一种高灵敏即时检测miRNA的分析方法与流程

一种高灵敏即时检测mirna的分析方法
技术领域
1.本发明涉及分析mirna技术领域，具体为一种高灵敏即时检测mi rna的分析方法。


背景技术：

2.microrna(mi rna)是一段由19
‑
23个核苷酸组成的非编码序列，通过与靶mirna的3
′
端非翻译区结合来抑制蛋白质的翻译，随着对mirna研究的增加，越来越多的研究者发现mirna在细细胞增殖、分化和肿瘤中发挥重要作用，其在细胞中的表达水平与人类的许多疾病，尤其是癌症密切相关，可作为癌症诊断和预后分析的基因标志物，因此，实现对mirna的检测被认为是生物医学领域基础研究中有价值的工具，也被认为是疾病诊断和治疗的重要工具，mirna作为一种非侵入性的血液生物标志物，相对稳定且易于检测。
3.但由于其体积小，家族成员间序列同源性高，丰度低，因此是一项具有挑战性的工作，在传统的方法中，northernblotting被认为是检测mirna的金标准，但其灵敏度较低、操作工程复杂、处理时间长，因此，开发一种简便快速的mirna检测新方法具有重要的意义。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种高灵敏即时检测mirna的分析方法，具备操作步骤简单，效率高，实现了mirna的简便、高灵敏及时检测等优点，解决了有mirna的主要检测方法操作步骤复杂、耗时时间较长、灵敏度低及假阳性信号。
5.为实现上述操作步骤简单，效率高，实现了mirna的简便、高灵敏及时检测的目的，本发明提供如下技术方案：一种高灵敏即时检测mirna的分析方法，苯硼酸交联剂和核酸功能化的磁性载体作为动态光散射信号增强探针以目标mirna为桥梁形成“多层夹心”结构前后溶液的平均水化动力学粒径变化作为动态光散射信号输出，利用水化动力学直径变化测定反应待检样品中mirna的含量，包括以下步骤：
6.1)、在ph值介于6.0
‑
8.opb(0.01mol/l)的缓冲液中加入磁性载体，作为初始液；
7.2)、在初始液中加入氨基末端c
‑
dna，并在室温下进行搅拌，在搅拌过程中，分三次加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，使其产生反应；
8.3)、反应完成磁吸5
‑
20分钟后弃上清，将沉淀后冲洗3遍，使沉淀的ph值处于7.4，将ph值为7.4的沉淀复溶后形成羧基化磁性载体，将羧基化磁性载置于4℃下保存；
9.4)、采用edc一步法将与mirna对应的氨基末端c
‑
dna标记于羧基化磁性载体表面，获得特异性识别mirna的磁性探针；
10.5)、以蛋白、聚合物和纳米粒子作为载体，将edc方法将羧基苯硼酸或者是氨基苯硼酸固定到载体上，从而形成苯硼酸交联剂，用于对mirna的识别；
11.6)、往实验器皿中加入待测目标物溶液，随后加入特异性识别mirna的磁性探针和苯硼酸交联剂，使其产生化学反应，在化学反应过程中保证待测目标物溶液处于37摄氏度，持续该反应15
‑
30分钟；
12.7)、取用一部分正在反应的溶液，放置到马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水
化动力学直径，根据水化动力学直径变化测定反应待检样品中mirna的含量；
13.8)、将mirna用无菌无酶ph7.5(0.01mol/l)稀释至合适浓度，取200μl加入玻璃管中并加入一定量的磁性纳米探针，在37℃下反应5
‑
20分钟；
14.9)、将步骤8)中得到的溶液磁吸5
‑
20分钟后弃上清，随后利用超声洗涤2
‑
3遍，随后加入800l苯硼酸交联剂，超声反应5
‑
20min后，再次测定平均水化动力学粒径变化，通过信号的变化进一步确定mirna的含量；
15.10)、通过溶液平均水化粒径最大变化量确定c
‑
dna标记磁性载体的标记量；
16.11)、通过溶液平均水化粒径最大变化量确定磁性纳米探针的用量；
17.12)、通过溶液平均水化粒径最大变化量确定苯硼酸交联剂的用量。
18.进一步，所述针对目标mirna识别元件为与之互补配对的c
‑
dna。
19.进一步，所述羧基化磁性载体由fe304纳米微球、金磁颗粒、硅包磁、磁珠组成。
20.进一步，所述硼酸交联剂为蛋白、纳米粒子、聚合物作为载体连接苯硼酸形成的复合物。
21.与现有技术相比，本发明提供了一种高灵敏即时检测mirna的分析方法，具备以下有益效果：
