳摩尔、约750纳摩尔或其之间的任何值，其中所述tau磷酸肽呈递于脂质体的表面上。
[0116]
实施方案1a是在有此需要的受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导脑炎的方法，其包括向所述受试者施用有效量的脂质体，所述脂质体包含每剂100μg至2500μg、优选地300μg至2400μg、300μg至1800μg、或300μg至900μg、诸如100μg、150μg、200μg、250μg、300μ
g、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg、1100μg、1200μg、1300μg、1400μg、1500μg、1600μg、1700μg、1800μg、1900μg、2000μg、2100μg、2200μg、2300μg、2400μg、2500
ꢀµ
g或其之间的任何值的呈递在脂质体的表面上的四棕榈酰化tau磷酸肽和toll
‑
样受体4激动剂，其中所述tau磷酸肽包含选自seq id no:1至seq id no:3和seq id no:5至seq id no:12的氨基酸序列。
[0117]
实施方案2是实施方案1或1a的方法，其中所述tau磷酸肽由选自seq id no:27至seq id no:29和seq id no:31至seq id no:38的氨基酸序列组成。
[0118]
实施方案3a是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:27的氨基酸序列组成。
[0119]
实施方案3b是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:28的氨基酸序列组成。
[0120]
实施方案3c是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:29的氨基酸序列组成。
[0121]
实施方案3d是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:31的氨基酸序列组成。
[0122]
实施方案3e是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:32的氨基酸序列组成。
[0123]
实施方案3f是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:33的氨基酸序列组成。
[0124]
实施方案3g是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:34的氨基酸序列组成。
[0125]
实施方案3h是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:35的氨基酸序列组成。
[0126]
实施方案3i是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:36的氨基酸序列组成。
[0127]
实施方案3j是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:37的氨基酸序列组成。
[0128]
实施方案3k是实施方案1至2中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:38的氨基酸序列组成。
[0129]
实施方案4是实施方案1至3k中任一项的方法，其中皮下施用所述脂质体。
[0130]
实施方案5是实施方案1至3k中任一项的方法，其中肌肉内施用所述脂质体。
[0131]
实施方案6是实施方案1至5中任一项的方法，其进一步包括在初始施用后1至24周向所述受试者施用第二剂的有效量的脂质体。
[0132]
实施方案7是实施方案1至6中任一项的方法，其中所述脂质体进一步包含辅助t
‑
细胞表位和脂化cpg寡核苷酸中的至少一种，优选地辅助t
‑
细胞表位和脂化cpg寡核苷酸。
[0133]
实施方案7a是实施方案7的方法，其中有效量的脂质体包含每剂30μg至900μg、优选地100μg至585μg、诸如30μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、330μg、360μg、390μg、420μg、450μg、480μg、500μg、520μg、540μg、560μg、580μg、600μg、700μg、800
ꢀµ
g或900μg或其之间的任何值的量的toll
‑
样受体4激动剂。
[0134]
实施方案7b是实施方案7或7a的方法，其中所述toll
‑
样受体4激动剂是3
‑
脱酰基的单磷酰六
‑
酰基脂质a。
[0135]
实施方案7c是实施方案7
‑
7b中任一项的方法，其中有效量的脂质体包含每剂25μg至625μg、优选地75μg至450μg、诸如25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、425μg、450μg、475μg、500μg、525μg、550μg、575μg、600μg或625μg或其之间的任何值的量的辅助t
‑
细胞表位。
[0136]
实施方案7d是实施方案7
‑
7c中任一项的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位是由seq id no:13的氨基酸序列组成的t50辅助t
‑
细胞表位，由seq id no:14的氨基酸序列组成的t46辅助t
‑
细胞表位，由seq id no:15的氨基酸序列组成的t48辅助t
‑
细胞表位，由seq id no:16的氨基酸序列组成的t51辅助t
‑
细胞表位，或由seq id no:17的氨基酸序列组成的t52辅助t
‑
细胞表位。
[0137]
实施方案7e是实施方案7d的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位是由seq id no:13的氨基酸序列组成的t50辅助t
‑
细胞表位。
[0138]
实施方案7f是实施方案7
‑
7e中任一项的方法，其中有效量的脂质体包含每剂50μg至1250μg、优选地150μg至800μg、诸如50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg、1050μg、1100μg、1200μg或1250μg或其之间的任何值的量的脂化cpg寡核苷酸。
[0139]
实施方案8是实施方案7
‑
7f中任一项的方法，其中所述脂化cpg寡核苷酸具有选自seq id no:18至seq id no:22的核苷酸序列。
