用于治疗或预防恶心的类胡萝卜素的制作方法

用于治疗或预防恶心的类胡萝卜素
1.要求优先权
2.本技术要求于2019年2月7日提交的美国临时申请系列no.62802398的权益。以引用的方式将上述的全部内容并入本文。
3.联邦政府资助的研究或开发
4.本发明是在美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的资助no.ag043184的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。


背景技术：

5.化疗诱发的恶心和呕吐(cinv)影响了70％
‑
80％的经历化疗的患者，并且是中止癌症治疗的主要原因。


技术实现要素：

6.本公开提供了用于治疗和/或预防某些疾病、障碍和/或病症的技术，并且还提供了用于评估在此类治疗和/或预防中有用的试剂的一种或多种特性的技术。
7.在一些实施方式中，所提供的技术涉及恶心和/或呕吐的治疗，并且在一些实施方式中特别涉及诱发的(例如化疗诱发的)恶心和/或呕吐。可替代地，或另外地，在一些实施方式中，所提供的技术涉及一种或多种进食障碍(例如神经性厌食症)的治疗或预防。
8.随着多种疾病和障碍而经历恶心和/或呕吐，并且此外，恶心和/或呕吐可能由治疗性处理(例如化疗)引起。无论在何种情况下出现恶心和/或呕吐，通常都认为它们是令人不快和不期望的。因此，受试者试图避免恶心和/或呕吐；例如在患者察觉到此类治疗与所经历的恶心和/或呕吐之间存在关联时，这种避免可能导致例如不依从于治疗性处理。
9.本公开认识到，参与毒素的监控和/或对毒素的应答的某些生物途径(例如毒素解毒途径)、特别是将翻译缺陷的检测转导为解毒基因的诱导的某些信号传导途径在动物系统发育中是保守的，并且也可以阻抑异常的人异型生物质应答(xenobiotic response)；本公开教导了此类试剂在某些疾病、障碍或病症(具体包括例如恶心和/或呕吐，例如化疗诱发的恶心，其为癌症治疗中的主要问题)的治疗中和/或在进食障碍(例如神经性厌食症)中可能具有治疗潜力。
10.因此，本公开提供了表征用作本文所述的治疗剂的试剂的模型系统，例如秀丽隐杆线虫(c.elegans)。此外，本公开记载了此类系统用于鉴别和/或表征某些有用的此类试剂的用途。
11.除了其它以外，本公开教导了某些类胡萝卜素化合物(例如某些c50类胡萝卜素化合物)可用于治疗和/或预防疾病、障碍和/或病症(例如恶心和/或呕吐，例如诱发的恶心、如化疗诱发的恶心)和/或一种或多种进食障碍(例如神经性厌食症)。
12.例如，本公开提供了某些类胡萝卜素化合物(例如某些c50类胡萝卜素化合物)抑制解毒途径，包括响应于由毒素和/或翻译组件中的突变诱导的翻译缺陷而激活的解毒途径。本公开认识到，包括人类在内的哺乳动物通常对类胡萝卜素耐受良好，并且本公开教导
了它们是用于如本文所述的治疗用途的一类有吸引力的化合物(例如用于治疗和/或预防恶心和/或呕吐，和/或一种或多种进食障碍)。
13.本公开特别认识到，某些c50类胡萝卜素化合物是由微生物天然产生的(如hencke等所综述的，“c50 carotenoids:occurrence,biosynthesis,glycosylation,and metabolic engineering for their overproduction”，bio
‑
pigmentation and biotechnological implementations的第5章，ed.singh，wiley&sons，2017)。在一些实施方式中，用于如本文所述的治疗用途的类胡萝卜素化合物(例如c50类胡萝卜素化合物)的递送可通过给予下述组合物来完成，所述组合物是或包含产生一种或多种感兴趣的类胡萝卜素化合物的微生物、或其提取物或经纯化的组分。在一些实施方式中，此类给予可以是具有活力的(例如微生物)，并且在某些实施方式中可以实现所给予的微生物在接受者中的定殖(例如作为接受者微生物组的部分)。
14.除了其它以外，本公开认识到涉及微生物、特别是有活力的(例如活的)微生物的给予的实施方式可以提供某些优势，例如，诸如减少的给予(例如减少的给药频率、给药期限、给予剂量的总数、给予剂量的体积和/或浓度、和/或它们的组合等)、降低的成本、长期功效等。
15.然而，本领域技术人员阅读本公开后将理解，用于如本文所述的治疗的类胡萝卜素化合物(例如c50类胡萝卜素化合物)的递送不限于微生物或甚至其提取物和/或组分的递送；而是，有用的类胡萝卜素化合物(例如如本文所述的)可以全部或部分通过化学合成制备和/或可以从微生物来源纯化(例如经培养的微生物细胞，其可以是天然存在的和/或经遗传工程化或以其它方式工程化的细胞)。
16.本领域技术人员将进一步理解，多种递送途径和/或形式中的任一种可用于给予组合物，所述组合物递送(例如，如本文所述，所述组合物是或包含微生物和/或其提取物或组分和/或一种或多种纯的类胡萝卜素化合物)如本文所述的有用的类胡萝卜素化合物。在许多实施方式中，组合物是口服给予的(例如通过丸剂、片剂、胶囊剂、散剂、锭剂(lozenge)、糖浆剂、酏剂等)。在一些实施方式中，通过营养来源(例如食物或饮料)进行口服给予。
17.与开发用于恶心和/或呕吐的有用的治疗有关的一项挑战是缺乏动物模型。本公开记载了秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)可以提供用于恶心和/或呕吐的有效模型。除了其它以外，本公开提供了秀丽隐杆线虫可用于表征(例如筛选)试剂，以评估它们对治疗恶心和/或呕吐的影响和/或有用性。例如，微生物毒素和毒力因子通常靶向翻译机制(translation machinery)。秀丽隐杆线虫通过诱导解毒和防卫反应基因而对翻译缺陷(例如可能由暴露于毒素和/或由翻译组件的突变引起)响应。根据本公开，抑制这种诱导的试剂可用于治疗恶心和/或呕吐，并且此类抑制的评估可用于表征(例如筛选)此类试剂。
