促进透明质酸与胶原蛋白相互作用的组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及食品、化妆品或医药的技术领域，尤其涉及一种双重促进透明质酸与胶原蛋白相互作用的组合物及其应用。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid，ha)是一种由n
‑
乙酰氨基葡萄糖和d
‑
葡萄糖醛酸为结构单元的高分子黏多糖，因其具有独特的分子结构和理化性质，在人身体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质、水、电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。透明质酸添加到保健食品中，可作口服使用，而且有明显的美容保健功效。口服含有透明质酸的美容保健品是全身性作用，是由真皮至表皮增加内源性透明质酸的含量，使细胞活化，发挥全身作用，与化妆品局部使用具有明显的不同。表面的美容主要考虑对表皮的护理，而皮肤的主要成分为真皮，真皮主要由胶原蛋白组成，随着年龄的增长，皮肤的老化是由胶原蛋白减少所引起，而胶原蛋白的多少是与具有保水作用的透明质酸的多少息息相关的。
3.胶原蛋白(collagen)是一种生物性高分子物质，是由3条肽链组成的螺旋形纤维状蛋白，是细胞外基质的构结蛋白质，皮下真皮组织的70％是由胶原蛋白所组成的，是人体内含量最丰富的蛋白质。胶原蛋白约占人体蛋白质总量的30％，相当于人体重的6％，它遍及全身的每个组织器官，是维持皮肤与组织器官形态、结构的主要成分，也是修复各损伤组织的重要的原料物质。同时也是身体保持年轻、防止老化的物质。另外，胶原蛋白还可以预防疾病，改善体质，对美容和健康都很有很大的帮助。
4.氨基丁酸(γ
‑
aminobutyric acid，gaba)是一种广泛分布在动植物体内的小分子量非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统的抑制性递质，是脑组织中最重要的神经递质之一，具有降低神经元活性，抑制焦虑信息传入人脑中枢，镇静神经而抗焦虑、抗皮肤老化等多种作用。
5.透明质酸和胶原蛋白作为食品、化妆品和医药领域的原料物质，两者共同应用十分普遍，具有协同增效、相互促进合成的作用，其相互作用机制为透明质酸进入人体细胞后，可以促使ⅰ和ⅲ型胶原蛋白mrna的表达上调，从而起到增加胶原蛋白合成的作用。而胶原蛋白可以通过提升人皮肤成纤维细胞fb有丝分裂、增殖，以及激活透明质酸合成酶2(hyaluronic acidsynthetase ii,has2)的转录，促进mrna水平提升，进而起到促进透明质酸的合成。
6.专利cn103768585b的鹿胶原蛋白营养组合物，提供了一种以鹿胶原蛋白为主要成分，辅以氨基葡萄糖、透明质酸、大豆异黄酮及抗氧化作用的茶多酚形成了具有增强骨密度、能够显著改善骨质疏松的营养组合物。
7.专利申请cn108201523a的一种含胶原蛋白的保湿美白精华液，提供了一种由植物提取物、胶原蛋白、透明质酸、甘油、去离子水组成的精华液产品，具有抗衰老、保湿、美白等效果。
8.氨基丁酸作为一种新兴的原料，不仅可以应用于医药领域，在食品和化妆品领域的应用也日益突出。除本身具有的镇静安神功效外，还对透明质酸和胶原蛋白均具有增强其合成的作用。氨基丁酸促进透明质酸合成的机制为：氨基丁酸可以提高成纤维细胞的存活率、刺激成纤维细胞、参与成纤维细胞的增殖分裂，而成纤维细胞具有产生额外细胞基质(ecm)的特征，即包括透明质酸、弹性蛋白和胶原蛋白等。氨基丁酸促进胶原蛋白合成的机制为受体介导机制，氨基丁酸可以控制成纤维细胞活性，能够显着增加原弹性蛋白酶转录子的表达和增加成纤维细胞中弹性纤维的形成。并且其可以被成纤维细胞代谢，参与细胞的能量代谢途径。市面上氨基丁酸、透明质酸和胶原蛋白三种物质的协同应用大多以两两组合为主。
9.专利cn105362091b提供了一种含γ
‑
氨基丁酸和透明质酸的组合物及其在化妆品中的应用，包括γ
‑
氨基丁酸和透明质酸或其盐，能显著改善、降低γ
‑
氨基丁酸对皮肤的不良反应，克服了单独使用γ
‑
氨基丁酸对皮肤的刺激，提高了γ
‑
氨基丁酸在化妆品中的含量，能快速祛皱，长效补水，使皮肤年轻化。
10.专利申请cn109953348a的一种有助于睡眠的胶原蛋白粉，提供了一种具有安定精神、镇静作用的组合物，能显著改善睡眠情况，尤其适用于睡眠状况不佳者食用。
