高性能淀粉脱支酶嵌合体菌种构建及其生产方法和应用与流程

1.本发明涉及淀粉脱支酶技术领域，尤其涉及高性能淀粉脱支酶嵌合体菌种构建及其生产方法和应用。


背景技术：

2.对于现有的普鲁兰酶来说，存在糖化效率低、在酸性高温条件下的酶活低等缺点。因此，为适应工业化生产的需要，亟需解决普鲁兰酶的糖化效率和在酸性高温条件下(特别是当温度达到60℃及ph值低于4.5时)的酶活问题。


技术实现要素：

3.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了高性能淀粉脱支酶嵌合体菌种构建及其生产方法和应用，与来自芽孢杆菌的母普鲁兰酶相比提高了糖化效率，能适应工业化生产的需求，本发明的嵌合普鲁兰酶的酶活及其他性质与亲本相比获得了提高。
4.本发明提出的高性能淀粉脱支酶嵌合体，所述高性能淀粉脱支酶嵌合体由两个亲代普鲁兰酶氨基酸序列的有效嵌合得到，且所述高性能淀粉脱支酶嵌合体与亲代普鲁兰酶氨基酸序列同源性不低于95％。
5.优选地，两所述亲本普鲁兰酶为bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶和/或bacillus deramificans普鲁兰酶。
6.优选地，所述高性能淀粉脱支酶嵌合体是由bacillus acidopullulyticus的亲代普鲁兰酶的n
‑
末端1
‑
476氨基酸残基和bacillus deramificans的亲代普鲁兰酶c
‑
末端465
‑
976氨基酸残基嵌合而获得的。
7.本发明提出的编码上述高性能淀粉脱支酶嵌合体的表达载体，由一个合成的多聚核苷酸组成。
8.优选地，所述表达载体包括由一启动子序列、一核糖体结合位点、高性能淀粉脱支酶嵌合体编码基因序列、一终止子序列组成的表达组件。
9.优选地，所述表达载体还包括用于指导高性能淀粉脱支酶嵌合体分泌的信号序列，信号序列位于密码子的上游。
10.本发明提出的重组的微生物宿主细胞，包含上述所述的表达载体。
11.优选地，所述表达载体的高性能淀粉脱支酶嵌合体编码基因序列被整合到重组宿主细胞的染色体上。
12.本发明提出的生产高性能淀粉脱支酶嵌合体的方法，方法步骤如下：
13.s1：培养上述的重组的微生物宿主细胞，用于表达高性能淀粉脱支酶嵌合体；
14.s2：在培养的重组的微生物宿主细胞或其上清液中得到高性能淀粉脱支酶嵌合体。
15.本发明提出的组合物，所述组合物包括上述的高性能淀粉脱支酶嵌合体。
16.优选地，所述组合物还包括淀粉酶。
17.本发明提出的上述组合物在催化碳水化合物糖化中的应用。
18.优选地，所述碳水化合物至少含有一个α
‑
1,6糖苷键。
19.本发明提出的催化碳水化合物的方法，采用碳水化合物和上述的组合物进行反应。
20.优选地，所述碳水化合物为淀粉，支链淀粉，右旋糖苷，麦芽糊精，普鲁兰糖或肝糖。
21.优选地，所述反应的条件为：ph为4.0
‑
4.5、温度60
‑
64℃。
22.有益效果：
23.本发明的高性能淀粉脱支酶嵌合体由两个亲代普鲁兰酶氨基酸序列的有效嵌合得到，具有更好的ph耐受性、耐热性和热稳定性。此外，本发明中的嵌合普鲁兰酶与黑曲霉来源的糖化酶混合成复合糖化酶，体现出优良的性能，且便于生产操作，可以满足大多数客户利用淀粉原料生产葡萄糖(或及其衍生产品)的需要。在糖化上，在0.300pu/gds剂量情况下，亲本普鲁兰酶24h的葡萄糖产量94.5％，而本发明制备的高性能淀粉脱支酶嵌合体则在0.150pu/gds剂量情况下24h的葡萄糖产量即可达到94.6％，从而说明本技术制备的高性能淀粉脱支酶嵌合体在糖化上的应用效果得到显著地提升。
附图说明
24.图1为本发明提出的pyf
‑
tsde载体的示意图；
25.图2为本发明提出的puc57
‑
ks
‑
erm载体的示意图；
26.图3为本发明提出的pyf
‑
tsint
‑