22.该高灵敏即时检测mirna的分析方法，提出使用c
‑
dna标记磁性载体形成的核酸功能化探针作为动态光散射信号增强探针，苯硼酸交联剂和核酸功能化探针以目标mirna为桥梁形成“多层夹心”结构前后溶液的平均水化动力学粒径变化作为动态光散射信号输出，利用水化动力学直径变化测定反应待检样品中mirna的含量，与传统的检测方法相比，本发明操作步骤简单，短时间即可实现高灵敏检测的优势，所制备的核酸功能化磁珠可以将目标mirna从复杂的样本基质中分离富集出来，有效地消除了样品基质对后续检测的干扰，该方法实现了mirna的简便、高灵敏及时检测。
附图说明
23.图1为本发明方法原理示意图；
24.图2为let
‑
7a基于fe304磁微球的动态光散射均相免疫分析的标准曲线图；
25.图3为mirna
‑
155基于fe304磁微球的动态光散射均相免疫分析的标准曲线图；
26.图4为mirna
‑
21基于fe304磁微球的动态光散射均相免疫分析的标准曲线图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.请参阅图1
‑
4，一种基于苯硼酸交联剂的高灵敏检测mirna动态光散射分析方法，该方法中用于标记与mirna对应的c
‑
dna载体是磁性载体，标记了c
‑
dna的磁性载体同时作为动态光散射传感器的信号探针，该方法中苯硼酸复合物作为交联剂用作mirna的另一识别单元是通过蛋白、聚合物者纳米粒子等载体与苯硼酸偶联合成的，该方法平均水化动力学粒径变化作为动态光散射信号输出。
29.该方法中信号输出底物为磁性载体，当溶液中mirna含量为零或者极低时，磁性载体上的识别元件不能或不与目标抗原结合，进而苯硼酸交联剂不能与mirna结合，因此不能形成磁性纳米探针
‑
mirna
‑
苯硼酸交联剂三合一的“多层夹心”结构，此时溶液的平均水化动力学直径较空白值(标记了c
‑
dna的磁性载体)增加较小或不增加。
30.随着溶液中mirna含量增加时，核酸功能化的磁性载体与目标mirna结合，进而苯硼酸交联剂能与mirna结合因此形成磁性纳米探针
‑
抗原
‑
苯硼酸交联剂三合一的“多层夹心”结构所占比例逐渐增加，此时溶液的平均水化动力学直径较空白值(标记了c
‑
dna的磁性载体)增加越来越多。
31.随着mirna含量的变化，溶液的平均水化动力学直径增加量出现线性变化，最终实现对mirna的定量、灵敏检测，具体的实施步骤包括以下步骤：
32.1)、在ph值介于6.0
‑
8.opb(0.01mol/l)的缓冲液中加入磁性载体，作为初始液；
33.2)、在初始液中加入氨基末端c
‑
dna，并在室温下进行搅拌，在搅拌过程中，分三次加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，使其产生反应；
34.3)、反应完成磁吸5
‑
20分钟后弃上清，将沉淀后冲洗3遍，使沉淀的ph值处于7.4，将ph值为7.4的沉淀复溶后形成羧基化磁性载体，将羧基化磁性载置于4℃下保存；
35.4)、采用edc一步法将与mirna对应的氨基末端c
‑
dna标记于羧基化磁性载体表面，获得特异性识别mirna的磁性探针；
36.5)、以蛋白、聚合物和纳米粒子作为载体，将edc方法将羧基苯硼酸或者是氨基苯硼酸固定到载体上，从而形成苯硼酸交联剂，用于对mirna的识别；
37.6)、往实验器皿中加入待测目标物溶液，随后加入特异性识别mirna的磁性探针和苯硼酸交联剂，使其产生化学反应，在化学反应过程中保证待测目标物溶液处于37摄氏度，持续该反应15
‑
30分钟；
38.7)、取用一部分正在反应的溶液，放置到马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学直径，根据水化动力学直径变化测定反应待检样品中mirna的含量；
39.8)、将mirna用无菌无酶ph7.5(0.01mol/l)稀释至合适浓度，取200μl加入玻璃管中并加入一定量的磁性纳米探针，在37℃下反应5
‑
20分钟；
40.9)、将步骤8)中得到的溶液磁吸5
‑
20分钟后弃上清，随后利用超声洗涤2
‑
3遍，随后加入800l苯硼酸交联剂，超声反应5
‑
20min后，再次测定平均水化动力学粒径变化，通过信号的变化进一步确定mirna的含量；
41.10)、通过溶液平均水化粒径最大变化量确定c
‑
