一种抗衰老调控蛋白植物提取激活剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及a23l33/105领域，尤其涉及一种抗衰老调控蛋白植物提取激活剂及其制备方法。


背景技术：

2.自从sirtuin蛋白家族被发现以来，其逐渐的成为了抗衰老，抗逆性和人体代谢调节中的非常重要的一类重要沉默调节蛋白质。这其中，被广泛研究和应用的sirtuin蛋白包括有sirtuin
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3、sirtuin
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4、sirtuin
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5三种，它们主要存在于哺乳动物的线粒体当中，参与人体的调节代谢过程。其中尤以内源性的sirtuin
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3是位于细胞线粒体基质中的可溶性蛋白，并且近些年来已经被大量发表文献证明其具有优异的肌肤抗衰来和协助疾病治疗等效用。尤其是，sirtuin
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3对于由氧化应激引起的皮肤衰老情况具有更加优异的修复和抑制作用。在实际的使用过程中，sirtuin蛋白能够在激活剂的激活作用下，显示出更加的效用。
3.现有技术(cn201510268673.x)提供了一种sirt
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1激活剂及其应用，其主要成分为白藜芦醇等物质，而白藜芦醇作为sirtuin蛋白领域中常见的一种常见的激活物质，其在促进sirtuin蛋白的表达量以及抗氧化性方面的性能欠佳。
4.因此，亟需一种能够有效提高进sirtuin蛋白的表达量以及抗氧化性的植物提取激活剂及其产品。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种抗衰老调控蛋白植物提取激活剂，其特征在于：原料至少包括以下成分：丹参植物体，有机溶剂。
6.作为一种优选的方案，所述丹参植物体为丹参的根、叶中的至少一种。
7.作为一种优选的方案，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿，乙二醇、丙二醇、二乙二醇中的至少一种。
8.作为一种更优选的方案，所述有机溶剂为乙醇。
9.作为一种最优选的方案，所述有机溶剂为质量浓度为90％的乙醇溶液。
10.本发明第二方面提出了一种上述抗衰老调控蛋白植物提取激活剂的制备方法，步骤至少包含以下几步：(1)一次回流提取；(2)二次回流提取；(3)回收干燥；(4)混合抽滤；(5)减压浓缩；(6)粉剂合并。
11.作为一种优选的方案，所述一次回流提取的具体操作为：将丹参植物体切碎研磨制成丹参粗粉料；之后将丹参粗粉料放置入提取罐中，加入有机溶剂，加热40～80℃回流反应0.5～2小时，抽滤得滤液i和残渣i。
12.作为一种优选的方案，所述有机溶剂与丹参粗粉料的质量比为7～10:1。
13.作为一种更优选的方案，所述有机溶剂与丹参粗粉料的质量比为8:1。
14.作为一种优选的方案，所述二次回流提取的具体操作为：将提取罐中的残渣i再次加入有机溶剂，加热40～80℃回流反应0.5～1小时，抽滤得滤液ii和残渣ii。
15.作为一种优选的方案，所述有机溶剂与残渣i的质量比为4～6:1。
16.作为一种更优选的方案，所述有机溶剂与残渣i的质量比为5:1。
17.作为一种优选的方案，所述回收干燥的具体操作为：将滤液i和滤液ii混合均匀，经过减压回收有机后真空干燥，得粉末提取物i。
18.作为一种优选的方案，所述混合抽滤的具体操作为：将残渣ii取出，挥干其中残存的有机溶剂，再置入新的提取罐中，加入ph为4～5的盐酸缓冲液，140℃下加热3～6小时，最后抽滤得滤液iii。
19.作为一种优选的方案，所述盐酸缓冲液与残渣ii的质量比为10～15:1。
20.作为一种更优选的方案，所述盐酸缓冲液与残渣ii的质量比为12:1。
21.本技术中，通过加入ph值为4～5的盐酸缓冲液，且控制其与残渣的质量比为12:1时，有效提高了丹参活性物质的提取纯度，并且最终提高了提取激活剂的sirtuin
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3的激活活性。本技术人推测为：弱酸性环境下的盐酸缓冲液在能够保证其溶解强不溶有机物质的同时，将所需活性物质在滤渣中进行解锁释放，减少了滤液中杂质含量。并且另一方面，适量的盐酸缓冲液的存在还能够在滤液中形成正离子带，从而吸附串联负离子杂质胶态分子链串联团聚，从而更容易的过滤提纯，提高提取效率。
22.作为一种优选的方案，所述减压浓缩的具体操作为：将滤液iii减压浓缩，真空干燥得粉状提取物ii。