[0140]
实施方案9a是实施方案8的方法，其中所述cpg寡核苷酸具有seq id no:18的核苷酸序列。
[0141]
实施方案9b是实施方案8的方法，其中所述cpg寡核苷酸具有seq id no:19的核苷酸序列。
[0142]
实施方案9c是实施方案8的方法，其中所述cpg寡核苷酸具有seq id no:20的核苷酸序列。
[0143]
实施方案9d是实施方案8的方法，其中所述cpg寡核苷酸具有seq id no:21的核苷酸序列。
[0144]
实施方案9e是实施方案8的方法，其中所述cpg寡核苷酸具有seq id no:22的核苷酸序列。
[0145]
实施方案10是实施方案8至9e中任一项的方法，其中所述cpg寡核苷酸具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
[0146]
实施方案11是实施方案8至10中任一项的方法，其中所述cpg寡核苷酸与至少一个亲脂基团共价连接。
[0147]
实施方案11a是实施方案8至10中任一项的方法，其中所述cpg寡核苷酸经由peg接头与至少一个亲脂基团共价连接。
[0148]
实施方案12是实施方案11或11a的方法，其中所述cpg寡核苷酸与胆固醇基团共价连接。
[0149]
实施方案12a是实施方案12的方法，其中所述cpg寡核苷酸经由peg基团与胆固醇基团共价连接。
[0150]
实施方案13是实施方案1至12a中任一项的方法，其中所述脂质体进一步包含一种或多种选自以下的脂质：1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dmpc)、1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰基
‑
3'
‑
外消旋
‑
甘油(dmpg)和胆固醇。
[0151]
实施方案14是实施方案1至13中任一项的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位包含至少一种选自seq id no:23至seq id no:26的氨基酸序列。
[0152]
实施方案15是实施方案14的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位包含seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25的氨基酸序列。
[0153]
实施方案16是实施方案14或15的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位包含选自seq id no:13
‑
17和39
‑
44的氨基酸序列。
[0154]
实施方案17是实施方案1至16中任一项的方法，其中所述toll
‑
样受体4激动剂是单磷酰脂质a (mpla)。
[0155]
实施方案18是在有此需要的受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导严重不良事件的方法，其包括向所述受试者施用有效量的脂质体，所述脂质体包含每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔、优选地约90纳摩尔至约715纳摩尔或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔或每剂约90纳摩尔至约275摩尔、诸如每剂约25纳摩尔、约30纳摩尔、约35纳摩尔、约40纳摩尔、约45纳摩尔、约50纳摩尔、约55纳摩尔、约60纳摩尔、约65纳摩尔、约70纳摩尔、约75纳摩尔、约80纳摩尔、约85纳摩尔、约90纳摩尔、约95纳摩尔、约100纳摩尔、约125纳摩尔、约150纳摩尔、约175纳摩尔、约200纳摩尔、约225纳摩尔、约250纳摩尔、约275纳摩尔、约300纳摩尔、约325纳摩尔、约350纳摩尔、约375纳摩尔、约400纳摩尔、约425纳摩尔、约450纳摩尔、约475纳摩尔、约500纳摩尔、约525纳摩尔、约550纳摩尔、约575纳摩尔、约600纳摩尔、约625纳摩尔、约650纳摩尔、约675纳摩尔、约700纳摩尔、约725纳摩尔、约750纳摩尔或其之间的任何值或每剂300
µ
g至2400
µ
g、诸如300
µ
g至1800
µ
g、或300
µ
g至900
ꢀµ
g per dose、诸如每剂100
µ
g、150
µ
g、200
µ
g、250
µ
g、300
µ
g、400
µ
g、500
µ
g、600
µ
g、700
µ
g、800
µ
g、900
µ
g、1000
µ
g、1100
µ
g、1200
µ
g、1300
µ
g、1400
µ
g、1500
µ
g、1600
µ
g、1700
µ
g、1800
µ
g、1900
µ
g、2000
µ
g、2100
µ
g、2200
µ
g、2300
µ
g、2400
µ
g、2500
µ
g或其之间的任何值的呈递于脂质体的表面上的四棕榈酰化tau磷酸肽，其中所述tau磷酸肽包含选自seq id no:1至seq id no:3和seq id no:5至seq id no:12的氨基酸序列，且所述脂质体进一步包含单磷酰脂质a(mpla)、1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dmpc)、1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰基
‑
3'
‑
外消旋
‑
甘油(dmpg)、胆固醇以及缓冲液。
[0156]
实施方案18a是在有此需要的受试者中诱导抗磷酸化tau抗体而不诱导脑炎的方法，其包括向所述受试者施用有效量的脂质体，所述脂质体包含每剂约25纳摩尔至约750纳摩尔、优选地约90纳摩尔至约715纳摩尔或每剂约90纳摩尔至约535纳摩尔或每剂约90纳摩尔至约275纳摩尔、诸如每剂约25纳摩尔、约30纳摩尔、约35纳摩尔、约40纳摩尔、约45纳摩尔、约50纳摩尔、约55纳摩尔、约60纳摩尔、约65纳摩尔、约70纳摩尔、约75纳摩尔、约80纳摩尔、约85纳摩尔、约90纳摩尔、约95纳摩尔、约100纳摩尔、约125纳摩尔、约150纳摩尔、约175纳摩尔、约200纳摩尔、约225纳摩尔、约250纳摩尔、约275纳摩尔、约300纳摩尔、约325纳摩尔、约350纳摩尔、约375纳摩尔、约400纳摩尔、约425纳摩尔、约450纳摩尔、约475纳摩尔、约500纳摩尔、约525纳摩尔、约550纳摩尔、约575纳摩尔、约600纳摩尔、约625纳摩尔、约650纳摩尔、约675纳摩尔、约700纳摩尔、约725纳摩尔、约750纳摩尔或其之间的任何值或每剂100