dna标记磁性载体的标记量；
42.11)、通过溶液平均水化粒径最大变化量确定磁性纳米探针的用量；
43.12)、通过溶液平均水化粒径最大变化量确定苯硼酸交联剂的用量。
44.在该优选技术方案中：用于c
‑
dna标记的磁性探针，为了获得高的灵敏度，c
‑
dna采用不同的标记量，最终c
‑
dna的最优标记量通过与目标物及苯硼酸交联剂孵育得到最大的粒径增加量信号确定；
45.在该优选技术方案中：核酸功能化磁性载体的最终用量通过设置不同的反应投入量，反应完成后测定溶液的平均水化动力学直径，得到最大的粒径增加量信号确定磁性纳米探针的最佳使用浓度。
46.在该优选技术方案中：苯硼酸交联剂的用量，在c
‑
dna标记的磁性探针的标记量及
磁性纳米探针确定后，通过与目标物及磁性纳米探针孵育得到最大的粒径增加量信号来确定。
47.在该优选技术方案中：各缓冲液及复溶液在使用前均需经0.22μm滤膜过滤且灭菌后再使用。
48.实施例1利用磁性纳米微球检测let
‑
7a含量应用
49.1羧基化fe3o4磁微球的制备
50.1)油酸化fe3o4磁珠的制备
51.s1)、fe3o4磁珠的合成，在500ml三口烧瓶中加入300ml超纯水，通入n2以除去水中氧气，同时在50℃预热20min。加入3.2gfecl2
·
h2o，5.2gfecl3磁力搅拌混匀后加入25ml氨水，黄色溶液迅速变为黑色，50℃恒温反应30min。将合成的磁珠通过磁吸分离，用超纯水洗3
‑
5次直至磁吸后溶液ph至中性后复溶于300ml超纯水中。
52.s2)、fe3o4磁珠的油酸化修饰，将上步所合磁珠加入三口烧瓶中，通入n2，边搅拌边逐滴加入2.4ml油酸。由于油酸化的磁珠疏水，吸附于搅拌器或烧瓶壁上，70℃反应3h黑色溶液逐渐清澈，停止反应，倒掉烧杯中溶液，加入300ml乙醇将吸附的油酸化磁珠洗脱，磁吸3min弃去乙醇溶剂，重复此步骤4次直至乙醇液面无漂浮油酸层。
53.2)羧基化化fe3o4磁微球的合成
54.5mg聚马来酸酐
‑1‑
十八烯双亲链和10mg粒径10nm左右的油酸化fe3o4磁珠置于进样瓶中，加入120μl氯仿，涡旋充分混匀后加入250μl的10mg/ml十二烷基硫酸钠水溶液。将上述混合物超声乳化，超声参数设置为：功率8％，时间2min，超声5s间隔10s。超声乳化结束后置于60℃烘箱中4h以挥发氯仿。13500rpm离心15min，最后将合成的苯硼酸化fe3o4磁微球载体悬浮于1ml超纯水中备用，估计离心损失率为20％，所以得到的苯硼酸化fe3o4磁微球载体浓度为12mg/ml。
55.2核酸功能化的fe3o4微球探针的制备
56.取10μl上述合成的羧基化的fe3o4纳米微球加入到200μlph6.0pb，加入10l10 m与let
‑
7a对应的氨基末端的c
‑
dna，室温下搅拌反应30min；继续搅拌反应，加入0.2μgl
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐后，室温搅拌30min，补加两次。磁吸5min后弃上清。室温搅拌1h后，磁吸5min后弃上清。pb沉淀冲洗3遍，沉淀pb7.4复溶于4℃保存。
57.3苯硼酸交联剂的制备
58.通过8armpeg
‑
琥珀酰亚胺戊二酸酯和3
‑
氨基苯基硼盐酸盐(3
‑
apba)的共价偶联合成了8armpeg3
‑
apba复合物作为苯硼酸交联剂。详细地，在4mlpb7.4(0.01m)溶液中添加166.08mg的3
‑
apba，并将溶液的ph调节至碱性。然后，将800mg8armpeg
‑
琥珀酰亚胺戊二酸酯溶解于16mlpb7.4(0.01m)中，然后将其添加至上述溶解的3
‑
apba溶液中在室温下搅拌反应4h。反应完成后，将制备的8armpeg@3
‑
apba在0.01mpbs中透析3天。最后，对获得的8armpeg@3
‑
apba进行定量，并于4℃保存。
59.4检测let
‑
7a的含量
60.本发明新型动态光散射分析方法用于检测let
‑
7a含量时，通过以下步骤实施：用本发明检测方法进行检测、分析结果。
61.1)将let
‑
7a分别用无菌无酶pbs7.4稀释，浓度按照所需的实际检测限确定；
62.2)稀释好的let
‑
7a放入4℃冰箱备用。
63.3)用本发明检测方法进行let
‑
7a的含量。
64.4)分析结果。