11.专利cn103719995b的一种胶原蛋白神经酰胺饮品，提供了一种含有胶原蛋白、神经酰胺、γ
‑
氨基丁酸、维生素c的饮品，能作用于皮肤表皮角质层与真皮层，补充胶原蛋白与神经酰胺，可缓解压力，具有显著改善皮肤水分效果的口服饮品。
12.专利申请cn106723000a的美容养颜的组合物及美容养颜产品，提供了一种鲣鱼弹性蛋白肽、鱼胶原蛋白肽以及伽马氨基丁酸的组合物，可以提高皮肤水分含量、透明质酸含量以及胶原蛋白含量。
13.三者共同应用的实例不多，并且大多应用只是用到了三种物质各自的性质，并未体现氨基丁酸对透明质酸和胶原蛋白协同增效的双重加成效果。


技术实现要素：

14.为了解决上述问题，本发明提供了一种双重促进透明质酸与胶原蛋白相互作用的组合物，其是以氨基丁酸为促进剂，增强透明质酸和胶原蛋白协同作用。并且通过调节氨基丁酸、透明质酸和胶原蛋白的用量比例，既可以起到协同增效、相互促进作用，也可以在保持原有功效能力的前提下，减少透明质酸和胶原蛋白的用量，降低成本，减少用量太高导致的风险。
15.本发明具体技术方案如下：
16.1.一种组合物，其包含透明质酸或其盐、胶原蛋白和氨基丁酸。
17.2.根据项1所述的组合物，其中，所述透明质酸或其盐选自透明质酸、透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸锌、透明质酸钙、透明质酸镁、乙酰化透明质酸、巯基化透明质酸或轻度交联透明质酸，优选为透明质酸钠。
18.3.根据项1或2所述的组合物，其中，所述胶原蛋白选自ⅰ型胶原蛋白、ⅱ型胶原蛋白、ⅲ型胶原蛋白、
ⅴ
型胶原蛋白、
ⅺ
型胶原蛋白或其寡肽，优选为ⅰ型胶原蛋白。
19.4.根据项1
‑
3中任一项所述的组合物，其中，按重量份计，所述透明质酸或其盐为1
‑
100份，优选为10
‑
100份，进一步优选为50
‑
100份；
20.所述胶原蛋白为100
‑
10000份，优选为1000
‑
10000份，进一步优选为5000
‑
10000份；
21.所述氨基丁酸为1
‑
100份，优选为10
‑
100份，进一步优选为50
‑
100份。
22.5.根据项1
‑
4中任一项所述的组合物，其中，所述透明质酸或其盐的分子量为10k
‑
1000kda，优选为10k
‑
100kda或200k
‑
800kda，进一步优选为30k
‑
50kda或200k
‑
400kda。
23.6.根据项1
‑
5中任一项所述的组合物，其中，所述胶原蛋白的分子量为200
‑
10000da，优选为300
‑
5000da，更优选为500
‑
2000da。
24.7.一种制品，其包括项1
‑
6中任一项所述的组合物，其中，以在制品中所占的质量百分比计，所述组合物为0.1
‑
10％，优选为1
‑
5％。
25.8.根据项7所述的制品，其中，所述制品为食品、化妆品或药品。
26.9.根据项8所述的制品，其中，所述制品还包括辅料，优选的，所述辅料为食品、化妆品或药品上可接受的辅料。
27.10.根据项8或9所述的制品，其中，所述食品为保健食品。
28.11.项1
‑
6中任一项所述的组合物在食品、化妆品或药品领域中的应用。
29.12.根据项11所述的应用，其中，所述食品为保健食品。
30.发明的效果
31.本发明所提供的组合物，透明质酸和胶原蛋白可以相互作用，促进彼此物质的自身合成，而氨基丁酸可以分别促进透明质酸和胶原蛋白各自的合成，因此将氨基丁酸添加到透明质酸和胶原蛋白两者所组成的组合物中，既可以在保持各自功效作用的同时起到协同增效的目的，也可以双重促进透明质酸和胶原蛋白的合成效率，达到“减量增效”的效果，降低成本与使用风险，扩展应用范围和安全性，在食品、化妆品或医药领域中均有很好的应用前景。
具体实施方式
32.下面对本发明做以详细说明。虽然显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
33.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
34.本发明提供了一种组合物，其包含透明质酸或其盐、胶原蛋白和氨基丁酸。
35.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述透明质酸或其盐选自透明质酸、透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸锌、透明质酸钙、透明质酸镁、乙酰化透明质酸、巯基化透明质酸或轻度交联透明质酸，优选为透明质酸钠。