µ
g至2500
µ
g、或300
µ
g至2400
µ
g、诸如300
µ
g至1800
µ
g、或300
µ
g至900
µ
g、例如100
µ
g、150
µ
g、200
µ
g、250
µ
g、300
µ
g、400
µ
g、500
µ
g、600
µ
g、700
µ
g、800
µ
g、900
µ
g、1000
µ
g、1100
µ
g、1200
µ
g、1300
µ
g、1400
µ
g、1500
µ
g、1600
µ
g、1700
µ
g、1800
µ
g、1900
µ
g、2000
µ
g、2100
µ
g、2200
µ
g、2300
µ
g、2400
µ
g、2500
µ
g或其之间的任何值的呈递于脂质体的表面上的四棕榈酰化tau磷酸肽，其中所述tau磷酸肽包含选自seq id no:1至seq id no:3和seq id no:5至seq id no:12的氨基酸序列，且所述脂质体进一步包含单磷酰脂质a(mpla)、1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dmpc)、1,2
‑
二肉豆蔻酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰基
‑
3'
‑
外消旋
‑
甘油(dmpg)、胆固醇以及缓冲液。
[0157]
实施方案19是实施方案18或18a的方法，其中所述脂质体进一步包含辅助t
‑
细胞表位和与胆固醇基团共价连接的cpg寡核苷酸。
[0158]
实施方案19a是实施方案19的方法，其中所述cpg寡核苷酸经由peg基团与胆固醇基团共价连接。
[0159]
实施方案19b是实施方案19或19a的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位包含seq id no:23、seq id no:24和seq id no:25的氨基酸序列。
[0160]
实施方案19c是实施方案19或19a的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位包含选自seq id no:13
‑
17和39
‑
44的氨基酸序列。
[0161]
实施方案19d是实施方案19或19a的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位包含seq id no:39的氨基酸序列。
[0162]
实施方案19e是实施方案19或19a的方法，其中所述辅助t
‑
细胞表位包含seq id no:13的氨基酸序列。
[0163]
实施方案19f是实施方案19至19e中任一项的方法，其中所述cpg寡核苷酸具有seq id no:18的核苷酸序列。
[0164]
实施方案19g是实施方案19至19e中任一项的方法，其中所述cpg寡核苷酸具有seq id no:19的核苷酸序列。
[0165]
实施方案20a是实施方案18至19g中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:27的氨基酸序列组成。
[0166]
实施方案20b是实施方案18至19g中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:28的氨基酸序列组成。
[0167]
实施方案20c是实施方案18至19g中任一项的方法，其中所述tau磷酸肽由seq id no:29的氨基酸序列组成。
[0168]
实施方案21a是实施方案18至20c中任一项的方法，其中所述缓冲液包含磷酸盐缓冲液。
[0169]
实施方案21b是实施方案18至20c中任一项的方法，其中所述缓冲液包含组氨酸和蔗糖中的至少一种。
[0170]
实施方案22a是实施方案18至21b中任一项的方法，其中mpla包含单磷酰基脂质a(例如，3d
‑
(6
‑
酰基) phad
®
)。
[0171]
实施方案23是实施方案1至22a中任一项的方法，其中所述受试者需要阿尔茨海默氏病的治疗。
[0172]
实施方案24是实施方案1至22a中任一项的方法，其中所述受试者需要阿尔茨海默
氏病的预防。
[0173]
实施方案25是实施方案23的方法，其中所述受试者需要早期阿尔茨海默氏病、由于阿尔茨海默氏病、轻度阿尔茨海默氏病或轻度至中度阿尔茨海默氏病导致的轻度认知损害(mci)的治疗。
[0174]
实施方案26是实施方案1至25中任一项的方法，其中所述受试者是人受试者。
[0175]
实施例本发明的以下实施例是为了进一步举例说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明并且本发明的范围由所附权利要求确定。
[0176]
以下实施例中使用的实验方法，除非另有说明，全部是普通方法。以下实施方案中使用的试剂，除非另有说明，全部购自普通试剂供应商。
[0177]
在所有以下实施例中，aci
‑
35.030是根据本发明的实施方案的脂质体制剂，其含有1200μg/ml的具有seq id no:28的氨基酸序列的磷酸化tau肽、mpla(3d
‑
(6
‑
酰基)phad
®
)、dmpc、dmpg、胆固醇、300μg/ml的seq id no:13的辅助t
‑
细胞表位、经由peg接头与胆固醇基团共价连接的cpg寡核苷酸，和缓冲液，并且aci
‑
35是根据本发明实施方案的脂质体制剂，其含有具有seq id no:28的氨基酸序列的磷酸化tau肽、mpla、dmpc、dmpg、胆固醇，和缓冲液。
[0178]
实施例1：aci
‑
35.030在c57bl/6j小鼠中的剂量
‑
应答目标：评估aci
‑
35.030疫苗在通过肌肉内(i.m)注射施用于c57bl/6雌性小鼠时的免疫原性。
[0179]
方法：研究设计在表1中解释。
[0180]
表1：实施例1的研究设计组基因型小鼠治疗施用途径每个小鼠剂量的理论肽浓度1c57bl/610aci
‑
35.030肌肉内80
µ
g2c57bl/610aci
‑
35.030肌肉内35
µ
g以下列间隔施用剂量3次：第1、15和29天。在以下间隔抽取血液样品用于抗体测定：第
‑
7、8、22和36天。
[0181]
测量针对磷酸化tau肽的特异性igg抗体应答(通过elisa测定)。
[0182]
结果/结论：用aci
‑
35.030 (1200:300)疫苗中的35和80μg目标剂量的t3免疫诱导针对具有seq id no:2的氨基酸序列的t3.5肽的抗体(参见图1)。
[0183]
实施例2：在恒河猴中评估由aci
‑
