基于突变的MYBPC3基因的肥厚型心肌病检测试剂盒的制作方法

基于突变的mybpc3基因的肥厚型心肌病检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域，尤其涉及基于突变的mybpc3基因的肥厚型心肌病检测试剂盒。


背景技术：

2.肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，hcm)是一种以室间隔肥厚为主的常染色体显性遗传性心肌病，具有家族聚集性，主要病因为编码肌小节蛋白的基因发生突变，以mybpc3基因和myh7基因突变为主，mybpc3基因以无义突变和插入/缺失变异为主，可能会引起移码而产生截断蛋白。
3.mybpc3基因编码肌球蛋白c的心脏亚型，主要在心肌中表达。肌球蛋白c是横纹肌a条带跨桥承载区(c区)发现的肌球蛋白。camp依赖性蛋白激酶在肾上腺素能刺激下调节体内心脏亚型的磷酸化，可能与心脏收缩的调节有关。mybpc3基因突变与常染色体显性/隐性遗传的肥厚型心肌病4型，常染色体显性遗传的扩张型心肌病1mm型和常染色体显性遗传的左室致密化不全10型有关。
4.虽然目前已发现许多与肥厚型心肌病有关的mybpc3突变位点，但仍存在大量未知的突变位点，进一步发现新的mybpc3基因突变位点将有助于进一步研究肥厚型心肌病，对肥厚型心肌病的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对肥厚型心肌病，提供一种基于突变的mybpc3基因的肥厚型心肌病检测试剂盒。
6.本发明提供的技术方案如下：
7.一、本发明提供一种突变的mybpc3基因，在基因组位置chr11:47360225处，插入碱基a；参考基因组版本是grch37。
8.优选地，在基因组位置chr11:47360210
‑
chr11:47360260处，突变的mybpc3基因的序列为seq id no:2。
9.二、本发明还提供了肥厚型心肌病检测试剂盒，包括用于扩增突变的mybpc3基因的引物。
10.优选地，引物的序列为seq id no:5和seq id no:6。
11.三、本发明的原理和有益效果在于：
12.本发明公开的突变的mybpc3基因可以作为临床辅助诊断肥厚型心肌病的生物标志物，对肥厚型心肌病的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义；基于突变的mybpc3基因开发的检测试剂盒，可以将诊断携带突变的mybpc3基因的患者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。
附图说明
13.图1为实施例1的家系图；
14.图2为实施例1中先证者的sanger测序图；
15.图3为实施例1中家系中非患病成员sanger测序图。
具体实施方式
16.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
17.实施例1
‑
先证者验证实验
18.样本来源：中国医学科学院阜外医院，在先证者(男，8岁)及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5
‑
10ml全血样本，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
19.先证者临床概况：
20.表1先证者临床概况
[0021][0022][0023]
采用sanger测序法对先证者及其家属的mybpc3基因进行基因检测，具体步骤如下：
[0024]
s1、提取基因组dna；
[0025]
采用江苏百世诺医疗科技有限公司的磁珠法全血基因组dna提取试剂对先证者及其家属的人类全血edta抗凝样本进行全基因组dna的提取，对dna的浓度和纯度进行检测。
[0026]
s2、使用经设计的引物组合对mybpc3基因进行扩增；
[0027]
上游引物(mybpc3
‑
e23f，seq id no:5)：5'ccaggtcccgtgacaaagcta 3'；
[0028]
下游引物(mybpc3
‑
e23r，seq id no:6)：5'tggctctctgctcagtgctc 3'；
[0029]
长度：620bp。
[0030]
扩增试剂使用江苏康为世纪生物科技有限公司生产的2
×
taq master mix(dye)。扩增体系：2
×
taq master mix(dye)25μl；上下游引物(10um)各1μl；dna模板<0.5μg；用ddh2o补至50μl。
[0031]
将反应体系混合，在pcr仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，76℃延伸30s，共35循环。76℃终延伸5min。
[0032]
取2μl的pcr产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，选用1000bp marker作为参考。
[0033]
s3、采用3730xl genetic analyzer全自动测序仪对pcr产物进行测序。从ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对。
[0034]
实验结果：
[0035]
(1)本实施例发现先证者携带突变的mybpc3基因，具体检测结果如下表2所示
[0036]
表2突变的mybpc3基因的具体检测结果
[0037]
基因基因组位置转录本号碱基改变氨基酸改变参考基因组版本mybpc3chr11:47360225nm_000256c.2153_2154insap.leu718leufster2grch37/hg19
[0038]
在基因组位置chr11:47360210
‑
chr11:47360259处，野生型mybpc3基因的序列为seq id no:1：gatctcaccccaactctgcacccccccagctgctgtgtgagaccgagggc。g为基因组位置chr11:47360225处。
[0039]
在基因组位置chr11:47360210
‑
chr11:47360260处，突变mybpc3基因的序列为seq id no:2：gatctcaccccaactctgcacccccccagctgctagtgtgagaccgagggc，a为在基因组位置chr11:47360225处插入的碱基。
[0040]
野生型mybpc3基因编码dna的参考序列为seq id no:3：
[0041]