pul载体的示意图。
具体实施方式
27.(1)pyf
‑
tsde质粒的构建
28.pyf
‑
tsde的示意图如图1所示，其以南京擎科生物科技有限公司合成的puc57
‑
ks
‑
erm为原料制备，具体方法参照cn107532155a。
29.(2)蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株的构建
30.本发明以枯草芽孢杆菌作为宿主细胞，经处理后直接作为pcr反应的模板，以下引物由genscript合成，分别用于pcr反应扩增侧翼序列apr,npr和spoiiac：
31.扩增apr基因上游序列的引物为：
32.pksb
‑
apr_czf1：ggtatcgata agcttcctgc agatctctca ggagcatttaacct
33.pksb
‑
apr_r1：gcacctactg caatagtaag gaacagattg cgcat
34.扩增apr基因下游序列的引物为：
35.pksb
‑
apr_f2：atgcgcaatc tgttccttac tattgcagta ggtgc
36.pksb
‑
apr_czr2：aatatggcgg ccgcgaattc agatctctaa tgctgtctcg cgt
37.扩增npr基因上游序列的引物为：
38.pksb
‑
npr_czf1：ggtatcgata agcttcctgc agatctcatc ttccccttgat
39.pksb
‑
npr_r1：cagtcttctg tatcgttacg cttttaattc ggct
40.扩增npr基因下游序列的引物为：
41.pksb
‑
npr_f2：agccgaattaaaagcgtaac gatacagaag actg
42.pksb
‑
npr_czr2：tatggcggcc gcgaattcag atctcctggc caggagaatc t
43.扩增spoiiac：基因上游序列的引物为：
44.pksb
‑
spo_czf1：ggtatcgata agcttcctgc aggaacaatc tgaacagcag gcactc
45.pksb
‑
spo_r1：ttgtcaaaccatttttcttc gcccgatgca gccgatctg
46.扩增spoiiac基因下游序列的引物为：
47.pksb
‑
spo_f2：cagatcggct gcatcgggcg aagaaaaatg gtttgacaa
48.pksb
‑
spo_czr2：atatggcggc cgcgaattca gatctgttca tgatggcaagacac
49.反应条件参照cn107532155a的记载，反应结束后对扩增产物进行检测和纯化。
50.为了得到在设计位点进行基因替换的菌株，将几个筛选出的单克隆接种到2yt培养基中，30℃培养5
‑
7天(每2天继代一次)。将对红霉素敏感的菌株进行pcr筛选(见seq id no.7、8、9)。在1％的脱脂牛奶平板上进行蛋白酶缺陷表型验证。
51.(3)普鲁兰酶生产菌株的构建
52.普鲁兰酶表达框主要包括：启动子序列(seqid:no 10)、核糖体结合位点(seq id:no 11)、嵌合普鲁兰编码基因和终止序列(seq id:no 12)。此外，本发明还在普鲁兰酶编码基因启动子的上游插入一个从枯草芽孢杆菌中筛选的强的天然信号序列(seq id:no 13)，用于增强普鲁兰酶的分泌效率。用assembly master mix试剂盒(new england biolabs)将完整的普鲁兰酶表达框插入线性化的pyf
‑
tsde中的bglii位点，并将得到的整合质粒命名为pyf
‑
tsint
‑
pui(图3)。
53.(4)普鲁兰酶生产的摇瓶发酵
54.发酵方法参照cn107532155a，并对发酵后的产物进行sds
‑