23.作为一种优选的方案，所述粉剂合并的具体操作为：将粉状提取物i和粉状提取物ii混合搅拌合并。
24.本技术第三方面还提供了一种含有上述抗衰老调控蛋白植物提取激活剂的皮肤外用剂，原料至少包含上述抗衰老调控蛋白植物提取激活剂，二元醇，植物提取物，保湿剂，香精，去离子水补充余量。
25.作为一种优选的方案，所述抗衰老调控蛋白植物提取激活剂的质量含量为0.001～20％。
26.作为一种更优选的方案，所述抗衰老调控蛋白植物提取激活剂的质量含量为1～20％。
27.作为一种最优选的方案，所述含有上述抗衰老调控蛋白植物提取激活剂的皮肤外用剂，原料包括以下质量百分比：抗衰老调控蛋白植物提取激活剂5％，丁二醇5％，银耳提取物2％，甘油1％，甘草酸二钾0.1％，库拉索芦荟叶汁0.5％，紫花前胡根提取物0.5％，辛甘醇0.3％，苯氧乙醇0.3％，乙基己基甘油0.02％，三乙醇胺0.1～2％，香精0.1～1％，去离子水补充余量。
28.有益效果：
29.1、本技术中制备的一种抗衰老调控蛋白植物提取激活剂，具有相比传统激活剂更优异的sirtuin蛋白激活能力，尤其是对于sirtuin
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3的激活能力相比现有技术的激活剂，有效的激发了sirtuin
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3的相对表达能力，具有优异的抗衰老活性。
30.2、本技术制备的一种抗衰老调控蛋白植物提取激活剂，操作方法简单异性，提取反应条件温和无污染，植物成分的利用率和提取率较高，具有优异的丹参活性成分提取作用。
31.3、本技术制备的一种抗衰老调控蛋白植物提取激活剂还可以有效应用于抑制紫
外线诱导的氧化应激引起的皮肤衰老的外用制剂，能够有效的激发肌肤细胞的sirtuin
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3活性，从而明显提高了外用皮肤制剂的抗衰老能力。
附图说明
32.图1为本发明实施例1所制备丹参提取物激活剂与白藜芦醇激活剂和空白对照组的sirtuin
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3蛋白相对表达量测试数据图。
33.图2为本发明实施例1所制备丹参提取物激活剂与白藜芦醇激活剂和空白对照组的ros含量测试数据图。
34.图3为本发明实施例1所制备丹参提取物激活剂与白藜芦醇激活剂和空白对照组的sod2蛋白相对表达量测试数据图。
具体实施方式
35.参选以下本发明的优选实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
36.实施例
37.以下通过实施例对本发明技术方案进行详细的说明，但是本发明的保护范围不局限于所述的所有实施例。如无特殊说明，本发明的原料均为市售。
38.实施例1
39.实施例1第一方面提供了一种抗衰老调控蛋白植物提取激活剂，原料包括丹参的根体和质量浓度90％的乙醇溶剂。
40.本实施例第二方面提供了一种上述抗衰老调控蛋白植物提取激活剂的制备方法，步骤包括：(1)一次回流提取：将丹参的根体切碎研磨制成丹参粗粉料；之后将丹参粗粉料放置入提取罐中，加入乙醇溶剂，加热70℃回流反应1小时，抽滤得滤液i和残渣i；(2)二次回流提取：将提取罐中的残渣i再次加入乙醇溶剂，加热60℃回流反应40分钟，抽滤得滤液ii和残渣ii；(3)回收干燥：将滤液i和滤液ii混合均匀，经过减压回收有机后真空干燥，得粉末提取物i；(4)混合抽滤：将残渣ii取出，挥干其中残存的乙醇溶剂，再置入新的提取罐中，加入ph为5的盐酸缓冲液，140℃下加热4小时，最后抽滤得滤液iii；(5)减压浓缩：将滤液iii减压浓缩，真空干燥得粉状提取物ii；(6)粉剂合并：将粉状提取物i和粉状提取物ii混合搅拌合并。
41.本实施例中，乙醇溶剂与丹参粗粉料的质量比为8:1。
42.本实施例中，乙醇溶剂与残渣i的质量比为5:1。
43.本实施例中，盐酸缓冲液与残渣ii的质量比为12:1。
44.本实施例中，第三方面还提供了一种含有上述抗衰老调控蛋白植物提取激活剂的皮肤外用剂，原料包括以下质量百分比：抗衰老调控蛋白植物提取激活剂5％，丁二醇5％，银耳提取物2％，甘油1％，甘草酸二钾0.1％，库拉索芦荟叶汁0.5％，紫花前胡根提取物0.5％，辛甘醇0.3％，苯氧乙醇0.3％，乙基己基甘油0.02％，三乙醇胺0.5％，薰衣草香精0.2％，去离子水补充余量。
45.本实施例中，银耳提取物为兰州沃特莱斯生物科技有限公司出售的银耳提取物产
品。
46.本实施例中，紫花前胡根提取物为陕西斯诺特生物科技有限公司出售的紫花前胡根提取物产品。
47.本实施例中，薰衣草香精为陕西晨明生物科技有限公司出售的薰衣草香精产品。
48.本实施例中，库拉索芦荟叶汁为山东妆品生物科技有限公司出售的库拉索芦荟叶汁产品。
49.实施例2
50.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：步骤(4)中加入ph为6.5的盐酸缓冲液
51.实施例3
