一种白囊耙齿菌及其筛选方法及在降解林木废弃物的应用与流程

1.本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一种白囊耙齿菌及其筛选方法及在降解林木废弃物中的应用。


背景技术：

2.近年，我国林业、园林绿化等行业发展迅速，成效显著，但林木废弃物也随之快速增加。林木废弃物也称为林木剩余物，是指采伐、木材加工和造材利用后的剩余物，包括枯枝、落叶、枝桠、梢头、锯末、灌木、枯倒木、园林修剪物等。我国每年都会生产出大量的林木废弃物，在造成资源浪费的同时，病死木也会影响森林的健康，因此如何高效利用和处理林木废弃物成为了不得不面对的问题。
3.白囊耙齿菌是主要寄生于木材并促使木材发生腐朽的一类真菌，多数既可降解阔叶树，也可降解针叶树。白囊耙齿菌借助菌丝和孢子侵入木质材料中，并通过分泌多种酶破坏木质纤维的细胞壁，从而降解木质素、纤维素、半纤维素几种大分子化合物。通过研究筛选出一株可以高效降解林木废弃物的菌株，使林木废弃物可以循环利用，节约资源。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种白囊耙齿菌及其筛选方法及在降解林木废弃物的应用。
5.本发明提供一种白囊耙齿菌irpex lacteus，菌株编号为m2
‑
1，并保存在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctcc no:m2021623，保藏日期为：2021.5.27。
6.本发明还提供一种筛选如前述所述的白囊耙齿菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：
7.(1)菌株采集：将采集于南京林业大学北大山、长有白囊耙齿菌菌丝的松木木段，用75％的酒精喷洒表面消毒，待酒精挥发后，在超净工作台中用无菌的解剖刀挑取木段上的菌丝，将菌丝移接到无菌的pda培养基上，将培养基放在25℃，相对湿度为40％的培养箱中避光培养3
‑
5天，菌丝生长至平板的二分之一再移接至斜面pda培养基，待菌丝长满斜面后，放入4℃冰箱保存；(2)漆酶检测：将步骤(1)培养所得的菌株从冰箱取出，在基础pda平板培养基上活化，待菌丝长至平板三分之二时，用6mm的打孔器把基础pda培养基中的菌落打成菌饼，接入pda
‑
愈创木酚培养基上，培养六天，观察培养基上红棕色变色圈大小；
8.(3)木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶检测：将步骤(1)培养所得的菌株从冰箱取出，接种于pda
‑
苯胺蓝培养基上，培养六天，观察培养基上产生褪色圈大小；
9.(4)纤维素酶检测：将步骤(1)培养所得的菌株，接种于羧甲基纤维素钠培养基，培养六天，用刚果红染色，氯化钠固定后，观察培养基上产生透明圈大小；
10.(5)经步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)检测，将均能在相应培养基中产生色圈的菌株保藏；
11.(6)菌株鉴定：采用真菌核糖体基因组转录间隔区internal transcribed spacer和rna聚合酶1两对通用引物对菌株dna进行pcr扩增，而后在ncbi上进行blast同源比对分析。
12.作为优选，步骤(2)中所述pda
‑
愈创木酚培养基是在基础pda培养基中加入终浓度0.5g/l的愈创木酚制成的。
13.作为优选，骤(2)中所述的pda
‑
苯胺蓝培养基是在基础pda培养基中加入终浓度0.1g/l的苯胺蓝制成的。
14.作为优选，步骤(4)中所述羧甲基纤维素钠培养基包括有0.25g/l磷酸氢二钾，0.1g/l七水合硫酸镁，5g/l羧甲基纤维素钠，0.5g/l硫酸铵，15g/l琼脂粉或20g/l琼脂条。
15.本发明还提供一种如前述所述的白囊耙齿菌菌株在降解林木废弃物中的应用。
16.本发明还提供一种用于降解林木废弃物的菌剂，包含如前述所述的白囊耙齿菌菌株。
17.与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
18.1、本发明使用白囊耙齿菌降解林木废弃物，可以加速林木废弃物的分解，帮助我们净化环境。
19.2、本发明利用白囊耙齿菌是一种高效的生物堆肥菌，降解过后的林木废弃物制造微生物肥料，增强生物肥效。
20.保藏说明
21.白囊耙齿菌菌株，菌株编号为m2
‑