18.更进一步地，本公开表明了，某些类胡萝卜素化合物(例如某些c50类胡萝卜素化合物)可抑制秀丽隐杆线虫翻译缺陷监控和应答途径(例如针对翻译缺陷的秀丽隐杆线虫异型生物质解毒应答)；根据本公开，此类类胡萝卜素化合物可用于治疗性应用，例如治疗恶心和/或呕吐。例如，本公开特别记载了由嗜根考克氏菌(kocuria rhizophila)产生的c50类胡萝卜素化合物抑制秀丽隐杆线虫翻译缺陷监控和应答途径。除了其它以外，本公开描述了下述遗传分析，所述遗传分析将用于此种类胡萝卜素的生物合成途径鉴别为介导了
对秀丽隐杆线虫翻译毒素防卫反应的抑制。此外，本公开记载了嗜根考克氏菌提取物：(i)重现(recapitulate)了针对翻译缺陷的秀丽隐杆线虫异型生物质解毒应答的阻抑；以及(ii)恢复了嗜根考克氏菌的类胡萝卜素突变体抑制针对翻译中的缺陷的此类解毒应答的能力。
19.此外，本公开记载了其它类胡萝卜素化合物(例如由其它菌种产生的c50类胡萝卜素化合物)也抑制了秀丽隐杆线虫翻译缺陷监控和应答途径(例如针对翻译缺陷的秀丽隐杆线虫异型生物质解毒应答)。例如，本公开记载了产生c50类胡萝卜素癸异戊二烯黄素(decaprenoxanthin)的谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)也抑制了秀丽隐杆线虫解毒应答，而且谷氨酸棒杆菌的类胡萝卜素生物合成突变体在这种抑制方面存在缺陷。
20.更进一步地，本公开记载了另一菌种
‑‑
研究团队节杆菌(arthrobacter arilaitensis)，研究团队节杆菌也产生c50类胡萝卜素(具体地，癸异戊二烯黄素)，也抑制秀丽隐杆线虫解毒应答。
21.不希望受任何特定理论的束缚，本公开提出本文所述的类胡萝卜素化合物(例如c50类胡萝卜素化合物)通过抑制秀丽隐杆线虫胆汁酸信号传导途径(该途径将翻译缺陷的检测转导为解毒基因的诱导)来阻抑异型生物质解毒的诱导。如本文所记载的，通过类胡萝卜素化合物(例如c50类胡萝卜素化合物)对翻译监控的阻抑使药物解毒应答失效，从而提高了翻译抑制药物的效力。因此，在一些实施方式中，根据本公开的有用的类胡萝卜素化合物的特征可以在于，它们增加翻译抑制药物的效力的能力。例如，在一些实施方式中，有用的类胡萝卜素化合物的特征在于，当这种类胡萝卜素化合物在翻译抑制药物的存在下与秀丽隐杆线虫接触时，该翻译抑制药物对秀丽隐杆线虫的影响的一个或多个特征相对于在没有类胡萝卜素化合物的其它可比条件下(例如以相同浓度存在相同翻译抑制药物等)观察到的特征增强。
22.本公开还表明了某些类胡萝卜素化合物(例如某些c50类胡萝卜素化合物)抑制了翻译监控与秀丽隐杆线虫中通常由翻译抑制药物诱发的厌食行为的耦合。因此，在一些实施方式中，根据本公开的有用的类胡萝卜素化合物的特征可以在于，在相关毒素的存在下该化合物对秀丽隐杆线虫厌食行为的影响。例如，在一些实施方式中，有用的类胡萝卜素化合物的特征可以在于，当此种化合物在靶向蛋白质翻译的毒素的存在下与秀丽隐杆线虫接触时，相对于在没有类胡萝卜素化合物的其它可比条件(例如以相同浓度存在相同毒素等)下观察到的，毒素对秀丽隐杆线虫挑食行为的影响的一个或多个特征发生改变。在一些实施方式中，如本文所述的显示出影响厌食行为的试剂(例如类胡萝卜素化合物，如c50类胡萝卜素化合物)可以特别地用于治疗一种或多种厌食障碍，例如神经性厌食症。
23.因此，本文提供了用于在受试者中治疗恶心和/或呕吐、或用于减轻厌食的方法。所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的c50类胡萝卜素化合物。在一些实施方式中，受试者患有与化疗或放疗有关的恶心和/或呕吐(例如化疗诱发的恶心和呕吐(cinv)或放疗诱发的恶心和呕吐(rinv))，或处于发展出与化疗或放疗有关的恶心和/或呕吐(例如化疗诱发的恶心和呕吐(cinv)或放疗诱发的恶心和呕吐(rinv))的风险中。
24.在一些实施方式中，受试者患有术后恶心和呕吐(ponv)或处于发展出术后恶心和呕吐(ponv)的风险中。
25.在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物选自于由以下组成的组：癸异戊二烯黄
素、c50
‑
虾青素、c50
‑
β
‑
胡萝卜素、c50
‑
胡萝卜素(n＝3)(16,16
‑
二异戊烯基八氢番茄红素)、c50
‑
玉米黄质、c50
‑
眉藻黄素、c50
‑
念珠藻黄素(nostoxanthin)、八叠球菌黄素(sarcinaxanthin)、sarprenoxanthin、无环c50类胡萝卜素菌红素、c50
‑
角黄素、c50
‑
番茄红素、c50
‑
八氢番茄红素以及它们的组合。在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物是癸异戊二烯黄素。
26.在一些实施方式中，给予的步骤包括给予下述组合物，所述组合物是或包含：(i)c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物或其组分，(ii)来自c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物的提取物，(iii)经提取的类胡萝卜素化合物，或(iv)它们的组合。在一些实施方式中，c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物是活的或有活力的。在一些实施方式中，给予的步骤包括给予足够量的微生物，以在受试者的微生物组中定殖。在一些实施方式中，组合物包含微生物的培养物，或由微生物的培养物制备。在一些实施方式中，微生物是自然界中发现的菌株。在一些实施方式中，微生物是经工程化的微生物。在一些实施方式中，相对于其它可比参考微生物，经工程化的微生物包含遗传改变，以便使经工程化的微生物以不同于参考微生物的绝对或相对水平产生c50类胡萝卜素化合物。