52.本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：乙醇溶剂与丹参粗粉料的质量比为7:1。
53.对比例1
54.本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：步骤(4)中加入ph为2的盐酸缓冲液。
55.对比例2
56.本对比例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：盐酸缓冲液与残渣ii的质量比为6:1。
57.性能评价
58.1.蛋白相对表达量：将人脐静脉内皮细胞(武汉普诺赛)接种在胶原蛋白包被6孔微板上，接种密度为1
×
106个细胞/孔，培养至细胞融合至80％。然后，在包含实施例或对比例制得的植物提取激活剂中孵育48小时，用phosphosafeextractionreagent(来源于novagen)回收蛋白，使用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，进行调整使得样品的蛋白浓度为等量，1抗使用anti
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sirtuin
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3(拜力生物)、anti
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βactin(博士德生物)，2抗分别使用anti
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rabbit、anti
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mouse通过蛋白质印迹法(westernblot)进行评价，每个实施例对比例测试5个试样，测得的数值的平均值记入表1。
59.2.ros含量：采用活性氧检测试剂盒dcfh
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da方法检测细胞内ros水平。将人脐静脉内皮细胞(武汉普诺赛)接种于6孔板，在包含实施例或对比例制得的植物提取激活剂中孵育48小时后，按照ros检测试剂盒(来源于默克)说明书进行操作。用终浓度为10μmol/l的dcfh
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da重悬细胞，置入37℃细胞培养箱内孵育20分钟，以无血清细胞培养液洗涤3次后，转至流式细胞仪检测平均荧光强度，每个实施例对比例测试5个试样，测得的数值的平均值记入表1。
60.3.sod2活性：采用wst
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8法检测细胞内sod2活性。将人脐静脉内皮细胞(武汉普诺赛)接种在6孔板上，经在包含丹参提取物a、丹参提取物b、白藜芦醇的培养基(ebm2)孵育后，预冷的pbs洗涤2次。收集细胞，加入预冷的pbs匀浆，取匀浆液4℃离心，收集上清液。经bca法进行蛋白定量后备用。按照cuzn/mnsod活性检测试剂盒(wst
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8法，来源于碧云天)说明书配制wst
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8/酶液和反应启动液。取20μl样品，依次加入160μlwst
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8/酶液和20μl反应启动液，37℃孵育30分钟。在波长为450nm时，测定吸光度，每个实施例对比例测试5个试样，测得的数值的平均值记入表1。
61.如图1～3所述，处理方法为：将人脐静脉内皮细胞(武汉普诺赛)接种在胶原蛋白包被6孔微板上，培养至亚融合，按照不同处理条件分组：对照组(30mj/cm2紫外线照射)、丹参提取物a组(10μmol/l丹参提取物预处理30分钟后，30mj/cm2紫外线照射)、丹参提取物b组(20μmol/l丹参提取物预处理30分钟后，30mj/cm2紫外线照射)、白藜芦醇(5μm预处理30分钟后，30mj/cm2紫外线照射)。
62.表1
[0063][0064]
通过实施例1～3、对比例1～2和表1可以得知，本发明提供的一种抗衰老调控蛋白植物提取激活剂及其制备方法，具有良好的sirtuin
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3激发活性，细胞协助抗氧化衰老性，并且有效的进一步增强了激发后的sirtuin
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3活性，适宜在植物提取物领域推广，具有广阔的发展前景。其中实施例1在具有最佳的制备原料配比和制备工艺等因素下获得了最佳性能指数。