35.030(脂质体表面上的四棕榈酰化t3磷酸
‑
tau肽、mpla (3d
‑
(6
‑
酰基)phad
®
)和cpg7909
‑
chol以及封装的t50)疫苗诱导的igg应答目标：评估通过皮下或肌肉内注射施用于雄性和雌性恒河猴的aci
‑
35.030(脂质体表面上的四棕榈酰化t3磷酸
‑
tau肽、mpla(3d
‑
(6
‑
酰基)phad
®
)和cpg7909
‑
chol以及封装的t50)疫苗的免疫原性，和由此确定最佳施用途径和疫苗浓度。
[0184]
方法：研究设计在表2中解释。
[0185]
表2：实施例2的研究设计
[0186]
脂质体疫苗的理论剂量是每只动物1800μg的四棕榈酰化磷酸肽(t3)和1800μg的t50肽。
[0187]
按以下间隔施用剂量4次：第1、29、85和169天。按以下间隔抽取血液样品用于抗体测定：第
‑
14、8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190天。
[0188]
测量针对磷酸化和非磷酸化tau肽(分别为t3.5和t3.6；通过elisa确定)、全长磷酸
‑
tau(ptau)蛋白(通过elisa确定)和从阿尔茨海默氏病患者的人脑中提取的tau的病理形式(人phf；由msd确定)的特异性igg抗体应答。在转移当天开始，在整个研究中每天两次记录动物的临床体征(健康、行为变化等)。在开始治疗之前和之后每周至少一次记录所有动物的体重。
[0189]
结果/结论：总体而言，在用任何疫苗方案免疫后，在注射部位既没有观察到全身性副作用也没有观察到持续的皮肤敏感性。
[0190]
浓缩的(1200:1200)和非浓缩的(400:400)aci
‑
35.030疫苗诱导相似的t3.5和人phf
‑
特异性igg滴度。s.c.和i.m.施用相同的疫苗制剂之间未检测到t3.5
‑
和人phf
‑
特异性igg滴度的差异。
[0191]
实施例3：在c57bl/6小鼠中每两周皮下注射8次aci
‑
35、随后两周无治疗时段(glp)的重复剂量毒性研究目标：评估在c57bl/6小鼠中每两周皮下注射14周后 aci
‑
35的潜在毒性。治疗时段完成后，将指定的动物保持两周无治疗时段，以评估任何发现的可逆性。此外，在研究期间评价aci
‑
35的免疫原性。
[0192]
方法：研究设计在表3中解释。
[0193]
表3：实施例3的研究设计
* = aci
‑
35
‑
空详细说明施用的疫苗不含活性肽t3。按以下间隔施用剂量八次：第1、15、29、43、57、71、85和99天。在以下间隔抽取血液样品：第
‑
2、4、6、8、19、12、14、16和17周。在研究结束时，将来自第1组和第5组的最后6只
♂
小鼠 6只
♀
小鼠保留两周的无治疗时段。
[0194]
结果/结论：以390μg/注射的最高剂量水平重复注射aci
‑
35
‑
空或aci
‑
35引起八次注射后白蛋白/球蛋白(a/g)比率的降低。通常在免疫动物中显示的这种变化可能与球蛋白(抗体)血浆分数的增量相符，并且这样解释是因为所有aci
‑
35治疗的动物都产生抗体(igm和igg类别中的)。通常，重复注射后igg滴度高于igm滴度，并且雌性倾向于比雄性产生更多的抗体。
[0195]
在注射部位，以98或390μg肽，使用aci
‑
35处理的组中观察到局部和瞬时反应(增稠)。在这些剂量下，在两种性别中都记录到脾脏和肝脏重量增加和胸腺重量减少，并且仅在雌性中记录到肾脏重量增加。在注射部位，主要在以98和390
µ
g/注射下，使用aci
‑
35看到肉眼可见的发现。在显微镜下，pbs对照、aci
‑
35
‑
空或来自24
µ
g/注射的aci
‑
35的施用在局部良好耐受。在所有剂量水平下都看到与空脂质体相关的泡沫状巨噬细胞和单核炎性浸润，其具有剂量相关的严重程度，但在pbs对照组中没有。在390
µ
g/注射下的aci
‑
35轻微增加伴有纤维化和皮下组织的偶发性变性/坏死的亚急性炎性应答。
[0196]
aci
‑
35
‑
空或390μg/注射的aci
‑
35的施用诱导脾脏和肝脏中的髓外造血，并增加骨髓中的髓样细胞数量，这与空脂质体的施用相关。此外，在雌性中，主要在390
µ
g/注射的aci
‑
35看到单核炎性细胞在多个全身器官中的浸润，并且在aci
‑
35空的情况下程度较小。该发现被认为是在这些动物中可以预期的应答类型，因为它是一种众所周知具有易于诱导的免疫系统的小鼠品系，且因此不具有临床重要性。在98
µ
g/注射下施用aci
‑
35后唯一的全身性发现是脾脏和肝脏中的髓外造血。在24
µ
g/注射下施用aci
‑
35后没有全身发现。
[0197]
鉴于其轻度至中度严重程度、两周后完全或部分恢复以及不存在显著的临床或临床病理学相关性，根据研究定义，这些发现无一被认为是不利的。因此，在本研究的实验条件下，三个月内每两周向c57bl/6j雄性和雌性小鼠施用的390
µ
g肽的aci
‑
35剂量
‑
水平被认为是noael(无全身毒性体征，在局部水平没有不良体征)。
[0198]
实施例4：用aci
‑
35的食蟹猴中的六个月皮下毒性研究，随后为4周恢复时段(glp)目标：评价aci
‑
35在每四周一次向食蟹猴七次皮下给药后的累积毒性。对于一些
动物，在治疗时段后的4周恢复期期间评价治疗相关变化的可逆性或进展或任何延迟毒性。
[0199]
方法：研究设计在表4中解释。
[0200]
表4：实施例4的研究设计按以下间隔施用剂量七次：第1、29、57、85、113、141和169天。按以下间隔抽取血液样品：第15、43、71、99、127、155、183和208天。在研究结束时，将来自第1组和第4组的最后2只
♂
猕猴 2只
♀
猕猴保留4周的无治疗时段。
[0201]
结果/结论：向食蟹猴以358、716和1431μg/注射每28天一次皮下施用aci
‑
35持续6个月，在所有动物中都被良好耐受。
[0202]
尽管不能排除与治疗的关系，但中性粒细胞计数的轻微增加和葡萄糖水平的轻微降低被认为不是不利的，因为所有值都在背景历史数据内并且没有记录到关于预设值的相关变化。
[0203]
所有测试项
‑
治疗组都产生抗体。在所有测试项
‑
治疗组中，第一次施用两周后的免疫应答是相似的。此后，平均抗ptau抗体滴度在整个治疗时段期间增加，遵循剂量
‑
效应关系的趋势。相对于第七次施用两周后记录的抗体水平，经历四周恢复的动物显示明显的下降。
[0204]
基于获得的结果和在这些研究条件下，对于该研究，持续6个月每28天一次施用1431μg/注射的剂量被认为是noael(未观察到不良效应水平)。
[0205]
实施例5：对于aci
‑
35.030，恒河猴中的三个月肌肉内毒性研究，随后为四周恢复时段(glp)目标：本研究的目的是评价aci