1，并保存在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctcc no:m 2021623，保藏日期为：2021.5.27。
22.上述内容仅是本发明技术方案的概述，为了更清楚的了解本发明的技术手段，下面结合附图对本发明作进一步的描述。
附图说明
23.图1为该菌株酶活随时间的变化图；
24.其中，1
‑
a为产漆酶酶活随时间的变化图，1
‑
b为木质素过氧化物酶酶活随时间变化图，1
‑
c为锰过氧化物酶酶活随时间的变化图；
25.图2为白囊耙齿菌菌株对三种木材试样的质量降解情况图；
26.图3为白囊耙齿菌菌株对三种木材试样的木质素降解情况图；
27.图4为菌株m2
‑
1基于its、rpb1两个基因构建的系统发育树。
具体实施方式
28.为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明所使用的试剂葡萄糖，无水乙醇，琼脂粉，七水合硫酸镁，磷酸二氢钾，维生素b1，磷酸氢二钾，苯胺蓝，愈创木酚，羧甲基纤维素钠，硫酸铵，氯化钠，刚果红，氢氧化钠，浓盐酸，冰醋酸，乙酰溴，碱性木素，以上试剂均为国产分析纯。漆酶试剂盒、锰过氧化物酶试剂盒、木质素过氧化物酶试剂盒均购自苏州科铭生物技术有限公司。
29.所述基础pda培养基包括：20g/l葡萄糖，200g/l土豆，15g/l琼脂粉或20g/l琼脂条；所述pd培养基为：不添加琼脂的pda培养基；所述zpda(综合培养基)培养基包括：20g/l
葡萄糖，200g/l土豆，6.15g/l七水合硫酸镁，3g/l磷酸二氢钾，0.05g/l维生素b1，15g/l琼脂粉，121℃，20分钟灭菌后在超净台中用0.5mol/l的hcl和0.5mol/l的naoh调节其ph值；所述zpd培养基为：不添加琼脂的zpda培养基；所述苯胺蓝培养基：在基础pda培养基中加入0.1g/l的苯胺蓝制成苯胺蓝培养基；所述pda
‑
愈创木酚培养基：在基础pda培养基中加入0.5g/l的愈创木酚制成愈创木酚培养基；所述羧甲基纤维素钠(cmcna)培养基：0.25g/l磷酸氢二钾，0.1g/l七水合硫酸镁，5g/l羧甲基纤维素钠，0.5g/l硫酸铵，15g/l琼脂粉或20g/l琼脂条。
30.所用实验仪器与设备为hh
‑
4型数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司，mir
‑
553型恒温培养箱：日本sanyo electric co.ltd，dgg
‑
9070型电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司，scb
‑
1360js型超级洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司，标准振荡培养箱：伊孚森生物技术(中国)有限公司，mti
‑
201b型多室多温度梯度恒温培养箱：上海技舟化工科技有限公司，mdf
‑
u333型冰箱：日本sanyo electric co.ltd：全波长酶标仪，thermo electron corporation，温流稳压电泳仪，北京市六一仪器厂。
31.菌株鉴定：对采集所得的菌丝，采用真菌核糖体基因组转录间隔区internal transcribed spacer(its)和rna聚合酶1(rna polymerase 1，rpb1)两对通用引物对菌株dna进行pcr扩增，而后在ncbi上进行blast同源比对分析，并下载相似菌株的序列以及其他近缘种序列作为参考；
32.用bioedit进行多序列比，之后使用phylosuite1.2.1软件的concatenate sequence程序将不同基因序列串联，并用modelfinder程序建立最佳建树模型，用iq
‑
tree构建最大似然法系统发育树，结果如图4所示。
33.由图4可知，菌丝与irpex lacteus fd
‑
9为同一分枝，亲缘关系最为接近，结合形态学鉴定为i.lacteus，菌株编号为m2
‑
1。
34.实施例1
35.菌株采集：将采集于南京林业大学北大山、长有白囊耙齿菌菌丝的松木木段，用75％的酒精喷洒表面消毒，待酒精挥发后，在超净工作台中用无菌的解剖刀挑取木段上的菌丝，将菌丝移接到无菌的pda培养基上，将培养基放在25℃，相对湿度为40％的培养箱中避光培养3
‑
5天，菌丝生长至平板的二分之一再移接至斜面pda培养基，待菌丝长满斜面后，放入4℃冰箱保存；
