一种简便高效的生物测定试剂及方法与流程

1.本发明涉及生物测定领域，具体地说，涉及一种简便高效的生物测定试剂及方法。


背景技术：

2.农田害虫是影响农业生产的一个重要因素，每年因农田害虫危害造成的经济损失严重。害虫综合防治作为农业生产的一项重要策略，在农业可持续发展，降低农业经济损失中具有重要作用。利用生物农药、化学农药等进行害虫防治一直是害虫综合治理研究中的重要研究内容，与此同时，生物农药、化学农药的相关研究通常需要进行相关的生物测定。
3.传统的生物测定实验，通常是借助于研究待测动物的人工饲料，将研究试剂滴加于人工饲料上饲喂研究待测动物，进行生物测定。
4.但是目前许多研究待测动物没有合适的人工饲料，并且由于传统的生物测定方法操作繁琐，接毒实验时间长，待测动物接毒结束时间无法确定等缺点，对以相关生物测定为基础的研究产生了一定的限制作用。因此，发明一种更加简便高效的生物测定方法成为了目前以生物测定为基础的研究的迫切需要。
5.这种生物测定方法存在操作繁琐，对人工饲料大小厚薄等要求高，导致接毒量不可控，可能接毒量不完全，接毒时间长，且待测动物个体间接毒时间差异大以及无法准确估计接毒结束的时间等弊端。