36.所述乙酰化透明质酸是由透明质酸钠经乙酰化反应得到。
37.所述巯基化透明质酸指的是巯基修饰的透明质酸，即以透明质酸为原料，通过活化羧基带入二硫键，再进行还原为巯基，制得巯基化透明质酸。
38.所述轻度交联透明质酸指的是透明质酸经交联剂交联修饰得到的具有三维立体结构的高分子水溶性凝胶。
39.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述胶原蛋白选自ⅰ型胶原蛋白、ⅱ型胶原蛋白、ⅲ型胶原蛋白、
ⅴ
型胶原蛋白、
ⅺ
型胶原蛋白或其寡肽，优选为ⅰ型胶原蛋白。
40.所述ⅰ型胶原蛋白是人体中最丰富的胶原蛋白。它形成大的嗜酸性纤维，称为胶原纤维。它存在于疤痕组织，最终产品时组织愈合通过修复、以及腱、韧带、所述内膜的肌原纤维的有机部分骨，所述真皮中、牙质和器官胶囊。
41.所述ⅱ型胶原蛋白是一种天然存在的蛋白质，存在于人体的透明软骨和关节软骨中。
42.所述ⅲ型胶原蛋白是人体皮肤、筋膜、肌腱中主要的胶原蛋白，是同三聚体，或由三个相同的肽链(单体)组成的蛋白质。
43.所述
ⅴ
型胶原蛋白的肽链由2条α1链和1条α2链或由3条α1链组成，存在3种组装形式。
ⅴ
型胶原分布在细胞周围以及ⅰ型胶原的周围，在基膜和结缔组织之间起着桥梁作用。
44.所述
ⅺ
型胶原蛋白是异三聚体，其组成为α1(
ⅺ
)α2(
ⅺ
)α3(
ⅺ
)，
ⅺ
型胶原是软骨的微量成分，在软骨胶原纤维的形成和软骨基质的组成中起着重要作用，且常与ⅱ型胶原共存。
45.所述寡肽指的是胶原蛋白由水解或酶解得到，分子量段一般在1000道尔顿以下，也称作小肽，寡肽、低聚肽或称为小分子活性肽，一般由4～10个氨基酸组成。
46.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，按重量份计，所述透明质酸或其盐为1
‑
100份，优选为10
‑
100份，进一步优选为50
‑
100份；
47.所述胶原蛋白为100
‑
10000份，优选为1000
‑
10000份，进一步优选为5000
‑
10000份；
48.所述氨基丁酸为1
‑
100份，优选为10
‑
100份，进一步优选为50
‑
100份。
49.例如，按重量份计，所述透明质酸或其盐可以为1份、2份、3份、4份、5份、10份、50份、100份等；
50.所述胶原蛋白可以为100份、200份、500份、1000份、1500份、2000份、2500份、3000份、3500份、4000份、4500份、5000份、5500份、6000份、6500份、7000份、7500份、8000份、8500份、9000份、9500份、10000份等；
51.所述氨基丁酸可以为1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、15份、20份、30份、40份、50份、60份、70份、80份、90份、100份等。
52.对于上述所述的组合物，当使用透明质酸或其盐为1
‑
100份，优选为10
‑
100份，进一步优选为50
‑
100份时，加入胶原蛋白为100
‑
10000份，优选为1000
‑
10000份，进一步优选为5000
‑
10000份以及加入氨基丁酸为1
‑
100份，优选为10
‑
100份，进一步优选为50
‑
100份。
53.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述透明质酸或其盐的分子量为10k
‑
1000kda，优选为10k
‑
100kda或200k
‑
800kda，进一步优选为30k
‑
50kda或200k
‑
400kda。
54.例如，所述透明质酸或其盐的分子量可以为10kda、20kda、30kda、40kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、100kda、150kda、200kda、250kda、300kda、400kda、500kda、
600kda、700kda、800kda、900kda、1000kda等。
55.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述胶原蛋白的分子量为200
‑
10000da，优选为300
‑
5000da，更优选为500
‑
2000da。
56.所述胶原蛋白的分子量指的是重均分子量。