‑
35.030在三次每个月向未处理雄性和雌性恒河猴肌肉内施用时的潜在毒性。在四周恢复时段期间，对来自对照组和高剂量组的2只猴/性别评价可能的治疗相关变化的可逆性。
[0206]
设计：应用的研究方案如下(表5)表5：实施例5的研究设计# 来自第1组和第3组的2只
♂
猴 2
♀
只猴被保留四周无治疗时段。
* aci
‑
e.030 一种脂质体制剂，其包含与aci
‑
35.030相同的组分，但不含任何tau肽。
[0207]
在第1天、第29天和第85天在大腿的3个不同部位通过单次肌肉内注射施用测试和参考项。在整个研究中，每天至少两次观察所有动物的存活率/死亡率和临床体征。在施用的每一天，在给药前和给药后6、24和48小时在给药部位对动物进行局部反应的评估(draize评分)。
[0208]
在整个研究中对每个笼子定性估计食物消耗。从适应时段开始直至研究结束，每周评价体重。在测试前和最后一次施用后三/四天进行一次检眼镜检查。在测试前和最后一次施用后近似24小时，对每只动物记录心电图一次(肢体导联i、ii和iii以及增强导联avr(增强右伏(augmented volt right))、avl(增强左伏(augmented volt left))和avf(增强足伏(augmented volt foot))。
[0209]
临床病理学评估(血液学、临床化学、凝血和尿液分析)在测试前和最后一次注射(第87天)后2天，对所有动物进行一次，并在朝向恢复时段结束时(第125天)对所有存活动物进行一次。
[0210]
在第
‑
14、8、22、36、50、64、78、92、99、106、120和127天(对于恢复动物，仅为第106、120和127天)收集血液样品，作为用于通过elisa测定抗p
‑
tau和抗t50的血清。
[0211]
在第
‑
14天，所有组中最后一次免疫后两周和恢复组中尸检前，收获pbmc。进行il
‑
4和ifn
‑
γ elispot分析以确定tau
‑
特异性t
‑
细胞应答。
[0212]
在所有动物中，对在测试前和尸检时采样一次的血液进行免疫表型分析。
[0213]
在第
‑
14天和第99天(主要和恢复)和第127天(恢复)收集血液用于pmbc(对于针对t3.5的t
‑
细胞应答的elispot)。
[0214]
在镇静下在预测试和每次死后检查之前从所有动物收集脑脊液(csf)样品用于细胞学评估。
[0215]
在完成安排的治疗或恢复时段后，对所有动物进行尸检并称重各个器官。对所有研究动物的脑、注射部位和淋巴结进行组织病理学检查。
[0216]
通过免疫组织化学(ihc)技术，在专用的研究阶段中评估由aci
‑
35.030诱导的抗体相对于不同人组织的潜在结合活性，其中使用在第99天采样的以2400
µ
g t3给药的动物的血清在来自三个无关个体的一组42个冷冻人组织和血液涂片中评价aci
‑
35.030诱导的猴抗体针对人组织的交叉反应性。
[0217]
结果：既没有死亡，也没有aci
‑
35.030相关的对体重、身体变化、食欲、眼科学、心电图、临床病理学(血液学、凝血、临床化学和尿液分析)或免疫表型分析的影响。
[0218]
在免疫后，在所有组间的几只动物中观察到注射部位中的短暂的轻微至中度的皮肤刺激的体征(红斑和水肿)。在第29天和第87天，在48小时，给予2400
µ
g t3/注射的5只雌性中的1只的治疗后肢中观察到暂时的严重局部水肿。然而，在一天后(第30天和第88天)水肿消退。
[0219]
在对照和测试项给药组之间注意到平均器官重量的与剂量无关的一些差异。宏观地看，包括对照在内的所有组间的腹股沟、髂骨和盆腔淋巴结都被随机描述为增大，经常在显微镜下与淋巴样细胞过多相关，大部分在4周恢复时段后恢复，并被解释为可能是由于疫
[ps396/ps404]应答，并且51个供体中的2个供体(4%)对tau 393
‑
408应答。当考虑到临界应答和仅在两种测定中的一种中应答的供体时，51个供体中的4个(8%)对tau 393
‑
408 [ps396/ps404]应答，并且51个供体中的4个(8%)对tau 393
‑
408应答。因此，两种肽的应答的总体频率和幅度低，其中最多8%的供体应答。
[0230]
结论：针对51个hla
‑
型供体的群组测试通过增殖和il
‑
2分泌测量的测试肽(tau 393
‑
408 [ps396/ps404]和tau 393
‑
408)诱导cd4
t
‑
细胞应答的能力。来自研究的数据表明，两种肽诱导cd4
t
‑
细胞应答的总体相对风险低(2
‑
8%)。
[0231]
与在episcreen
™
测定中测试的蛋白治疗剂相比，来自该研究的数据显示两种肽都被认为具有在人中诱导cd4
t
‑
细胞应答的低潜在风险。
[0232]
实施例7：aci
‑
35在人中的安全性和效力在英国和芬兰的具有轻度至中度ad的患者中进行的临床ib期研究(aci
‑
35
‑
1201：在具有轻度至中度阿尔茨海默氏病的患者中的aci
‑
35的安全性、耐受性和免疫原性的ib期多中心、双盲、随机、安慰剂对照研究)中评估aci
‑
35疫苗(aci
‑
35)的安全性、耐受性和免疫原性。
[0233]
目标：初步评价在具有轻度至中度ad的患者中用3个剂量和3个给药方案的aci
‑
35的安全性和耐受性，以及对血清中的抗磷酸
‑
tau(ptau)免疫球蛋白g(igg)滴度的诱导。
[0234]
方法：5个群组各自由以下组成：不同剂量(300μg、900μg或1800μg的四棕榈酰化磷酸肽(ptau肽t3，seq id no:28))和/或经6个月的给药方案(2、3或5剂量施用)，随后为最后一次注射后12
‑
16个月(群组1)或6个月(群组2
‑
5)进行加强注射，如表5中所述。
[0235]
表5：实施例5的研究设计缩写：n=患者数，w=周。
[0236]
24个患者被随机化并接受至少1剂研究药物疫苗。在筛选时，平均患者年龄为73.6
±
5.88岁，且平均mmse评分为23.3
±
2.71。15个女性和9个男性被随机分组。22个患者完成了该研究。来自群组2的两个患者(一个服用900
µ
g，一个服用安慰剂)由于与aci
‑
35无关的严重医疗状况(其严重阻碍或使研究不可能完成)而终止研究。
[0237]
纳入标准如下：1.根据美国国家神经和沟通疾病研究所和中风
‑
阿尔茨海默氏病及相关病症协会标准，可能患有阿尔茨海默氏病(ad)2.60岁或大于60岁且85岁或小于85岁3.在筛选时，简明精神状态检查(mmse) 18
–
28分4.患者在筛选前必须接受稳定剂量的乙酰胆碱酯酶抑制剂至少3个月5.患者由可靠的配偶或其他同居护理人员护理，所述可靠的配偶或其他同居护理