技术实现要素：

6.(一)要解决的技术问题
7.为了解决现有生物测定方法中存在的问题，本发明的目的是提供一种简便高效的生物测定试剂及方法，能够适用于目前没有合适的人工饲料的研究待测动物进行胃毒实验，同时操作简便，接毒时间短，并可以相对准确地记录接毒结束的具体时间。
8.(二)技术方案
9.本发明首先提供一种生物测定试剂，为含有待测农药和可食用色素的液体。
10.作为优选，每1ml所述生物测定试剂中添加1.8～2.2μl可食用色素时，不仅可以很好地起到指示作用，而且对待测动物的生长发育无显著性影响，有助于提升测定结果的客观性和准确性。
11.进一步优选的，每1ml所述生物测定试剂中添加2.0μl可食用色素。
12.作为优选，所述的可食用色素的颜色与待测动物的自然食料的颜色相同或相近，可以为红色、蓝色或绿色等。
13.作为优选方案，当所述待测动物的自然食料呈绿色时，优选所述可食用色素的主要成分为柠檬黄，且所述柠檬黄的浓度为0.03～0.05mol/l(优选0.04mol/l)。该浓度下不仅颜色鲜艳指示作用好，而且也有利于吸引待测动物进行取食。
14.本发明中所述的待测农药可以是生物农药和/或化学农药，其用量可根据测定需求确定，在此不做进一步限定。
15.本发明进一步提供一种简便高效的生物测试方法，给待测动物饲喂所述的生物测定试剂，观察食用情况，当85～95％待测动物接毒结束时，给所述待测动物饲喂正常食料，观察并统计相关指标。
16.作为优选，在透明的饲养装置中饲养所述待测动物。
17.作为优选，在给待测动物饲喂所述生物测定试剂前，先对所述待测动物进行饥饿处理。
18.作为优选，在观察并统计相关指标前，剔除未吃完所述生物测定试剂或所述正常食料的待测动物。
19.有些待测动物有合适的人工饲料，也有许多待测动物没有合适的人工饲料。本发明中所述的正常食料可以为饲料和/或自然食料，所述的自然食料参考该待测动物在自然环境中食用的食料。
20.本发明进一步提供所述的生物测定试剂或生物测试方法在动物的生物测试中的应用，优选所述动物为节肢动物，更优选优选所述节肢动物为待测动物。
21.本发明进一步提供所述的生物测定试剂或生物测试方法在农田虫害防治中的应用。
22.(三)有益效果
23.在使用本发明中后生物测定试剂后，存在以下优势：
24.(1)接毒操作简便，效率高，接毒效率大约提高2倍。
25.(2)接毒量可控，因可食用色素的指示作用，可以清楚的观察到待测动物是否将病毒悬浮液进食完全。如是没有进食完全，培养装置中会留下印记，因此可以将未接毒完全的待测动物剔除掉。
26.(3)接毒时间短，待测动物个体间接毒时间差异小，可忽略不计。同时几乎可以准确估计接毒结束的时间。
27.上述优势有利于推进生物农药、化学农药的相关研究，减少因农田害虫危害所导致的经济损失。
附图说明
28.图1为实施例1中的棉铃虫幼虫累计化蛹率比较结果；
29.图2为实施例1中的棉铃虫蛹重比较结果；
30.图3为实施例2中的棉铃虫幼虫累计死亡率比较结果。
具体实施方式
31.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
32.在以下实施方式中，以棉田重要害虫棉铃虫以及专一性昆虫病毒棉铃虫核型多角体病毒为实例进行实验以及相关发明介绍。
33.棉铃虫(helicoverpa armigera)，属于鳞翅目，夜蛾科，实夜蛾亚科，棉铃虫属昆虫，广泛分布于世界各地，是世界性经济害虫，主要危害棉花、玉米、蔬菜、花生、以及其他农作物，在全球范围内造成了重大经济损失。
34.棉铃虫核型多角体病毒(h.armigera single nucleopolyhedrovirus，hasnpv)，
是一大类无脊椎动物的dna病毒。具有杀虫专一性强，杀虫效果好，可垂直传播，持效时间长，对人畜以及环境无害等优点而被广泛研究。hasnpv可以通过多种途径对寄主进行感染。取食被病毒污染的食物而经口感染，是自然界中昆虫感染的主要途径。尤其，对包埋在多角体中的病毒，必须经过昆虫消化系统，在碱性胃液作用下，消化多角体蛋白，病毒才可以释放出来并具有活性。据此原理，经口感染也是目前市面上的hasnpv病毒生物制剂对寄主感染的主要方式。
35.以下实施方式中所采用的可食用色素为舒克曼可食用复配着色剂，采购于广州福正东海食品有限公司。
36.整个生物测定过程中，棉铃虫生长环境保持一致。生长温度为26℃
±
1℃，湿度40％～70％，光周期l︰d＝14︰10。
37.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
38.实施例1可食用色素对棉铃虫生长发育无显著性影响
39.本实例中设置处理组和对照组进行可食用色素的生物测定研究。
40.提前挑取足够数量3龄末的棉铃虫于塑料养虫盒中，进行12h饥饿处理，备用。
41.处理组：1000μl ddh2o 2μl可食用色素配置成溶液。
42.将人工饲料切割成0.5cm*0.5cm*0.1cm大小，并向该块饲料上滴加2.5μl的溶液。将此块饲料加入到塑料养虫盒中，饲喂给提前饥饿处理好的棉铃虫(4龄1天)。
43.对照组：1000μl ddh2o.
44.将人工饲料切割成0.5cm*0.5cm*0.1cm大小，并向该块饲料上滴加2.5μl的ddh2o。将此块饲料加入到塑料养虫盒中，饲喂给提前饥饿处理好的棉铃虫(4龄1天)。
45.观察食用情况(饲喂时间控制在12h以内)，剔除未吃完处理饲料的棉铃虫，并向吃完处理饲料的棉铃虫的养虫盒中添加正常的人工饲料，并将其放入人工气候箱中进行饲养观察，统计发育指标，统计频率为1次/24h。
46.处理组和对照组皆处理15头，各重复3次。统计结果如图1～2所示。
47.由图1以及spss单因素差异性结果可以看出，饲喂可食用色素的处理组与ddh2o的对照组的各时间点的累计化蛹率没有明显差异。可食用色素对棉铃虫幼虫化蛹历期无显著性影响。
48.由图2以及spss单因素差异性分析结果可以看出，饲喂可食用色素的处理组与饲喂ddh2o的对照组之间蛹重没有显著性差异。
49.由图1和图2可以得出，可食用色素对棉铃虫的生长发育没有显著性影响。
50.实施例2利用本发明的方法进行生物测定简便高效
51.本实例中采用传统的生物测定方法和本发明的生物测定方法，对棉铃虫胃毒nasnpv，对两种方法进行比较。
52.1、试剂及材料准备
53.本实例中饲喂的nasnpv悬浮液浓度皆为4*107obs/ml，病毒悬浮液的具体配置方法为：采用科云生物有限公司购买的浓度为50亿obs/ml的nasnpv原液，用ddh2o进行梯度稀释，配置成1000μl的4*107obs/ml的病毒悬浮液。
54.生物测定试剂的具体配置方法为：向所述的病毒悬浮液中添加2μl的可食用色素，制得。
55.提前挑取足够数量3龄末的棉铃虫于塑料养虫盒中，进行12h饥饿处理，备用。
56.2、生物测定方法及结果
57.(1)传统生物测定方法：将2.5μl病毒悬浮液滴加在提前切好的的人工饲料(0.5cm*0.5cm*0.1cm)上，饲喂棉铃虫，时间大约为12h，挑取胃毒结束的棉铃虫，加入正常的人工饲料饲养，并进行相关生长指标的观察记录。
58.(2)本发明的生物测定方法：直接向含有提前饥饿处理好的棉铃虫(4龄1天)的塑料盒底部滴加2.5μl的生物测定试剂直接饲喂。
59.观察食用情况，当大部分(90％)棉铃虫皆接毒结束时，向有棉铃虫的养虫盒中添加正常的人工饲料，剔除未吃完生物测定试剂或处理饲料的棉铃虫。将处理好的棉铃虫放入人工气候箱中进行饲养观察，统计发育指标，统计频率为1次/24h。
60.将传统生物测定方法和本发明的生物测定方法各重复3次，统计结果如图3所示。
61.由图3以及spss单因素差异性分析结果可以看出，利用传统方法和本发明中的方法进行生物测定时，其各个时间段的累计死亡率无显著性差异。
62.另外，通过饲喂过程，利用可食用色素进行胃毒实验，平均每头健康棉铃虫接毒结束的时间在10min以内。而传统方法利用人工饲料进行胃毒实验，平均每头健康棉铃虫接毒结束的时间大约需要12h。因此，利用可食用色素进行胃毒实验，个体之间接毒结束时间差异小(10min以内)，而传统的方法进行胃毒实验，个体之间接毒结束时间差异大，并且难以估计接毒结束的准确时间。
63.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。