36.实施例2
37.将实施例1培养所得的菌株，在基础pda平板培养基上活化，待菌丝长至平板三分之二时，用6mm的打孔器把基础pda培养基中生长至培养皿2/3的菌落打成菌饼，接入pda
‑
愈创木酚培养基上，培养六天，观察培养基上得到红棕色变色圈，则该菌株可产生漆酶。
38.实施例3
39.木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶检测：将实施例1培养所得的菌株，接种于pda
‑
苯胺蓝培养基上，培养六天，观察培养基上产生褪色圈，则该菌株可产生木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。
40.实施例4
41.纤维素酶检测：将实施例1培养所得的菌株，接种于羧甲基纤维素钠培养基，培养六天，用刚果红染色，氯化钠固定后，观察培养基上产生透明圈，则该菌株可产生纤维素酶。
42.实施例5
43.将实施例1得到的白囊耙齿菌菌株在pda培养基25℃恒温培养，待菌落直径长到培养皿2/3时，用6mm的打孔器打成菌饼，选取菌落外缘菌饼接于500ml锥形瓶装入200ml的pd培养基中，每瓶接入6个菌饼，每株菌3个重复，放于标准振荡培养箱28℃，160r/min培养16d，从开始培养的第4天开始在无菌条件下吸取培养液，此后每次取样时间间隔一天，取得的培养液要经4层纱布过滤，然后将培养液在6000r/min，10min的条件下离心，离心所得的上清液即为粗酶液。
44.使用试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)对供试菌株的粗酶液进行三种酶的活性测定，测定方法严格按照试剂盒说明书中步骤执行，结果如图1所示。
45.由图1
‑
a可知，在菌株的生长过程中，漆酶的活性先是缓慢增长，接着快速增长在第12d达到酶活高峰，之后的酶活开始下降，菌株m2
‑
1的产漆酶能力较好，在第12d达到酶活高峰时，漆酶活性为12u/ml；由图1
‑
b可知，木质素过氧化物酶活性产酶活趋势同漆酶酶活相同，且都在第12d达到酶活高峰，菌株m2
‑
1在12d的产酶活性为1.85u/ml；由图1
‑
c可知，锰过氧化物酶的酶活与漆酶和木质素过氧化物酶略有不同，在第12d才达到产酶高峰，此时酶活为4.21u/ml。
46.实施例6
47.白囊耙齿菌菌株在降解林木废弃物的应用
48.把樟子松、毛白杨、杉木三种木材锯末放入65℃的电热恒温鼓风干燥箱内烘至恒重，然后分别称取三种木材的锯末各5g置于240ml的玻璃组培瓶中，每种木材试样使用电子天平称重精确至0.001g，每瓶中加入20ml蒸馏水，搅拌均匀后放入高温蒸汽灭菌锅121℃，20min灭菌；
49.将实施例1培养所得白囊耙齿菌菌株用6mm打孔器打成菌饼，在无菌条件下，每个组培瓶中均加入6个菌饼，每株菌重复三瓶，放入消毒过的培养箱，在不添加任何外源和内源营养物质的条件下，放置于温度为28℃的恒温静置培养，使木屑在组培瓶内受白囊耙齿菌菌株侵染；
50.在恒温培养箱中培养三个月后取出木材试样，轻轻刮去表面菌丝，把去除菌丝后的木材试样放在65℃的烘箱中烘干至恒重，在电子天平中称重，计算受菌侵染后木材试样的质量损失情况，所得结果如图2所示。
51.计算公式：木材试样质量损失率＝(w1
‑
w2)/w1
×
100％(式中：w1是木材试样降解前的绝干质量，w2是木材试样降解后的绝干质量。)
52.由图2可知，白囊耙齿菌菌株m2
‑
1对三种木材的分解能力各不相同，在对三种木材试样的降解中，对杨树的降解效果最好，菌株m2
‑
1对杨树降解的质量损失率最好，达到了38.53％，供试菌株对杉木和松木的木材试样的降解效果最差，经菌株m2
‑
1处理后的木材试样，杉木的质量损失率为6.6％，松木的质量损失率为9.27％。
53.经白囊耙齿菌菌株m2
‑
1处理的三种木材试样采用乙酰溴法进行木质素含量的测定，从而计算其木质素的降解率，质量损失率的情况如图3所示。
54.由图3可知，在杨树的木材试样中，经菌株m2
‑
1处理后，木质素含量有了明显的下降，m2
‑
1对杨树的木质素降解率最高为9.96％，m2
‑
1对杉木的木质素降解率最低为4.78％。
55.白囊耙齿菌菌株m2
‑
1在三种木材试样中都表现较好，其中，对杨树的降解效果最
好。木材主要是由木质素、纤维素、半纤维素这些大分子化合物构成，这三种成分约占木材干重的97％
‑