65.用上述制备的16个不同浓度的标准品10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.78、0.39、0.195、0.097、0.048、0.024、0.012、0.006和0pm，在马尔文纳米粒度分析仪上测试溶液对应的平均水化动力学直径。
66.以溶液粒径为纵坐标，以let
‑
7a(pm)为横坐标绘制标准曲线，求出线性方程。当进行实际样本检测时，将样本的粒径增加值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中let
‑
7a的实际浓度。
67.实施例2mirna
‑
let
‑
7a作为待检物
68.6μlmirna
‑
let
‑
7a对应c
‑
dna功能化的fe3o4微球探针与200μl不同浓度的let
‑
7a样本反应5min，磁吸5min弃上清并用pb7.5(0.01mol/l)超声冲洗2
‑
3遍。随后加入800μl0.2mg/ml的8armpeg@3
‑
apba复溶并超声，25℃孵育5min后，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中let
‑
7a的浓度。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中let
‑
7a的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝18.409ln(x) 71.58，r2＝0.9908，见附图2。该方法的最低检测限被定义为20个第一个标准(0标准时溶液的平均水化粒径) 3倍标准偏差(3倍的第一个标准样品三个平行样品的标准偏差)，所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为0.024pm。
69.实施例3利用金磁微球检测let
‑
7a含量的应用
70.1核酸功能化的金磁纳米探针的制备
71.取10μl金磁纳米粒子(10mg/ml)加入到200μlph6.0pb，加入15l10 mlet
‑
7a对应的c
‑
dna，室温下搅拌反应30min；继续搅拌反应，加入0.2μg1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐后，室温搅拌30min，补加两次。反应完成后磁吸5min弃上清，pb沉淀冲洗3遍，沉淀pb7.4复溶于4℃保存。
72.2检测let
‑
7a的含量
73.本发明新型动态光散射分析方法用于检测let
‑
7a含量时，通过以下步骤实施：用本发明检测方法进行检测、分析结果。
74.1)将let
‑
7a分别用无菌无酶pbs7.4稀释，浓度按照所需的实际检测限确定；
75.2)稀释好的let
‑
7a放入4℃冰箱备用。
76.3)用本发明检测方法进行let
‑
7a的含量。
77.4)分析结果。
78.用上述制备的16个不同浓度的标准品10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.78、0.39、0.195、0.097、0.048、0.024、0.012、0.006和0pm，在马尔文纳米粒度分析仪上测试溶液对应的平均水化动力学直径。
79.以溶液粒径为纵坐标，以let
‑
7a(pm)为横坐标绘制标准曲线，求出线性方程。当进行实际样本检测时，将样本的粒径增加值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应样本的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中let
‑
7a的实际浓度。
80.实施例4 mirna
‑
155作为待检物
81.6μl mirna
‑
155对应的c
‑
dna功能化fe3o4微球探针与200μl不同浓度的mirna
‑
155
反应5min，磁吸5min弃上清并用pb7.5(0.01mol/l)超声冲洗2
‑
3遍。随后加入800μl0.2mg/ml的8armpeg@3
‑
apba复溶并超声，25℃孵育5min后，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中mirna
‑
145的浓度。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中mirna
‑