atgcctgagccggggaagaagccagtctcagcttttagcaagaagccacggtcagtggaagtggccgcaggcagccctgccgtgttcgaggccgagacagagcgggcaggagtgaaggtgcgctggcagcgcggaggcagtgacatcagcgccagcaacaagtacggcctggccacagagggcacacggcatacgctgacagtgcgggaagtgggccctgccgaccagggatcttacgcagtcattgctggctcctccaaggtcaagttcgacctcaaggtcatagaggcagagaaggcagagcccatgctggcccctgcccctgcccctgctgaggccactggagcccctggagaagccccggccccagccgctgagctgggagaaagtgccccaagtcccaaagggtcaagctcagcagctctcaatggtcctacccctggagcccccgatgaccccattggcctcttcgtgatgcggccacaggatggcgaggtgaccgtgggtggcagcatcaccttctcagcccgcgtggccggcgccagcctcctgaagccgcctgtggtcaagtggttcaagggcaaatgggtggacctgagcagcaaggtgggccagcacctgcagctgcacgacagctacgaccgcgccagcaaggtctatctgttcgagctgcacatcaccgatgcccagcctgccttcactggcagctaccgctgtgaggtgtccaccaaggacaaatttgactgctccaacttcaatctcactgtccacgaggccatgggcaccggagacctggacctcctatcagccttccgccgcacgagcctggctggaggtggtcggcggatcagtgatagccatgaggacactgggattctggacttcagctcactgctgaaaaagagagacagtttccggaccccgagggactcgaagctggaggcaccagcagaggaggacgtgtgggagatcctacggcaggcacccccatctgagtacgagcgcatcgccttccagtacggcgtcactgacctgcgcggcatgctaaagaggctcaagggcatgaggcgcgatgagaagaagagcacagcctttcagaagaagctggagccggcctaccaggtgagcaaaggccacaagatccggctgaccgtggaactggctgaccatgacgctgaggtcaaatggctcaagaatggccaggagatccagatgagcggcagcaagtacatctttgagtccatcggtgccaagcgtaccctgaccatcagccagtgctcattggcggacgacgcagcctaccagtgcgtggtgggtggcgagaagtgtagcacggagctctttgtgaaagagccccctg
tgctcatcacgcgccccttggaggaccagctggtgatggtggggcagcgggtggagtttgagtgtgaagtatcggaggagggggcgcaagtcaaatggctgaaggacggggtggagctgacccgggaggagaccttcaaataccggttcaagaaggacgggcagagacaccacctgatcatcaacgaggccatgctggaggacgcggggcactatgcactgtgcactagcgggggccaggcgctggctgagctcattgtgcaggaaaagaagctggaggtgtaccagagcatcgcagacctgatggtgggcgcaaaggaccaggcggtgttcaaatgtgaggtctcagatgagaatgttcggggtgtgtggctgaagaatgggaaggagctggtgcccgacagccgcataaaggtgtcccacatcgggcgggtccacaaactgaccattgacgacgtcacacctgccgacgaggctgactacagctttgtgcccgagggcttcgcctgcaacctgtcagccaagctccacttcatggaggtcaagattgacttcgtacccaggcaggaacctcccaagatccacctggactgcccaggccgcataccagacaccattgtggttgtagctggaaataagctacgtctggacgtccctatctctggggaccctgctcccactgtgatctggcagaaggctatcacgcaggggaataaggccccagccaggccagccccagatgccccagaggacacaggtgacagcgatgagtgggtgtttgacaagaagctgctgtgtgagaccgagggccgggtccgcgtggagaccaccaaggaccgcagcatcttcacggtcgagggggcagagaaggaagatgagggcgtctacacggtcacagtgaagaaccctgtgggcgaggaccaggtcaacctcacagtcaaggtcatcgacgtgccagacgcacctgcggcccccaagatcagcaacgtgggagaggactcctgcacagtacagtgggagccgcctgcctacgatggcgggcagcccatcctgggctacatcctggagcgcaagaagaagaagagctaccggtggatgcggctgaacttcgacctgattcaggagctgagtcatgaagcgcggcgcatgatcgagggcgtggtgtacgagatgcgcgtctacgcggtcaacgccatcggcatgtccaggcccagccctgcctcccagcccttcatgcctatcggtccccccagcgaacccacccacctggcagtagaggacgtctctgacaccacggtctccctcaagtggcggcccccagagcgcgtgggagcaggaggcctggatggctacagcgtggagtactgcccagagggctgctcagagtgggtggctgccctgcaggggctgacagagcacacatcgatactggtgaaggacctgcccacgggggcccggctgcttttccgagtgcgggcacacaatatggcagggcctggagcccctgttaccaccacggagccggtgacagtgcaggagatcctgcaacggccacggcttcagctgcccaggcacctgcgccagaccattcagaagaaggtcggggagcctgtgaaccttctcatccctttccagggcaagccccggcctcaggtgacctggaccaaagaggggcagcccctggcaggcgaggaggtgagcatccgcaacagccccacagacaccatcctgttcatccgggccgctcgccgcgtgcattcaggcacttaccaggtgacggtgcgcattgagaacatggaggacaaggccacgctggtgctgcaggttgttgacaagccaagtcctccccaggatctccgggtgactgacgcctggggtcttaatgtggctctggagtggaagccaccccaggatgtcggcaacacggagctctgggggtacacagtgcagaaagccgacaagaagaccatggagtggttcaccgtcttggagcattaccgccgcacccactgcgtggtgccagagctcatcattggcaatggctactacttccgcgtcttcagccagaatatggttggctttagtgacagagcggccaccaccaaggagcccgtctttatccccagaccaggcatcacctatgagccacccaactataaggccctggacttctccgaggccccaagcttcacccagcccctggtgaaccgctcggtcatcgcgggctacactgctatgctctgctgtgctgtccggggtagccccaagcccaagatttcctggttcaagaatggcctggacctgggagaagacgcccgcttccgcatgttcagcaagcagggagtgttgactctggagattagaaagccctgcccctttgacgggggcatctatgtctgcagggccaccaacttacagggcgaggcacggtgtgagtgccgcctggaggtgcgagtgcctcagtga，tg为编码dna的参考序列的第2153位和第2154位。
[0042]
c.2153_2154insa表示：与编码dna的参考序列相比，第2153和2154位之间插入碱基a。
[0043]
野生型mybpc3基因编码蛋白为seq id no:4：
[0044]
mpepgkkpvsafskkprsvevaagspavfeaeteragvkvrwqrggsdisasnkyglategtrhtltvrevgpadqgsyaviagsskvkfdlkvieaekaepmlapapapaeatgapgeapapaaelgesapspkgsssaalngptpgapddpiglfvmrpqdgevtvggsitfsarvagasllkppvvkwfkgkwvdlsskvgqhlqlhdsydraskvy
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[0045]
p.leu718leufster2表示：第718位非极性亮氨酸其后蛋白移码表达，并使得其后的第2位氨基酸出现一终止密码子，可能会使蛋白截短表达。
[0046]
查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，esp6500：无，exac：无)。该插入变异使的第718位非极性亮氨酸其后蛋白移码表达，并使得其后的第2位氨基酸出现一终止密码子，可能会使蛋白截短表达。查询interpro数据库，发现该位点不位于蛋白功能域。查询clinvar、hgmd数据库未发现该变异，但该位点的其他变异c.2153delt(p.leu718argfs*36)及该位点下游的多个移码突变c.2163delc(p.glu722argfs*32)、c.2221dupg(p.ala741glyfs*6)等均曾被报导为肥厚型心肌病的致病变异(hgmd数据库)，文献检索未发现该变异与疾病相关的报导。
[0047]
根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异可能会使蛋白截短表达，认为是肥厚型心肌病的高度可疑致病突变。
[0048]
(2)图1为实施例1的家系图；图2为实施例1中先证者的sanger测序图；图3为实施例1中家系中非患病成员sanger测序图。
[0049]
如图1
‑
3所示，先证者携带突变的mybpc3基因c.2153_2154insa变异。先证者携带突变的mybpc3基因遗传自先证者母亲，先证者母亲携带突变的mybpc3基因遗传自先证者外公。另外，先证者的姑姑、先证者弟弟均携带了突变的mybpc3基因。
[0050]
实施例2
‑
肥厚型心肌病检测试剂盒
[0051]
本实施例提供用于检测人类mybpc3基因c.2153_2154insa杂合错义变异的试剂盒，包括2
×
taq mastermix(dye)、能够检测突变的mybpc3基因的引物等，试剂盒的具体组成如下表3所示。
[0052]
利用本试剂盒筛选具有c.2153_2154insa mybpc3基因突变的患者的具体步骤为：按照实施例1的步骤提取待测者dna，然后使用经设计的引物组合(seq id no:5和seq id no:6)对mybpc3基因进行扩增，得到pcr产物，最后对pcr产物进行测序。从ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对，判断待测者mybpc3基
因是否携带c.2153_2154insa杂合错义变异，协助临床确诊待测者是否患有具有c.2153_2154insa mybpc3基因突变的患者。
[0053]
表3试剂盒组成
[0054][0055][0056]
实施例3针对家系外的正常人的突变验证
[0057]
参照实施例1的方法或采用实施例2提供的肥厚型心肌病检测试剂盒，对390例同种族无关正常人(即家系外正常人)进行mybpc3基因c.2153_2154insa突变位点检测，结果均未检测到该突变的mybpc3基因。
[0058]
综上结果，基于mybpc3基因的c.2153_2154insa杂合错义变异会导致mybpc3基因编码的蛋白质发生p.ter173gly的改变，而mybpc3基因是已知的致病基因，从而再次证明了mybpc3基因的c.2153_2154insa杂合错义变异为致病突变。
[0059]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。