人员给出书面同意以协助临床评价和报告安全问题6.研究者认为能够理解并签署书面知情同意并遵守所有研究程序的患者(注意，必须在进行任何与试验相关的程序之前获得同意)7.女性必须绝经至少1年和/或手术绝育8.未绝经或手术绝育的男性患者的女性伴侣必须使用可靠的避孕措施，例如，双屏障避孕或激素避孕。
[0238]
结果/结论：总体而言，aci
‑
35在人受试者中测试的所有剂量和治疗方案下都是安全的且被良好耐受，而注射导致在所有研究群组中第一次注射后不久导致抗ptau抗体的快速诱导。注射部位红斑、注射部位反应和疲劳是最常见的研究药物相关的治疗紧急不良事件(teae)。没有临床或来自实验室或放射学发现的证据表明cns炎症的发展。除了注射部位反应以外，与安慰剂相比，没有任何ae模式表明与研究药物的关系。通常轻微和自限性的注射部位反应在较高剂量下更频繁，并且在群组4和5中由进行活跃用药的所有患者报告。与安慰剂相比，进行活跃用药更常见地观察到无症状低血糖，但鉴于已知该现象自发发生，与研究药物的关系是不确定的。报告5例sae，全部在来自群组2的患者中，其中1个患者用安慰剂治疗并经历2次sae (尿脓毒症和肾盂肾炎)。这2例sae与研究药物无关。对于2个用aci
‑
35治疗的患者报告了三例可能的研究药物相关的sae(急性肾盂肾炎、窦房结功能障碍和头晕)，这是唯一观察到的不良反应。在该研究中没有报告死亡。
[0239]
实施例7：aci
‑
35.030在人中的安全性和效力在欧洲的具有早期ad(由于ad导致的轻度认知损害(mci)和轻度ad)的患者中进行的一项临床ib/iia期多中心、双盲、随机化、安慰剂对照的研究(aci
‑
35
‑
1802研究)中评估aci
‑
35.030疫苗(aci
‑
35.030)的安全性、耐受性和免疫原性。
[0240]
目标：在74周的时间范围内，初步评价最多达3个剂量的aci
‑
35.030在具有早期ad (例如，由于ad导致的轻度认知损害(mci)和轻度ad)的参与者中的在具有早期ad的参与者中的安全性和耐受性，以及针对异常形式的tau蛋白的免疫应答的诱导，包括血清中的抗磷酸
‑
tau(抗ptau)的诱导。
[0241]
次要目标：通过评价例如血清中针对tau的igg滴度和针对ptau和tau的igm滴度的诱导来进一步评价研究疫苗的免疫原性；以及在74周的时间范围内评价由免疫引发的抗体的亲合力。
[0242]
探索性目标：探索研究疫苗对推定的ad进展生物标记(即总tau和ptau蛋白的血液和/或csf浓度)的影响；探索研究疫苗对血液中t
‑
细胞活化的影响；探索研究疫苗对血液炎性细胞因子(例如il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
6、il
‑
8、il
‑
10、ifn
‑
γ和tnf
‑
α)的影响；探索研究疫苗对行为、认知和功能表现的影响，各自都在74周的时间范围内。
[0243]
方法：3个群组各自由以下组成：患者接受不同剂量的aci
‑
35.030，通过组合物中ptau肽t3的量(300μg、900μg或1800μg的四棕榈酰化磷酸肽ptau肽t3，seq id no:28)指代，分布在48周内(在第0、8、24和48周施用剂量)，随后为24
‑
周(6个月)安全性随访时段。
[0244]
24个患者被随机分为3个亚群组，在每个亚群组中，2个患者接受安慰剂，且6个患者接受aci
‑
35.030。肌肉内施用剂量。
[0245]
对于所有研究患者，在每次给药后立即进行安全性评价，并在其后48至72小时通
过电话呼叫进行安全性评价。根据现场主要研究者的说法，在每个亚群组中，一旦先前患者在48至72小时进行安全性评价以证实不存在与研究疫苗相关的临床相关安全性问题，则对前4个患者进行首次给药。
[0246]
在治疗时段结束后，所有治疗的患者都具有24周(6个月)的安全性随访时段。在此时段期间，要求患者在最后一次施用后19周参加第一次随访，并在随访时段结束时(最后一次施用后26周)进行最后一次随访。在整个研究中通过数据和安全监控委员会(dsmb)定期审查安全性数据来监控参与者的安全性。
[0247]
将如下实施中期分析：一旦所有群组1患者已经完成第4次随访(第10周)，即在第二次注射后2至4周，进行第一次中期分析。目标是审查直至该时间点的安全性、耐受性和免疫原性数据，以确定是否开始群组2。
[0248]
一旦所有群组2患者已经完成第4次随访(第10周)，即在第二次注射后2至4周，进行第二次中期分析。目标是收集直至该时间点的安全性、耐受性和免疫原性数据，以确定是否开始群组3。
[0249]
一旦所有群组3患者已经完成第6次随访(第26周)，即在第三次注射后2至4周，进行第三次中期分析。目标是决定扩展群组1、2或3，以便在免疫原性、安全性和耐受性方面呈现最有利概况的剂量下收集额外的安全性/耐受性数据。
[0250]
在治疗时段结束时(即第4次注射后2至4周)进行第四次中期分析。目标是审查直至该时间点的安全性/耐受性和免疫原性数据，包括来自亚群组扩展的患者的数据(如果适用)。可以包括生物标记结果作为支持性探索性数据。将结果与随后对于其他群组获得的结果进行比较，以便在所有研究群组间选择用于进一步临床开发的最佳策略。
[0251]
在安全性随访时段结束时，即一旦所有群组1患者已经完成第11次随访(第74周)，进行第五次中期分析。目标与第四次中期分析相同，并且随后在所有群组间比较结果。
[0252]
研究群体为50
‑
75岁(男性和女性)，其中根据nia
‑
aa标准诊断为轻度ad或由ad导致的mci。
[0253]
纳入标准如下：1. 50岁起且直至75岁(包括75岁)的男性或女性。2. 根据nia
‑
aa标准，由ad导致的轻度认知损害(mci)或轻度ad，以及0.5或1的临床痴呆评级量表(cdr)总体评分。3. 22或以上的简明精神状态检查(mmse)评分。4. 在筛选时，与ad病理学的nia
‑
aa 2018标准相符的csf淀粉样蛋白42(aβ42)和磷酸化tau的水平。在csf aβ42水平的临界情况下，可以考虑其他结果来帮助确定淀粉样蛋白阳性，例如aβ42/aβ40比率，以及根据个案情况，阳性淀粉样蛋白pet扫描或阳性csf aβ42水平的病史。在筛选前3个月内进行的csf采样的结果根据个案情况是可以接受的，条件是它们与淀粉样蛋白病理的存在相符，并且相应的csf样品可用于研究中用于测试。5. 患者在基线前持续至少3个月未采用任何上市的ad治疗或接受稳定剂量的乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或美金刚。6. 患者由可靠的信息提供者或护理人员照顾，以确保依从性、协助临床评价和报告安全性问题。