57.所述透明质酸或其盐的分子量指的是重均分子量。
58.例如，所述胶原蛋白的分子量可以为200da、300da、400da、500da、600da、800da、1000da、1500da、2000da、2500da、3000da、3500da、4000da、4500da、5000da、6000da、7000da、8000da、9000da、10000da等。
59.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述组合物由透明质酸或其盐、胶原蛋白和氨基丁酸组成。
60.本发明所提供的组合物，由于使用氨基丁酸作为促进剂，既可以起到协同增效、相互促进作用，也可以在保持原有功效能力的前提下，减少透明质酸和胶原蛋白的用量，降低成本，减少用量太高导致的风险。
61.本发明提供了一种制品，其包括上述所述的组合物，其中，以在制品中所占的质量百分比计，所述组合物为0.1
‑
10％，优选为1
‑
5％。
62.例如，以在制品中所占的质量百分计，所述组合物为0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。
63.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述制品为食品、化妆品或药品。
64.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述制品还包括辅料，优选的，所述辅料为食品、化妆品或药品上可接受的辅料。
65.对于辅料，本发明不作任何限制，其可以根据需要进行确定，例如，所述辅料可以为乳粉、植物食用油、食用着色剂、防腐剂、稳定剂、增稠剂、乳化剂等。
66.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述食品为保健食品。
67.本发明提供了上述所述的组合物在食品、化妆品或药品领域中的应用。
68.在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述食品为保健食品。
69.本发明所述的组合物，透明质酸和胶原蛋白能够彼此促进物质的自身合成，而氨基丁酸作为促进剂，可以促进透明质酸和胶原蛋白各自的合成，因此，本发明所述的组合物，既可以在保持各自功效作用的同时起到协同增效的目的，也可以双重促进透明质酸和胶原蛋白的合成效率，达到“减量增效”的效果，降低成本与使用风险，扩展应用范围和安全性，在食品、化妆品或医药领域中均有很好的应用前景。
70.实施例
71.本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品，其中，透明质酸钠由华熙生物科技股份有限公司，
[0072]ⅰ型胶原蛋白由上海科因实业有限公司提供，
[0073]
氨基丁酸由华熙生物科技股份有限公司(纯度＞98％)
[0074]
人皮肤成纤维细胞由北京北纳创联生物技术研究院提供，
[0075]
dmem高糖型培养基由gibco提供，
[0076]
酶联免疫检测仪由tecan提供。
[0077]
实施例
[0078]
将不同分子量的透明质酸或其盐、不同量的胶原蛋白和氨基丁酸进行混合，即可得到组合物，其中，透明质酸的分子量、胶原蛋白的分子量以及用量如表1和表2所示。
[0079]
对比例
[0080]
按照与实施例1相同的方法将不同分子量的透明质酸或其盐和不同量的胶原蛋白或者不同分子量的透明质酸或其盐和氨基丁酸或者同量的胶原蛋白和氨基丁酸进行混合得到混合物，其中，透明质酸的分子量、胶原蛋白的分子量以及用量如表1和表2所示。
[0081]
表1细胞实验不同分子量、不同用量的组分表
[0082]
[0083][0084]
表2动物实验不同分子量、不同用量的组分表
[0085]
[0086][0087]
注：灌胃剂量是根据人与小鼠体表面积折算后得到，其是通过表1的剂量进行折算得到。
[0088]
实验例1皮肤成纤维细胞增殖实验
[0089]
皮肤成纤维细胞增殖实验采用mtt法分别测定氨基丁酸、透明质酸和胶原蛋白中的两组分组合、三组分叠加对皮肤成纤维细胞增殖率的影响，考察其是否具有协同增效的作用。
[0090]
