一种来源于丝状真菌黑曲霉的诱导型启动子及其应用的制作方法

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1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种诱导型启动子及其应用。


背景技术：

2.甾体激素类药物在临床上具有广泛的应用。该类药物用于治疗炎症和过敏等症状，也用于治疗癌症，人体激素分泌障碍以及用于生育控制。甾体药物的生理和药理活性取决于甾体骨架特定位点引入官能基团。对甾体结构的改造通过化学合成法或微生物转化法，或结合两种方法。全化学合成法存在着合成过程复杂、副产物不容易分离等缺点，故化学合成法难以完成的关键合成步骤工业上利用微生物转化反应在甾体基本骨架上引入各种不同类型的官能团，尤其是羟基。
3.重要的微生物甾体羟化反应包括在载体骨架c9、c11、c15、c17位上引入羟基。赭曲霉(aspergillus ochraceus)具有良好的甾体羟化反应特异性和较高的羟化活性，常用于工业上甾体c11α-羟化反应。赭曲霉菌株内催化c11α-羟基化反应的羟基化酶属于p450酶系，编码c11α-羟化酶基因已被克隆鉴定。但利用赭曲霉转化甾体的发酵过程中容易产生大量砖红色色素，给转化产物的分离纯化造成困难，另外赭曲霉发酵还可能产生赭曲霉毒素。
4.黑曲霉(aspergillus niger)是美国fda认证的安全菌株(gras)，黑曲霉生长代谢旺盛、营养需求简单、不产生真菌毒素、遗传背景清晰、分子遗传操作技术成熟，是构建丝状真菌细胞工厂的理想宿主菌。同时模式黑曲霉菌株转化甾体底物不易产生干扰产物分离纯化的色素。黑曲霉菌株atcc1015具有甾体c11α-羟化酶活性，但转化活性低且副产物多，难以用于工业生产。我们已克隆鉴定了黑曲霉atcc1015菌株中编码甾体c11α-羟化酶基因ana100及其启动子c7的dna序列，该基因的表达在转录水平上受甾体底物的高效诱导。
5.鉴于黑曲霉甾体c11α-羟化酶的基因ana100表达受甾体底物的高度诱导性，其启动子c7可用于在黑曲霉细胞中高效表达不同的目标甾体羟化酶基因以及其它目标基因的高效表达。
6.本发明构建赭曲霉甾体c11α-羟化酶基因重组表达质粒，通过农杆菌介导法，利用同源重组将赭曲霉甾体c11α-羟化酶基因替换黑曲霉菌株的c11α-羟化酶基因ana100，实现黑曲霉高效甾体诱导型启动子c7驱动目标赭曲霉甾体c11α-羟化酶基因的表达，从而获得黑曲霉高效c11α-羟化工程菌，对于利用生物催化羟基化高效绿色生产甾体药物及其中间体具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明针对目前工业菌种赭曲霉tccc41060甾体c11α羟化工艺过程中产生干扰色素问题，利用黑曲霉的一种诱导型启动子c7，在黑曲霉细胞中过表达赭曲c11α羟化霉基因cyp68j5(简称68j5)，构建高效催化甾体化合物羟化反应的基因工程菌株，对于提高甾体化合物的生物转化效率具有重要的意义。
8.本发明所述诱导型启动子c7的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.本发明所述诱导型启动子c7来源于黑曲霉atcc1015。
10.含有本发明所述诱导型启动子c7的表达盒、表达载体、重组载体或宿主细胞也属于本发明的保护范围。
11.基因扩增含有本发明所述诱导型启动子c7 dna全长或部分片段的引物序列也属于本发明的保护范围。
12.本发明所述诱导型启动子c7可用于包括但不限于11α-羟化酶、11β-羟化酶、7α-羟化酶、14α-羟化酶、9α-羟化酶基因的诱导表达或甾体15α-羟化酶、16α-羟化酶在黑曲霉宿主细胞表达，构建相应的黑曲霉高效甾体羟化基因工程菌。
13.有益效果：
14.本发明实例考察了赭曲霉c11α-羟化酶基因68j5在黑曲霉atcc1015细胞中高水平表达以及重组菌对甾体底物16，17α-环氧黄体酮的转化效率。通过构建诱导型表达载体，并运用同源重组的方法获得了68j5基因重组黑曲霉菌株。甾体转化试验表明黑曲霉重组菌株的转化率显著高于现有赭曲霉生产菌种，本发明的研究成果具有重要的商业应用价值。
15.说明书附图：
16.图1 16，17α-环氧黄体酮的c11α-羟基化反应
17.图2琼脂糖凝胶电泳验证启动子c7条带
18.图3重组质粒pbg-68j5构建示意图