27.在一些实施方式中，给予的步骤包括给予下述组合物，所述组合物包含或递送合成的c50类胡萝卜素化合物。在一些实施方式中，c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物选自于由嗜根考克氏菌、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、研究团队节杆菌(arthrobacter arilaitensis)以及它们的组合组成的组。
28.本文还提供了用于口服递送的治疗组合物，所述治疗组合物包含治疗有效量的c50类胡萝卜素化合物和药学上可接受的载体。
29.在一些实施方式中，组合物包含合成c50类胡萝卜素化合物的微生物。在一些实施方式中，微生物是经培养的微生物。在一些实施方式中，微生物是经工程化的微生物。在一些实施方式中，相对于其它可比参考微生物，经工程化的微生物包含遗传改变，以便使经工程化的微生物以不同于参考微生物的绝对或相对水平产生c50类胡萝卜素化合物。在一些实施方式中，微生物是活的或有活力的。在一些实施方式中，微生物已被杀死。在一些实施方式中，微生物选自于由嗜根考克氏菌、谷氨酸棒杆菌、研究团队节杆菌以及它们的组合所组成的组。
30.在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物占组合物的至少20w/w％。
31.在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物是纯化的。
32.在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物具有在自然界中发现的化学结构。
33.在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物是自然界中发现的参考c50类胡萝卜素化合物的类似物。
34.在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物选自于由以下组成的组：癸异戊二烯黄素、c50
‑
虾青素、c50
‑
β
‑
胡萝卜素、c50
‑
胡萝卜素(n＝3)(16,16
‑
二异戊烯基八氢番茄红素)、c50
‑
玉米黄质、c50
‑
眉藻黄素、c50
‑
念珠藻黄素、八叠球菌黄素、sarprenoxanthin、无环c50类胡萝卜素菌红素、c50
‑
角黄素、c50
‑
番茄红素、c50
‑
八氢番茄红素以及它们的组合。在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物是癸异戊二烯黄素。
35.在一些实施方式中，治疗组合物为液体剂、糖浆剂、片剂、锭片剂(troche)、软糖(gummy)、胶囊剂、散剂、凝胶剂或膜剂。
36.此外，本文提供了用于制造治疗组合物的方法。例如，该方法可包括以下步骤：将药学上可接受的载体与c50类胡萝卜素化合物组合；以及将上述组合配制成治疗组合物。
37.在一些实施方式中，组合的步骤包括将药学上可接受的载体与合成c50类胡萝卜素化合物的微生物组合。
38.在一些实施方式中，组合的步骤包括将药学上可接受的载体与化学合成的c50类胡萝卜素化合物组合。
39.本文还提供了用于在受试者中治疗恶心和/或呕吐、或用于减轻厌食的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予如下的步骤：(i)c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物或其组分，(ii)c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物提取物，或(iii)经提取的c50
‑
类胡萝卜素化合物，或(iv)它们的组合
40.在一些实施方式中，受试者患有与化疗或放疗有关的恶心和/或呕吐，或处于发展出与化疗或放疗有关的恶心和/或呕吐的风险中。
41.在一些实施方式中，受试者患有化疗诱发的恶心和呕吐(cinv)或放疗诱发的恶心和呕吐(rinv)，或处于发展出化疗诱发的恶心和呕吐(cinv)或放疗诱发的恶心和呕吐(rinv)的风险中。在一些实施方式中，受试者患有术后恶心和呕吐(ponv)或处于发展出术后恶心和呕吐(ponv)的风险中。
42.在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物
‑
合成微生物选自于由嗜根考克氏菌、谷氨酸棒杆菌、研究团队节杆菌以及它们的组合组成的组。
43.此外，本文提供了c50类胡萝卜素化合物用于在有需要的受试者中治疗恶心和/或呕吐、或用于减轻厌食的用途，以及用于在有需要的受试者中治疗恶心和/或呕吐、或减轻厌食的用途的c50类胡萝卜素化合物。
44.还提供了c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物用于在有需要的受试者中治疗恶心和/或呕吐、或用于减轻厌食的用途，以及用于在有需要的受试者中治疗恶心和/或呕吐、或减轻厌食的用途的c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物。
45.在一些实施方式中，c50类胡萝卜素化合物
‑
合成微生物选自于由嗜根考克氏菌、谷氨酸棒杆菌、研究团队节杆菌以及它们的组合组成的组。
46.本文还提供了用于评估类胡萝卜素化合物的抗恶心和/或抗呕吐活性的方法。该方法包括以下步骤：(i)使系统与类胡萝卜素化合物接触；以及(ii)确定类胡萝卜素化合物是否改变了该系统的特征，其中，所述特征与恶心和/或呕吐有关。
47.在一些实施方式中，确定的步骤包括在实施接触的步骤之前和之后，对所述特征进行比较。