成纤维细胞培养：将人皮肤成纤维细胞接种至含10％胎牛血清的dmem高糖型培养基，37℃，5％co2细胞培养箱中培养24小时，待细胞接近80％融合，弃掉旧培养基，pbs洗两遍，加入含0.25％胰蛋白酶和0.02％edta的消化液消化，在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，吸除或倒掉消化液，加入适量培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，细胞悬液按1:3传代。
[0091]
将成纤维细胞接种于96孔细胞培养板内，接种密度为1
×
105个/ml，每孔100μl，加入含10％胎牛血清的dmem培养基继续培养，在37℃,5％co2条件的细胞培养箱中培养24小时。
[0092]
加药：常规培养24h后，弃去旧培养液，按表1加入100μl样品，阴性对照组(control)加入等量无血清培养液，空白组无细胞，只加无血清培养液。每个样品4个浓度水平，每个水平6个平行孔。
[0093]
细胞增殖率测定：继续培养24h后，采用wst
‑
1法检测细胞相对增殖率，弃去旧培养液，每孔加入100μl无血清培养液和10μl wst
‑
1，放入细胞培养箱中继续孵育2
‑
4h，于450nm波长处用酶联免疫检测仪测定吸光度。
[0094]
表3组合物对成纤维细胞增殖率的影响
[0095]
[0096][0097]
表3数据可知，透明质酸对成纤维细胞增殖的最优分子量为30kda
‑
50kda和200kda
‑
400kda，最优剂量为100mg/dl；胶原蛋白对成纤维细胞增殖的最优分子量为500da和2000da，最优剂量为10000mg/dl，氨基丁酸的最优剂量为100mg/dl。透明质酸与胶原蛋白、胶原蛋白与氨基丁酸、透明质酸与氨基丁酸两两组合具有协同增效的作用，添加氨基丁酸成分后，可使透明质酸和胶原蛋白的促细胞增殖功效明显增强。三者组合使用，透明质酸：胶原蛋白：氨基丁酸在(50
‑
100)：(5000
‑
10000)：(50
‑
100)区间时，成纤维细胞增殖效果最优。
[0098]
实验例2动物实验
[0099]
实验原理：给光老化模型小鼠口服组合物，测定一个月后光老化小鼠皮肤中透明质酸和胶原蛋白的含量变化。
[0100]
实验动物为昆明小鼠18
‑
20g，雌雄各半，spf级。
[0101]
光老化造模：用10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔麻醉实验用小鼠,并固定小鼠于处置台上，用刀片将鼠背部的毛发剃净，使背部皮肤充分暴露，隔天刮毛1次，将慢性uv损伤组小鼠固定在自制固定器中，确定小鼠背部光照部位，将实验组小鼠置紫外光治疗仪下30cm处，uvb强度0.45mw/cm2，uva强度6.7mw/cm2，最小红斑量根据定为uvb0.07j/cm2，uva定为10倍uvb，即0.7j/cm2，按照公式：辐照时间＝辐照剂量/辐照强度，每周增加0.5个红斑量，1次每天，每周照射5天，共4周；对照组小鼠与uv损伤组小鼠同时进行同环境同饲料饲养。
[0102]
实验分组：实验分为空白对照组、模型对照组以及模型给药组，每组10只，雌雄各半，模型给药组分别给予表2中所述的组合物，空白对照组和模型对照组同步灌胃自来水，实验组灌胃给药和造模同时进行。
[0103]
实验测定：造模给药一个月后，小鼠脱颈处死，背部向上置于处置板上，用酒精消毒之后脱毛，取大小合适的皮肤组织放入ep管中，匀浆处理，离心取上清液，按照透明质酸检测试剂盒和胶原蛋白检测试剂盒(tsz)说明书，测定小鼠皮肤中透明质酸和胶原蛋白含量，其结果如表4所示。
[0104]
表4组合物对光老化模型皮肤中透明质酸含量和胶原蛋白含量的影响
[0105]
[0106][0107]
由表4的数据可知，以空白对照组和模型对照组为参照，透明质酸和胶原蛋白可以明显改善正常小鼠皮肤中的透明质酸和胶原蛋白的合成，并且可以逆转光紫外对小鼠的老化作用，改善皮肤中透明质酸和胶原蛋白的含量；三者共同应用，随着剂量的增加，促合成作用呈正相关。由实施例和对比例可知，低剂量的透明质酸和胶原蛋白组中添加一定剂量的氨基丁酸，与高剂量透明质酸和氨基丁酸组比较，效果等价或者更高，因此氨基丁酸可以起到降低透明质酸和胶原蛋白的成本与使用风险，扩展应用范围和安全性。
[0108]
综上所述，本发明所述的组合物以氨基丁酸为促进剂，增强透明质酸和胶原蛋白的协同作用，既可以起到协同增效、相互促进作用，也可以在保持原有功效能力的前提下，减少透明质酸和胶原蛋白的用量，降低成本，减少用量太高导致的风险。
[0109]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。