145的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝12.348ln(x) 249.43，r2＝0.9896，见附图2。该方法的最低检测限被定义为20个第一个标准(0标准时溶液的平均水化粒径) 3倍标准偏差(3倍的第一个标准样品三个平行样品的标准偏差)，所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为0.12pm。
82.实施例5mirna
‑
21作为待检物
83.6μl mirna
‑
21对应的c
‑
dna功能化fe3o4微球探针与200μl不同浓度的mirna
‑
21反应5min，磁吸5min弃上清并用pb7.5(0.01mol/l)超声冲洗2
‑
3遍。随后加入800μl0.2mg/ml的8armpeg@3
‑
apba复溶并超声，25℃孵育5min后，取出于25℃下用马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学直径变化。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中mirna
‑
21的浓度。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中mirna
‑
145的浓度。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中mirna
‑
145的浓度。具体实验结果如下：线性标准曲线为y＝15.883ln(x) 293.16，r2＝0.9938，见附图2。该方法的最低检测限被定义为20个第一个标准(0标准时溶液的平均水化粒径) 3倍标准偏差(3倍的第一个标准样品三个平行样品的标准偏差)，所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测线为0.012pm。
84.实施例6 bsa@cpba作为苯硼酸交联剂的合成
85.牛血清白蛋白(bsa)与羧基苯硼酸(cpba)的偶联是通过edc方法合成的。首先，将31.43mg的cpba溶解于1.0ml的n，n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)中，加入108.92mg1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和130.8mgn
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)在室温下搅拌6h。然后，将250mgbsa溶于10mlpb7.5(0.01m)中，然后加入上述活化的cpba溶液中，在室温下搅拌过夜，将ph调节至7.5。最后，将制备的bsa@cpba在0.01mpbs中透析3天，并保存在4℃备用。
86.实施例7 cuncs@mba作为苯硼酸交联剂的合成
87.cuncs是根据以前报道的方法合成的。首先，将32mg巯基苯硼酸(mba)溶解在包含7.0mldmf和1.0ml去离子水的混合溶液中，超声处理40min，将溶液用0.22μm过滤器过滤。然后，将5.0mgcuso4溶解在0.5ml去超纯水，并添加到溶解的mba溶液中在室温下搅拌3小时。并将合成的cuncs@pba保存在4℃备用。
88.实施例8 sio2@3
‑
apba作为苯硼酸交联剂的合成
89.sio2@3
‑
apba复合物是通过sio2和3
‑
氨基苯硼酸盐酸盐(3
‑
apba)的共价偶联而合成的。将200μl10mg/mlsio2溶解在2.0mlpb6.0(0.01m)中，随后加入150l50mg/ml3
‑
apba并将ph值调节至6.0，在室温下搅拌30min。随后，将25μgedc添加到上述溶液中，并重复3次。反应完成后，15000rpm离心15min，然后用pb7.4(0.01m)洗涤两次，最后将沉淀物重悬于500μlpbph7.4(0.01m)中，并保存于4℃备用。
90.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖
非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
91.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。