48.在一些实施方式中，确定的步骤包括在与可比参考接触的步骤之后，对所述特征进行比较。
49.在一些实施方式中，可比参考是历史参考。
50.在一些实施方式中，可比参考是阴性对照参考。
51.在一些实施方式中，可比参考是阳性对照参考。
52.在一些实施方式中，系统是或包括秀丽隐杆线虫。
53.在一些实施方式中，所述特征是厌食的水平。
54.在一些实施方式中，所述特征是核酸或蛋白质或其形式的水平或活性。
55.在一些实施方式中，所述特征是或包括异型生物质解毒应答的方面。
56.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的而非旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考均通过引用将其整体并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
57.本发明的实施方式的其它特征和优点将从以下的详细描述和附图以及从权利要求中显而易见。
附图说明
58.图1a
‑
图1e
59.a)在用野生型嗜根考克氏菌喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，pgp
‑
5p::gfp诱导显著降低，而突变体嗜根考克氏菌crteb(e17)、嗜根考克氏菌crti(e10)和嗜根考克氏菌crtye(e2)没有阻抑gfp诱导。
60.b)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，嗜根考克氏菌喂养显著降低了pgp
‑
5p::gfp诱导；而在嗜根考克氏菌突变体中，pgp
‑
5p::gfp表达未受影响。非配对t检验，**p<0.01。示出了平均值
±
s.d。将每个条件下分析的动物数量在各条的上面示出。ns为与用大肠杆菌op50喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp相比不显著。
61.c)嗜根考克氏菌突变体的变色表型。
62.d)嗜根考克氏菌中类胡萝卜素簇中的突变的意图示。
63.e)嗜根考克氏菌中的推定的c50类胡萝卜素生物合成途径。
64.图2a
‑
图2g
65.a)在用野生型谷氨酸棒杆菌喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，pgp
‑
5p::gfp诱导显著降低，而突变体谷氨酸棒杆菌δcrteb、δcrti、δcrty和δcrtb没有阻抑gfp诱导。
66.b)用野生型谷氨酸棒杆菌、突变体δcrteb、δcrti、δcrty和δcrtb喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的pgp
‑
5p::gfp表达的量化。非配对t检验，****p<0.0001。示出了平均值
±
s.d。将每个条件下分析的动物数量在各条的上面示出。ns为与用大肠杆菌op50喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp相比不显著。
67.c)在用野生型研究团队节杆菌喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，pgp
‑
5p::gfp诱导显著降低。
68.d)嗜根考克氏菌提取物的tlc显示出橙色色素。
69.e)嗜根考克氏菌提取物的hplc显示出橙色色素的吸光度。插图示出了提取物的不同峰的洗脱时间和吸光度。
70.f)750μg/ml的嗜根考克氏菌提取物抑制eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的pgp
‑
5p::gfp。
71.g)用野生型嗜根考克氏菌、嗜根考克氏菌crteb(e17)、嗜根考克氏菌crti(e10)和嗜根考克氏菌crteb(e6)(包括对照提取物或嗜根考克氏菌提取物)喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的pgp
‑
5p::gfp表达的量化。
72.图3a
‑
图3f
73.a)在用野生型嗜根考克氏菌喂养的动物中，响应于10mg/ml的潮霉素，pgp
‑
5p::gfp诱导显著降低，而突变体嗜根考克氏菌crteb(e17)或嗜根考克氏菌crti(e10)没有阻抑gfp诱导。
74.b)用嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物处理的动物对潮霉素高度敏感。非配对t检验，与用含有溶剂提取物和潮霉素的大肠杆菌op50喂养的野生型蠕虫相比，****p<0.0001。示出了平均值
±
s.d。数据从每个条件下至少20只动物的三个独立试验中收集。ns为与用含有溶剂提取物而不含潮霉素的大肠杆菌op50喂养的野生型相比不显著。
75.c)用嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物处理的动物对依米丁高度敏感。
76.d)用嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物处理的动物对顺铂高度敏感。
77.e)与用对照溶剂和潮霉素处理的动物相比，用嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物处理的动物未避开潮霉素。
78.f)与用对照溶剂和顺铂处理的动物相比，用嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物处理的动物未避开顺铂。非配对t检验，****p<0.01，**p<0.0001。示出了平均值
±
s.d。ns，不显著。
79.图4a
‑
图4e
80.a)在用大肠杆菌op50或嗜根考克氏菌(其在vha
‑
6启动子的控制下在肠中表达zip