7. 妇女必须绝经至少一年和/或手术绝育。有生育潜能或未绝经的妇女必须在筛选时具有阴性妊娠测试，并愿意从筛选随访直至其参与结束使用高度有效的避孕方法。将在整个治疗时段中进行尿妊娠再测试以确定受试者是否可以继续接受研究疫苗。具有有生育潜能的伴侣的男性患者必须愿意在研究期间使用适当的避孕措施。8. 研究者认为能够理解并提供书面知情同意的患者。9. 患者和信息提供者或护理人员必须是研究语言之一流利的，并且能够遵守所有研究程序，包括腰椎穿刺。
[0254]
排除标准如下：1. 参与使用主动免疫的针对ad和/或神经系统病症的先前临床试验，除非有文件证明患者仅用安慰剂治疗，并且预期安慰剂制剂不诱导任何特异性免疫应答。2. 在筛选前过去12个月内参与使用任何被动免疫的针对ad和/或神经系统病症的先前临床试验，除非有文件证明该受试者仅用安慰剂治疗并且预期安慰剂不诱导任何特异性免疫应答。3. 在筛选前过去3个月内参与使用任何小分子药物(包括bace
‑
1抑制剂)的针对ad和/或神经系统病症的先前临床试验。4. 同时参与任何其他使用实验性或批准的药物或疗法的临床试验。5. 在没有自身免疫性疾病的临床症状的患者中存在至少1/160的稀释度的阳性抗核抗体(ana)滴度。6. 当前或过去的自身免疫病史，或与自身免疫疾病的存在相符的临床症状。7. 免疫抑制，包括但不限于使用免疫抑制药物或全身性类固醇，除非它们在筛选前超过3个月被暂时开处方。8. 严重过敏反应史(例如过敏反应)，包括但不限于对先前疫苗和/或药物的严重过敏反应。9. 先前的临床显著的低血糖发作史。10. 根据精神病症诊断和统计手册
‑
v(dsm
‑
v)标准，目前符合或在过去五年内出现药物或酒精滥用或依赖。11. 可能干扰研究治疗的安全性和耐受性的评估和/或对完全研究随访时间表的遵守的任何临床显著的医疗状况。12. 可能影响免疫系统和/或预期可能损害研究疫苗在患者中的免疫潜力的任何临床显著的医疗状况(例如，任何获得性或先天性免疫抑制病症的病史)。13. 在筛选前的最后12个月内使用肼苯哒嗪、普鲁卡因胺、奎尼丁、异烟肼、tnf
‑
抑制剂、米诺环素。14. 使用地尔硫卓，除非在筛选前至少3个月使用稳定剂量。15. 使用哥伦比亚自杀严重程度评级量表如下定义的重大自杀风险：对自杀意念问题4或5回答：“是”或在过去12个月内对自杀行为回答：“是”的受试者。16. 除了被认为与ad相关的那些之外的伴随的精神或神经系统病症(例如脑损伤伴有意识丧失、症状性中风、帕金森氏病、严重颈动脉闭塞性疾病、tia)。17. 不受控制的癫痫的病史或存在。如果有癫痫病史史，则它们必须被良好控制，且在基线前2年内没有发生癫痫。如果在筛选前至少3个月保持稳定剂量，则允许使用抗癫
痫药物。18. 在筛选前的过去10年内有脑膜脑炎病史。19. 具有出血性和/或非出血性中风病史的患者。20. 外周神经病的存在或病史。21. 有可能cns参与的炎性神经系统病症的病史。22. 筛选mri扫描显示与ad不相符的，可能引起患者的症状的替代病理的结构证据。除了直径小于1 cm的良性脑膜瘤以外的占位性病变、多于2个腔隙性梗死或1个直径大于1cm的单个梗死或任何单个浅表铁质沉积区域的证据，或先前大出血≥10mm的证据。无论位置如何，t2* mri上的微出血被允许最多达10次。23. 由于任何理由不能进行mri检查，包括但不限于mri研究禁忌的金属植入物和/或严重的幽闭恐惧症。24.严重的听力或视力损害或由研究者判断相关的其他问题，其阻止遵守方案和执行结果措施。25. 筛选前3个月内临床显著的感染或重大外科手术。预期在参与研究期间发生的计划手术必须在筛选时由医学监督员审查和批准。26. 基线前过去2个月内接受任何疫苗，包括流感疫苗。27. 在筛选时在ecg上有临床显著的心律失常或其他临床显著的异常。28. 在基线前一年内的心肌梗塞、不稳定型心绞痛或显著的冠状动脉疾病。29. 过去5年内具有癌症病史的患者，除了治疗的鳞状细胞癌、基底细胞癌和原位黑色素瘤或已完全切除并被认为治愈的原位前列腺癌或原位乳腺癌以外。30. 根据现场研究者的观点，血液学参数、肝功能测试和其他生物化学量度的与正常值的临床显著偏差，其被判断为是临床显著的。31. 女性受试者是怀孕的，如在筛选时通过血清检测证实，或计划怀孕或哺乳的。32. 接受任何抗凝药物或抗血小板药物的患者，除了每日剂量低于100 mg的阿司匹林(以避免在安排或未安排的腰椎穿刺期间出血的风险)。33. 接受抗精神病药物的患者，除非使用稳定的低剂量用于治疗失眠症。34. 在筛选前30天期间献过血液或血液产品或计划在参与研究的同时献血的患者。35. 在筛选时与活动性梅毒相符的阳性vdrl(性病研究实验室)。36. 在筛选时具有阳性hiv测试的患者。37. 在筛选时具有如通过测试所测量的活动性乙型和/或丙型肝炎的患者。38. 肌酐高于正常上限的1.5倍、甲状腺功能测试异常或血清b12或叶酸水平临床显著的降低的患者(注意：所有口服剂量的甲状腺替代剂、b12或叶酸必须在筛选前稳定至少3个月)。
[0255]
结果/结论：将评价以下主要终点：安全性和耐受性
‑
不良事件、即时和延迟反应原性(例如过敏反应、局部和全身反应原性，包括疼痛、发红、免疫
‑
复合物疾病、肿胀、发烧)；耐受性的全局评价；自杀意念(c
‑
ssrs)；行为(npi)；认知和功能评价(rbans、cdr
‑
sb)以评价安全性；生命体征；mri成像；心
电图；血液和尿液中的常规血液学和生物化学评估；评估血液中的自身免疫抗体，包括抗dna抗体；血液和csf中的炎性标志物。
[0256]
免疫应答
ꢀ‑ꢀ
血清中的抗ptau igg滴度(几何平均值、距基线的变化、应答率、峰和曲线下面积)。
[0257]
将评价以下次要终点：免疫应答
ꢀ‑ꢀ
血清中的抗tau igg、抗ptau和抗tau igm滴度(几何平均值、距基线的变化、应答率、峰和曲线下面积)，通过亲合力测试确定igg应答概况。
[0258]
将评价以下探索性终点：血液和/或csf中生物标志物滴度(例如总tau和ptau蛋白)距基线的变化，血液中t
‑
细胞活化水平距基线的变化，血液中炎性细胞因子(例如il
‑
1b、il
‑
2、il
‑
6、il
‑
8、il
‑
10、ifn
‑
γ和tnf
‑
α)滴度距基线的变化、自杀意念(c
‑
ssrs)、行为(npi)、认知和功能表现(rbans、cdr
‑
sb)评分距基线的变化。
[0259]
实施例8：肌肉内注射比皮下注射诱导更均匀的免疫应答数组恒河猴(每组n=3只雄性和3只雌性)通过在第1、29、85和169天用1800 μg/剂的aci
‑
35.030通过接种疫苗来肌肉内或皮下免疫。
[0260]