99％。这三种成分在针叶树和阔叶树中的含量也不同，在针叶树中，木质素的含量高于阔叶树种，而对于阔叶树种而言，其纤维素和半纤维素的含量高于针叶树，松木和杉木属于针叶树，其抗腐能力要比杨木强，因此，菌株m2
‑
1在松木和杉木上的木质素降解效果不如对杨树的木质素降解效果好。
56.附录：m2
‑
1菌株的基因序列
57.its:
58.cggggggaggtctaccctgatttgagctcagattgtcaaatgattgtctcggcaaggagacggttcgaagcatgaacaccataaatacttcaacaccacagcgcagataattatcacactgagggcgatccgtaagattcacgctaatgcatttcagaggagtcgaccgacaagggccgacacaacctccaagtccaagcccgctaaaccttcattacaaaaatttaggggttgagaataccatgagactcaaacaggcatactcctcggaataccaaggagtgcaaggtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgcgagagccaagagatccgttgctgaaagttgtatataaatgtgttatacacagttgacattctataactgaagcgtttgtagtaaaacataagaaagaaaaacggcttgttcaaccgaagacctctcgcgagatcctggaagcttccaccatttttttctcttacataaagtgcacagaggttaagagtggatgagccaggcgtgcacatgcctcgtgagaggccagctacaacccgttcaaaactcgataatgatccttccgcaggttcacctacggaaaccttgttacgacttttacttcca
59.rpb1：
60.tgggtgtgagtcttttatacatataaatctattaaccacgtcaaaacatgaacagcacgtgagttgtacctgtagaagctgctcgaactcggtgatgacgtgagccggagcaccctcctgttcgcatcgacggacattggccgaggctttgatgatatcacctagcttgtatgtcaaatcatcttcgctacgcatcgttccaccatcgacagctatactggggcgcactggaggcggaggcacgggtagaactgtgaggatcatccactctggacgcgcgtactcgtctgagaggccgagaagatggagatctgagtctgacatcttcttcagggcggtgtaaacttcatgtggagggaatagcctcttgtctggttgtaagctcttcacctcctatgctgaggaatcagaatgctgtgaataagctatgaccgcgcgatacaaacctcgtcgtcatccttggatcgcttgtattggacaaaaagcttgaggccctctttccgaatctgcggctgcgctgcgccacatccaccgtggccacgtttgggctcgtcaccatccgctccatcttcctccttgggctcgtccggttcgcagaccattttgcctttgcaatagttccataccacctgcatacgtgccttcgggtcccggacgtgtctgatcttgtcagcaaacgctgagtccgacttacaacgcattttcggtcacacaagcgtagtagttgagaacatacagatcaagacgttagcaatgttactaagagtataactccttgcggtgacaacaccaaaataaataggggggcaatgaatgtcgcgtacaaagttgcaagcccacccagattcactcgacctgcgtcaccgggagcatctggggccagttatcgcggcgagcttaaccaacgccggatattactatttttccgcatcctcgctcagcccccttttcaacacgcaactacgtgtccaacc
61.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何的简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。