‑
2::mcherry)喂养的动物中，pgp
‑
5p::gfp被组成性地诱导。
81.b)胆汁酸的补充阻抑了eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中嗜根考克氏菌诱导的pgp
‑
5p::gfp激活缺陷。
82.c)胆汁酸对eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中嗜根考克氏菌诱导的pgp
‑
5p::gfp激活缺陷的阻抑的量化示于图4b中。非配对t检验，***p<0.0001。示出了平均值
±
s.d。将每个条件下分析的动物数量在各条的上面示出。ns为与用大肠杆菌op50喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp相比不显著。
83.d)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，lbp
‑
5rnai、chc
‑
1rnai、fcho
‑
1rnai和dyn
‑
1rnai阻抑了嗜根考克氏菌诱导的pgp
‑
5p::gfp激活缺陷，而rme
‑
1rnai或rab
‑
5rnai没有阻抑gfp诱导。
84.e)嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物如何能够阻抑异型生物质解毒应答的诱导的工作模型。
85.图5a
‑
图5g
86.a)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，喂食嗜根考克氏菌抑制了pgp
‑
5p::gfp的诱导，而在嗜根考克氏菌突变体中，pgp
‑
5p::gfp表达不受影响。
87.b)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，在喂食12小时内，喂食嗜根考克氏菌阻抑了pgp
‑
5p::gfp诱导。
88.c)虽然喂食vrs
‑
2dsrna并转移到大肠杆菌的pgp
‑
5p::gfp动物显示出gfp的诱导，但在转移到嗜根考克氏菌板的动物中，pgp
‑
5p::gfp表达降低。
89.d)虽然喂食rpl
‑
1dsrna并转移到大肠杆菌的pgp
‑
5p::gfp动物显示出gfp的诱导，但在转移到嗜根考克氏菌板的动物中，pgp
‑
5p::gfp表达降低。
90.e)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，喂食嗜根考克氏菌显著降低了pgp
‑
5p::
gfp诱导，而在嗜根考克氏菌突变体中，pgp
‑
5p::gfp表达不受影响。
91.f)野生型嗜根考克氏菌的菌落颜色与六个突变体的菌落颜色不同。
92.g)从ems筛选观察到的嗜根考克氏菌突变体的菌落颜色。
93.图6a
‑
图6c
94.a)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，嗜根考克氏菌突变体未能阻抑pgp
‑
5p::gfp的诱导。
95.b)从23个基因组测序突变体中观察到的变色表型。
96.c)从野生型谷氨酸棒杆菌、突变体δcrteb、δcrti、δcrty和δcrtb观察到的变色表型。
97.图7
98.细菌的操纵子结构，其含有可能产生癸异戊二烯黄素的推定基因簇。
99.图8
100.不同属中crti蛋白的比对。示出了在不同属中发现的序列之间的氨基酸保守性。
101.图9
102.不同属中crtb蛋白的比对。示出了在不同属中发现的序列之间的氨基酸保守性。
103.图10
104.不同属中crteb蛋白的比对。示出了在不同属中发现的序列之间的氨基酸保守性。
105.图11
106.来自嗜根考克氏菌的、含有癸异戊二烯黄素的提取物的一种示例性的生化分离。
107.图12a
‑
图12b
‑
图12c
108.来自如下的甲醇提取物的分光光度分析：野生型嗜根考克氏菌、crti(e10)和crtb(e6)(12a)；野生型、crteb(e17)和crtyf(e18)(12b)；以及野生型、crteb(e17)和crtye(e22)(12c)。
109.图13a
‑
图13e
110.a)嗜根考克氏菌不诱导hsp
‑
4p::gfp。
111.b)野生型嗜根考克氏菌以及crteb(e17)或crti(e10)突变体不诱导hsp
‑
6p::gfp。
112.c)野生型嗜根考克氏菌以及crteb(e17)、crti(e10)、crtyf(e2)或crtye(e22)突变体诱导了clec
‑
60p::gfp。
113.d)野生型嗜根考克氏菌以及crteb(e17)或crti(e10)突变体不诱导f35e12.5p::gfp。
114.e)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，喂食嗜根考克氏菌诱导pgp
‑
5p::gfp的阻抑是可逆的。
115.图14a
‑
图14d。
116.a)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，n
‑
乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、trolox或白藜芦醇并未阻抑pgp
‑
5p::gfp。
117.b)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，β
‑
胡萝卜素或虾青素并未阻抑pgp
‑
5p::gfp。
118.c)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，表达玉米黄质、链孢红素、紫黄质、δ
‑
胡萝卜素或α
‑
胡萝卜素的大肠杆菌并未阻抑pgp
‑
5p::gfp。