19.图4酶切验证重组质粒pbg-68j5
20.(a)m：10kb dna ladder；1：xba i ecori双酶切验证；
21.(b)m：10kb dna ladder；2：saci单酶切验证。
22.图5过表达重组质粒pg-68j5构建示意图
23.图6重组质粒pg-68j5的酶切验证电泳图
24.(a)m：10kb dna ladder；1：knp i xho i双酶切验证；
25.(b)m：10kb dna ladder；2：ecori单酶切验证。
26.图7琼脂糖凝胶电泳验证hyg电泳图
27.图8定点整合示意图
28.图9琼脂糖凝胶电泳验证图
29.图10 tlc结果图
30.图11菌种的甾体底物转化结果
具体实施方式：
31.下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
32.实施例一 启动子序列获得
33.利用ncbi数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得黑曲霉p450酶基因的上游序列，设计pcr上下游引物，以黑曲霉atcc1015基因组为模板，进行pcr扩增获得724bp的启动子片段，如图2所示。
34.c7-f：aaggcgatgaggttgtaatg(上游引物)
35.c7-r：ggattacggcacagacac(下游引物)
36.将启动子片段连接到t载体上，再进行测序，获得了诱导性启动子c7的核苷酸序列如seq id no：1所示。
37.实施例二 过表达载体的构建
38.构建所需引物序列如下：
39.ppzp-hindiii-f：aagcttcattgttgtctccttc(上游序列)
40.ppzp-xbai-r：tctagagccccgacag c(下游序列)
41.用ncoti、hindiii酶切质粒载体l-t，通过胶回收纯化获得0.5kb的l片段。用hindiii、xbai酶切质粒载体pcsn44-hyg，通过胶回收纯化获得2.4kb的hyg片段。用ncoti、xbai酶切质粒载体pblue-hyg，通过胶回收纯化获得3.0kb的pblue片段。利用重组酶将3个片段体外连接，得到重组质粒pblue-l-hyg。用saci酶和xbai酶双酶切，通过胶回收获得pblue-l-hyg片段。经ecori、xbai双酶切载体c7-68j5-tt-t并通过胶回纯化获得3.24kb的c7-68j5-tt片段。用ecori和saci酶切质粒载体r-t并通过胶回纯化获得0.51kb的r片段，通过重组酶将3个片段体外连接构建重组质粒pbg-68j5，构建示意图见图3所示。利用xbai和ecori双酶切重组质粒pbg-68j5，得到6164bp和3401bp片段，再利用限制性核酸内切酶saci单切质粒，得到9565bp条带，见图4所示。
42.以重组质粒pbg-68j5作为模板，通过设计带有hindiii和xbai识别位点的的上游引物ppzp-hindiii-f和下游引物ppzp-xbai-r，进行pcr反应从而获得目的片段，用xbai酶和hindiii酶双酶切获得带有粘性末端目的片段，再通过dna体外重组技术，与带有相同位点的载体骨架ppzp片段进行连接，构建过表达载体pg-68j5，构建示意图见图5。经kana抗性筛选，挑选单菌落提取质粒。将重组质粒pg-68j5-tt-r用knp i和xho i进行双酶切，再用ecori酶进行单酶切，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图6所示。
43.实施例三 重组质粒电转农杆菌及筛选
44.(1)农杆菌感受态的制备
45.a.取农杆菌甘油管三区划线接种于lb平板上于28℃培养至长出单菌落；
46.b.挑取农杆菌分单菌落，接种于5ml lb液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养约12小时；
47.c.以2％的接种量将上述菌液接种于50ml lb液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养4-6h，至od600值为0.8；
48.d.将培养好的菌液冰浴30min后转移至预冷的灭过菌的50ml离心管中，4℃，5000rpm离心10min，弃上清；
49.e.用10ml预冷的无菌水重新悬浮菌体，4℃，5000rpm离心10min，弃上清；