page分析，确定嵌合普鲁兰酶的有效分泌。
55.(5)普鲁兰酶分步补料发酵工艺
56.将步骤(3)中得到的
‑
80℃冷冻保存的基因工程芽孢杆菌菌株划线与琼脂斜面上，37℃过夜恢复培养。具体的补料发酵工艺参照cn107532155a。
57.(6)普鲁兰酶活力测定
58.酶活测定参照cn107532155a的记载。
59.(7)嵌合普鲁兰酶的应用
60.以下所有结果都是基于嵌合的普鲁兰酶(seq id no.6)，这个嵌合的普鲁兰酶是由bacillus acidopullulyticus的亲代普鲁兰酶的n
‑
末端1
‑
470氨基酸残基和bacillus deramificans的亲代普鲁兰酶c
‑
末端469
‑
928氨基酸残基嵌合而获得的。嵌合普鲁兰酶的氨基酸序列的同源性至少达到95％，如95％，96％，97％，98％，99％或者100％等。
61.嵌合普鲁兰酶糖化测试条件：31％干物质(ds)、充分混匀、ph用50％(w/v)naoh调节至4.3。分别加入0.3、0.15pu/gds的普鲁兰酶和葡糖淀粉酶(混合浓度：0.225gu/gds)和空白标记水。原未经改造的普鲁兰酶(来自bacillus deramificans，0.300pu/gds)加入一个摇瓶作为对照组。结果见表1。
62.表1：在ph4.3时，截短普鲁兰酶和亲本普鲁兰酶糖化应用比较
[0063][0064]
由表1可知，在添加量减少一半的酶剂量下(0.150pu/gds)，与亲本葡萄糖产量(94.5
‑
96.4％)相比，嵌合的普鲁兰酶保持甚至增加了葡萄糖产量(94.6
‑
97.8％)，这证实了嵌合普鲁兰酶不仅不会影响普鲁兰酶的活力。重要的是，在48h内达到葡萄糖产量97.8％，说明在实际应用中，嵌合普鲁兰酶只需要较低的剂量就可以带来很好的生产性能，可以帮助客户降低酶制剂使用成本。此外，在开始反应的24h内，嵌合普鲁兰酶催化的糖化作用速率要高于亲本普鲁兰酶(结果未列)。综上所述，嵌合普鲁兰酶造成了更好的结构稳定性和更高的酶活力。
[0065]
其次，我们通过在低ph条件下的糖化实验测定了嵌合的普鲁兰酶对ph的耐受性。糖化反应条件同上所述，ph为4.0。结果见表2。
[0066]
表2：在ph4.0时，截短普鲁兰酶和亲本普鲁兰酶糖化应用比较
[0067][0068]
如表2所示，在ph4.0的条件下，在反应至48h，亲本普鲁兰酶的葡萄糖产量仅为96.1％，低于淀粉工业中所必需的葡萄糖产量最小限度的百分比(96.5％)。而对于嵌合普鲁兰酶来说，其在酸性条件ph4.0的条件下显示出更高的催化活力，在反应时间为48h时，嵌合普鲁兰酶的最终的葡萄糖产量可达97.2％(表2)。
[0069]
另外，对嵌合普鲁兰酶和亲本普鲁兰酶的耐热性和热稳定性进行测定，结果见表3。
[0070]
表3：不同温度下的嵌合普鲁兰酶和亲本普鲁兰酶糖化应用比较(ph4.3)
[0071][0072]
由表3可知，在64℃高温条件下，嵌合普鲁兰酶能够显著的保持持续的较高葡萄糖产量，也即嵌合普鲁兰酶的耐热性和热稳定性相比于亲本普鲁兰酶有显著提高。
[0073]
最后，还对嵌合普鲁兰酶的糖化反应进行了研究。通过50％(w/v)naoh调节ph至5.2，其余反应条件均参照cn107532155a的记载。结果见表4。
[0074]
表4：嵌合普鲁兰酶和原普鲁兰酶麦芽糖产率的应用比较
[0075][0076]
如表4所示，与原普鲁兰酶比较，嵌合普鲁兰酶在同样的条件下表现更好。麦芽糖产量明显高于亲本普鲁兰酶，这说明嵌合普鲁兰酶在麦芽糖工业生产的催化活度得到了较大程度的改善。
[0077]
综上所述，依照本发明中的实验结果，嵌合的普鲁兰酶比亲本普鲁兰酶有更好的ph耐受性，耐热性和热稳定性。本发明中嵌合的普鲁兰酶在一定条件下也体现出了一定优势。因此，本发明中的嵌合普鲁兰酶可以应用于淀粉原料的糖化作用过程，尤其是在淀粉加工工业中。