119.d)在用野生型嗜根考克氏菌喂养的动物中，响应于10μg/ml和20μg/ml潮霉素的pgp
‑
5p::gfp诱导显著降低。在用大肠杆菌op50和野生型嗜根考克氏菌喂养的两种动物中，响应于50mg/ml潮霉素的pgp
‑
5p::gfp诱导均正常。
120.图15a
‑
图15e
121.a)在用野生型嗜根考克氏菌喂养的动物中，响应于2.5μg/ml或6.25μg/ml的依米丁的pgp
‑
5p::gfp诱导显著降低。然而，在用12.5μg/ml的依米丁处理的动物中，用嗜根考克氏菌喂养的动物中的所响应的pgp
‑
5p::gfp诱导部分地降低。在用25μg/ml的依米丁处理的动物中，用大肠杆菌op50或野生型嗜根考克氏菌处理的两种动物中的pgp
‑
5p::gfp的诱导均是正常的。
122.b)在用野生型嗜根考克氏菌喂养的动物中，响应于6.25μg/ml的依米丁的pgp
‑
5p::gfp诱导显著降低，而突变体嗜根考克氏菌crteb(e17)或嗜根考克氏菌crti(e10)并未阻抑gfp诱导。
123.c)在用野生型嗜根考克氏菌喂养的动物中，响应于1mm的顺铂的pgp
‑
5p::gfp诱导显著降低，而突变体嗜根考克氏菌crteb(e17)、crtye(e22)或crti(e10)未阻抑gfp诱导。
124.d)在不存在潮霉素的情况下，类胡萝卜素本身对蠕虫没有毒性。
125.e)用对照提取物或嗜根考克氏菌提取物喂养的动物对抗霉素敏感。
126.图16a
‑
图16c
127.a)zk892.4和c24a3.4蛋白共享序列相似性。
128.b)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，zk892.4 rnai或c24a3.4rnai的失活并未阻抑pgp
‑
5p::gfp诱导，而zk892.4和c24a3.4的双rnai阻抑了gfp诱导。
129.c)chc
‑
1、fcho
‑
1或lbp
‑
5的rnai不诱导pgp
‑
5p::gfp。
130.定义
131.给予：如本文所使用的，术语“给予”通常是指向受试者或系统给予组合物，以实现试剂向受试者或系统的递送。在一些实施方式中，试剂是组合物或被包含在组合物中；在一些实施方式中，试剂通过组合物或其一种或多种组分的代谢产生。本领域普通技术人员知晓在适当的情况下可用于向受试者(例如人)给予的多种途径。例如，在一些实施方式中，给予可为眼部、口服、肠胃外、局部给予等。在一些特定的实施方式中，给予可为支气管(例如通过支气管滴注)、颊、皮肤(其可以是或包括例如，局部至真皮、皮内、皮间、经皮等的一种或多种)、肠内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(例如肝内)、黏膜、鼻部、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(例如通过气管内滴注)、阴道、玻璃体给予等。在本公开提供的许多实施方式中，给予是口服给予。在一些实施方式中，给予可以仅涉及单剂量。在一些实施方式中，给予可以涉及施用固定数量的剂量。在一些实施方式中，给予可以涉及间歇性(例如时间上分开的多个剂量)给药和/或周期性(例如由共同的时间段分开的单个剂量)给药。在一些实施方式中，给予可以涉及连续给药(例如灌注)至少选定的时间段。
132.类似物：如本文所使用的，术语“类似物”是指与参考物质共享一个或多个特定结构特征、元素、组分或部分的物质。通常，“类似物”与参考物质显示出显著的结构相似性，例如共享核结构或共有结构，但也以某些离散方式(discrete ways)不同。在一些实施方式中，类似物是可以从参考物质产生的物质，例如通过参考物质的化学操作。在一些实施方式
中，类似物是可通过实施与产生参考物质的合成方法实质上相似(例如与其共享多个步骤)的合成方法而产生的物质。在一些实施方式中，类似物是或可以通过实施不同于用于产生参考物质的合成方法来产生。
133.类胡萝卜素化合物：如本文所使用的，术语“类胡萝卜素化合物”是指作为结构多样的一类天然存在的类胡萝卜素色素的成员的化合物、及其结构类似物。在自然界中，类胡萝卜素化合物通常从类异戊二烯途径中间体合成。类胡萝卜素可以是无环的或环状的，并且可以包含或可以不包含氧，因此在一些实施方式中，术语“类胡萝卜素”可以包括胡萝卜素和叶黄素两者。许多类胡萝卜素具有强吸光性。通常，类胡萝卜素是具有共轭多烯碳骨架的烃类化合物，其形式上源自五碳化合物异戊烯焦磷酸。在一些实施方式中，类胡萝卜素化合物可以是三萜类(c30二脱辅基类胡萝卜素(diapocarotenoid))、四萜类(c40类胡萝卜素)或例如长度为c35、c50、c60、c70、c80或其它长度的其它化合物。在一些实施方式中，类胡萝卜素可具有超过c200的长度。自然界中已鉴别出超过1000种的不同的类胡萝卜素。类胡萝卜素包括但不限于：花药黄质、金盏花红素(adonirubin)、金盏花黄质(adonixanthin)、虾青素、角黄素、辣椒玉红素(capsorubrin)、β
‑
隐黄素、α
‑
胡萝卜素、β
‑
胡萝卜素、β,ψ
‑
胡萝卜素、δ
‑
胡萝卜素、ε
‑
胡萝卜素、海胆酮、3
‑
羟基海胆酮、3'
‑
羟基海胆酮、γ
‑
胡萝卜素、ψ
‑
胡萝卜素、4
‑
酮
‑
γ
‑
胡萝卜素、ζ
‑
胡萝卜素、α
‑
隐黄素、脱氧屈曲黄素、硅藻黄质、7,8
‑
二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素、岩藻黄质、岩藻黄醇(fucoxanthinol)、异胡萝卜素、β
‑
异胡萝卜素、莴苣黄素(lactucaxanthin)、叶黄素、番茄红素、myxobactone、新黄质、链孢红素、羟基链孢红素、多甲藻素(peridinin)、八氢番茄红素、视紫红质、视紫红质葡萄糖苷、4
‑
酮
‑
玉红黄质、管藻黄质(siphonaxanthin)、球形烯(spheroidene)、spheroidenone、螺菌黄素、圆酵母素、4