50.f.用20ml预冷的10％甘油重悬菌体，4℃，5000rpm离心10min，弃上清；
51.g.重复上步操作；
52.h.用1ml的10％甘油重悬菌体，按90μl/管的量分装于1.5ml的ep管中，于-70℃保存备用。
53.(2)重组质粒pg-68j5电击转化根癌农杆菌
54.a.将电转杯用无水乙醇清洗3次，特别是棱角处和加样槽，再用去离子水清洗3次，
晾干，置于冰上冰浴。
55.b.在冰上解冻农杆菌感受态细胞，向感受态中加入3μl质粒，混匀，冰浴5min。
56.c.将感受态细胞转移至预冷的电转杯中，把电转杯外侧的水擦干，置于电穿孔容器进行脉冲电阻200ω，1800v电压进行脉冲。
57.d.立即取出电转杯，添加1ml的lb至电转杯，混匀后，将菌液转移至1.5ml无菌ep管，180r/min，28℃下复苏3h。
58.f.取200μl菌液涂布到含kana的lb平板上，28℃倒置培养2d，待转化子长出。
59.g.挑取单菌落进行菌落pcr验证条带大小，通用引物为hyg-f和hyg-r。
60.hyg-f：ctttttcggacttgagtggcg(上游引物)
61.hyg-r：taaggaaacgggagcctg(下游引物)
62.经琼脂糖凝胶电泳验证hyg条带，结果如图7所示。
63.实施例四 黑曲霉与农杆菌共培养及其验证
64.利用农杆菌介导野生黑曲霉atcc1015转化，将c11α-羟化酶基因68j5表达盒转入黑曲霉中，通过同源重组实现定点整合到黑曲霉内使得68j5基因实现异源表达(示意图见图8)。
65.农杆菌介导法共培养实验步骤如下：
66.a.挑取农杆菌单菌落于5ml含有100ug/ml kana的lb液体中，28℃，180r/min，震荡培养20-24h。
67.b.取1.5ml过夜培养的农杆菌液体于无菌ep管中，5000r/min，离心10min，弃上清，用含有100μg/ml kana和0.2μmol/l as的im液体培养基冲洗菌体，重悬，4000r/min，离心5min，弃上清。再用1ml的im液体重悬菌体，移至无菌试管中，再加入4ml的im液体培养基，28℃，100r/min，培养5h。
68.c.在od
600
的条件下，测菌体的od值至0.8，此时农杆菌浓度约为4～5
×
108个/ml。
69.d.用无菌的镊子将0.45μm的微孔滤膜放置于含有0.2μmol/l as和100μg/ml kana的im平板上，尽量避免产生气泡。
70.e.取100μl od
600
约等于0.8的农杆菌与100μl浓度为1.0
×
107个/ml的黑曲孢子混合均匀。
71.f.将农杆菌与黑曲霉孢子的混合液用涂布器均匀的涂布于贴有微孔滤膜的im平板上，风干后，25℃培养2-5天。
72.g.将农杆菌经im培养基诱导后，与黑曲霉atcc1015进行共培养，期间通过同源重组定点整合方式增加拷贝数，从cm板上挑选单菌落于hyg-pda斜面培养基上培养72h，提取其基因组作为验证的模板，以l-f、hyg-r为上下游引物进行pcr验证结果，结果见图9所示。
73.l-f：aaagcaagtagcgagtag(上游引物)
74.hyg-r：taaggaaacgggagcctg(下游引物)
75.实施例五 检测甾体底物的转化效率
76.将带有诱导性启动子的黑曲霉菌株进行活化，再将甾体底物经球磨机研磨成其颗粒直径在10～15μm。将其与表面活性剂吐温80以1∶10体积比例充分混合加入黑曲霉生长摇瓶中，摇晃均匀后放入摇床(28℃，转速200r/min)继续培养，72h取样测定转化率，tlc结果如图10所示。使得启动子驱动羟化酶基因68j5进行功能表达。同时在投料浓度为0.1％时，
对比野生黑曲霉atcc1015菌株的转化率，重组黑曲霉菌株在72h左右提高其转化效率且副产物明显减少。
77.实施例六 黑曲霉重组菌株不同时间的转化分析
78.为了确定黑曲霉重组菌株对甾体底物16，17α-环氧黄体酮的转化效率，对比了出发菌株野生黑曲霉atcc1015在底物投料量为1g/l时的转化情况，结果如图11所示，重组菌株的转化率明显高于出发菌株野生黑曲霉atcc1015，且在48h时出发菌株野生黑曲霉atcc1015的转化效率明显低于重组菌株，且重组菌株在72h后的转化效率达到74.6％。
79.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。