使用greenberg和davies (1991, proc natl acad sci u s a, 87(15):5827
‑
31)的改良方法，通过不可溶的tau的十二烷基肌氨酸钠提取，从组织学证实的ad受试者的死后脑组织获得富集成对螺旋丝的制备物。使用mesoscale discovery (msd)平台评估富集成对螺旋丝(ephf)的特异性抗体滴度。msd链霉抗生物素蛋白板用生物素化的抗tau捕获抗体(ht7
‑
生物素，thermoscientific)包被，然后与从ad患者分离的ephf孵育，同时使用sulfotag标记的抗人igg抗体进一步检测ephf特异性的igg抗体，所述sulfotag标记的抗人igg抗体与猴igg抗体交叉反应。更具体地，将ephf添加至预先用1% bsa饱和并用生物素化的ht
‑
7 (thermo scientific)包被的msd gold小点链霉抗生物素蛋白96
‑
孔板(msd)。孵育一小时后，板用pbst洗涤并添加连续稀释的血清并孵育两小时。使用sulfotag标记的抗人igg抗体检测结合的抗体，随后在1% pfa中进行固定步骤，然后添加读取缓冲液t。使用sector imager (msd)分析板。对于每只个体猴，结果以每毫升任意单位(au/ml)连同每组的几何平均值表示(图4)。代表在第一次免疫后第50天、第106天和第190天的ephf特异性抗体滴度。
[0261]
图4显示脂质体疫苗诱导高ephf
‑
特异性igg滴度，并且肌肉内注射比皮下注射诱导更均匀的抗体应答。
[0262]
序列表seq id no:1
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽(7.1)seq id no:2
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽(t3.5)seq id no:3
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽(22.1)seq id no:4
ꢀ‑ꢀ
tau肽(t3.6)
seq id no:5
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽seq id no:6
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽seq id no:7
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽seq id no:8
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽seq id no:9
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽seq id no:10
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽seq id no:11
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽seq id no:12
ꢀ‑ꢀ
磷酸
‑
tau肽seq id no:13
ꢀ‑ꢀ
t50 t细胞表位seq id no:14
ꢀ‑ꢀ
t46 t细胞表位seq id no:15
ꢀ‑ꢀ
t48辅助t细胞表位seq id no:16
ꢀ‑ꢀ
t51辅助t细胞表位seq id no:17
ꢀ‑ꢀ
t52辅助t细胞表位seq id no:18
ꢀ‑ꢀ
cpg 2006 (也已知为cpg 7909)其中小写意指硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键seq id no:19
ꢀ‑ꢀ
cpg 1018其中小写意指硫代磷酸酯核苷酸间键seq id no:20
ꢀ–ꢀ
cpg2395
其中小写意指硫代磷酸酯核苷酸间键seq id no:21
ꢀ–ꢀ
cpg2216其中小写意指硫代磷酸酯核苷酸间键，且大写字母意指磷酸二酯(po)键seq id no:22
ꢀ–ꢀ
cpg2336其中小写意指硫代磷酸酯核苷酸间键，且大写字母意指磷酸二酯键seq id no:23
ꢀ–ꢀ
泛dr肽(padre)肽seq id no:27
ꢀ–ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽(棕榈酰化7.1)seq id no:28
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽(t3, 棕榈酰化t3.5)seq id no:29
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽(棕榈酰化22.1)seq id no:30
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化tau肽seq id no:31
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽seq id no:32
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽seq id no:33
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽seq id no:34
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽seq id no:35
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽seq id no:36
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽seq id no:37
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽
seq id no:38
ꢀ‑ꢀ
棕榈酰化磷酸
‑
tau肽seq id no:39
ꢀ–ꢀ
没有c
‑
末端酰胺的t50seq id no:40
ꢀ–
在c
‑
末端没有
‑
lys(pal)
‑
lys(pal)
‑
nh2的t46seq id no:41
ꢀ–ꢀ
没有c
‑
末端酰胺的t48seq id no:42
ꢀ–ꢀ
没有c
‑
末端酰胺的t51seq id no:43
ꢀ–ꢀ
没有c
‑
末端酰胺的t52seq id no:44
ꢀ‑ꢀ
t57