‑
酮
‑
圆酵母素、3
‑
羟基
‑4‑
酮
‑
圆酵母素、尿酸酯(uriolide)、尿酸醋酸酯(uriolide acetate)、紫黄质、玉米黄质
‑
β
‑
二葡糖苷、玉米黄质和c30类胡萝卜素。此外，类胡萝卜素化合物包括这些分子的衍生物，其可包括羟基
‑
官能团、甲氧基
‑
官能团、氧代
‑
官能团、环氧基
‑
官能团、羧基
‑
官能团或醛官能团。例如，类胡萝卜素包括氧化衍生物。此外，所包括的类胡萝卜素化合物包括酯(例如糖苷酯、脂肪酸酯)和硫酸酯衍生物(例如酯化的叶黄素)。
134.类胡萝卜素修饰：如本文所使用的，术语“类胡萝卜素修饰”是指对宿主生物体的修饰，如本文所述，所述修饰调节一种或多种类胡萝卜素的产生。例如，胡萝卜素生成修饰可以增加一种或多种类胡萝卜素的生产水平，和/或可以改变不同的类胡萝卜素的相对生产水平。原则上，与未经受过相同修饰的其它方面相同的生物体中产生的水平相比，创造性的胡萝卜素生成修饰可以是在宿主生物体中对由该生物体产生的一种或多种类胡萝卜素的产生进行适当地改变的任何化学、生理学、遗传学或其它修饰。然而，在大多数实施方式中，胡萝卜素生成修饰将包括遗传修饰，该遗传修饰通常引起一种或多种选定的类胡萝卜素的产生增加。在一些实施方式中，选定的类胡萝卜素是一种或多种c50类胡萝卜素化合物。
135.类胡萝卜素生物合成多肽：术语“类胡萝卜素生物合成多肽”是指参与一种或多种类胡萝卜素的合成的任何多肽。仅举几个实例，这些类胡萝卜素生物合成多肽包括例如：八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶(或去饱和酶)、番茄红素环化酶、类胡萝卜素酮酶、类胡萝卜素羟化酶、虾青素合酶、类胡萝卜素ε羟化酶、番茄红素环化酶(β和ε亚基)、类胡萝
卜素葡糖基转移酶和酰基辅酶a:二酰基甘油酰基转移酶。
136.类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物：如本文所使用的，短语“类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物”是指合成一种或多种类胡萝卜素化合物的微生物(例如藻类、真菌、细菌)。在一些实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物可以天然地合成一种或多种类胡萝卜素化合物。在一些实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物包括胡萝卜素生成修饰。在一些实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物可以进行遗传修饰(例如，以具有一种或多种遗传改变)，使其以不同于未经此类遗传修饰(即不含遗传改变)的其它方面可比的参考微生物的绝对或相对水平合成一种或多种类胡萝卜素。例如，在一些实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物已被遗传工程化，以合成不存在遗传工程化的微生物不会合成的至少一种类胡萝卜素化合物。可替代地，在一些实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物可能已被遗传工程化，以使其一种或多种特定类胡萝卜素化合物的合成可以处于相对于不存在遗传工程化的微生物而言更高的水平。在一些实施方式中，可以参考阈值水平来评估更高的水平；在一些实施方式中，可以参考同样由该微生物(在遗传工程化之前)产生的另一种化合物(例如另一种的类胡萝卜素化合物)来评估更高的水平。在一些特定的实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物可能已经被遗传修饰，以添加或增加编码类胡萝卜素生物合成多肽的一种或多种基因的表达。可替代地，或另外地，在一些实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物可能已被遗传修饰，以增加通过类胡萝卜素生物合成途径的碳流量(例如通过减少向一种或多种其它生物合成或代谢途径的碳转移)。在一些实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物可合成具有特定碳单元数的一种或多种类胡萝卜素化合物。例如，在一些实施方式中，类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物可合成(天然地或作为遗传修饰的结果)一种或多种c50类胡萝卜素化合物；这种微生物可称为c50
‑
合成微生物。
137.可比的：如本文所使用的，术语“可比的”是指两种以上试剂、实体、情况、条件组等可能彼此不相同但足够相似以允许在它们之间进行比较，使得本领域技术人员将理解，可以基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方式中，条件、环境、个体或群体的可比组的特征在于多个实质上相同的特征以及一个或少数不同的特征。本领域普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定情况下需要何种同一性程度来将两种以上此类试剂、实体、情况、条件组等视为可比的。例如，本领域的普通技术人员将理解，当环境、个体或群体的组的特点是足够数量和类型的实质上相同的特征以确保下述结论是合理的时，所述环境、个体或群体的组彼此之间是可比的：在不同的环境、个体或群体的组下，或以不同的环境、个体或群体的组，得到的结果或观察到的现象中的差异是由那些不同的特征的改变所引起的或表明所述改变。
138.剂型：本领域技术人员将理解，术语“剂型”可用于指用来给予至受试者的试剂(例如治疗剂)的物理离散单元。通常，每个这样的单元包含预定量的试剂。在一些实施方式中，这样的量是适合于根据下述给药方案进行给予的单位剂量(或其全部部分)：当给予相关群体时，已确定所述给药方案与期望的或有益的结果相关(即，治疗性给药方案)。本领域普通技术人员理解，给予至特定受试者的治疗组合物或试剂的总量由一名或多名主治医师确定并且可能涉及多种剂型的给予。
139.给药方案：本领域技术人员将理解，术语“给药方案”可用于指各自给予至受试者的单位剂量(通常多于一个)的组，通常以时间段间隔开。在一些实施方式中，给定的试剂具
有推荐的给药方案，该方案可能涉及一个或多个剂量。在一些实施方式中，给药方案包括多个剂量，多个剂量中的每一个与其它剂量在时间上间隔开。在一些实施方式中，单个剂量彼此间隔相同长度的时间段；在一些实施方式中，给药方案包括多个剂量和将单个剂量间隔开的至少两个不同的时间段。在一些实施方式中，给药方案内的所有剂量均具有相同的单位剂量的量。在一些实施方式中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施方式中，给药方案包括处于第一剂量的量的第一剂量，继以处于不同于第一剂量的量的第二剂量的量的一种或多种额外剂量。在一些实施方式中，给药方案包含处于第一剂量的量的第一剂量，继以处于与第一剂量的量相同的第二剂量的量的一种或多种额外剂量。在一些实施方式中，当在相关群体中进行给予时，给药方案与期望的或有益的结果相关。
140.经工程化的：通常，术语“经工程化的”是指人为操作的方面。例如，如果已对细胞或生物体进行操作以使其遗传信息改变(例如，例如通过转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其它机制，引入先前不存在的新遗传物质，或者例如通过替换或缺失突变、或通过交配方案，改变或去除先前存在的遗传物质)，则认为该细胞或生物体是“经工程化的”。如本领域技术人员所理解和惯常实践的，即使对在先的实体(prior entity)进行实际操作，通常仍将经工程化的多核苷酸或细胞的子代称为“经工程化的”。
141.赋形剂：如本文所使用的，赋形剂是指可被包含在药物组合物中的无活性(例如非治疗性)试剂，例如用以提供或有助于期望的稠度或稳定作用。在一些实施方式中，合适的药物赋形剂可以包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
142.功能性的：如本文所使用的，“功能性的”生物分子是下述生物分子，所述生物分子处于其表现出其被表征的性质和/或活性的形式。生物分子可能具有两种功能(即双功能的)或多种功能(即多功能的)。
143.改善、增加、抑制或减少：如本文所使用的，术语“改善”、“增加”、“抑制”、“减少”或其语法等同物表示相对于基线或其它参考测量的值。在一些实施方式中，适当的参考测量可以是或包括在不存在(例如之前和/或之后)特定试剂或处理的情况下、或在存在适当的可比参考试剂的情况下，在其它可比条件下的特定系统(例如单个个体)中的测量。在一些实施方式中，适当的参考测量可以是或包括在存在相关试剂或处理的情况下，已知或预期以特定方式响应的可比系统中的测量。在一些实施方式中，适当的参考是阴性参考；在一些实施方式中，适当的参考是阳性参考。
144.分离的：如本文所使用的，“分离的”是指(1)在最初生产(无论是在自然界和/或在实验环境中)时，已经与至少一些与其相关的组分分离的物质和/或实体，和/或(2)人为设计、生产、制备和/或制造的物质和/或实体。在一些实施方式中，分离的物质或实体可被富集；在一些实施方式中，分离的物质或实体可以是纯的。在一些实施方式中，分离的物质和/或实体可分离自约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的与它们最初相关的其它组分。在一些实施方式中，分离的试剂的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或超过约99％。如本文所使用的，如果物质实质上不含其它组分，则该物质是“纯的”。在一些实施方式中，如本领域技术人员所理解的，在与某些其它组分(例如诸如一种或多种载体或赋形
剂，例如缓冲液、溶剂、水等)组合后，物质仍可被视为“富集的”、“分离的”、或甚至“纯的”；在此类实施方式中，计算物质的分离百分比或纯度而不包括此类载体或赋形剂。本领域技术人员知晓用于分离(例如富集或纯化)物质或试剂(例如使用分馏、萃取、沉淀或其它分离中的一种或多种)的多种技术。
145.药物组合物：如本文所使用的，术语“药物组合物”是指其中将活性试剂与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的组合物。在一些实施方式中，活性试剂以适于在治疗方案中给予的单位剂量存在，当给予相关群体时，该治疗方案显示出达到预定治疗效果的统计学上显著的可能性。在一些实施方式中，药物组合物可被具体配制用于以固体或液体形式进行给予，包括适宜于下列的给予形式：口服给予，例如灌服剂(水性或非水性的溶液或混悬液)、片剂(例如旨在用于颊吸收、舌下吸收和全身吸收的片剂)、大丸剂(bolus)、散剂、颗粒剂、应用于舌部的膏剂、胶囊剂、散剂等。在一些实施方式中，活性试剂可以是或包含细胞或细胞群(例如培养物，如类胡萝卜素化合物合成微生物)；在一些实施方式中，活性试剂可以是或包含细胞或细胞群(例如培养物)的提取物或组分。在一些实施方式中，活性试剂可以是或包含分离的、纯化的或纯的化合物。在一些实施方式中，活性试剂可能已经在体外合成(例如通过化学和/或酶促合成)。在一些实施方式中，活性试剂可以是或包含天然产物(无论是从其天然来源分离还是在体外合成)。
146.药学上可接受的：如本文所使用的，例如提及用于配制如本文所公开的药物组合物的载体、稀释剂或赋形剂时可以使用的术语“药学上可接受的”意味着载体、稀释剂或赋形剂与组合物的其它成分相容并且对其接受者无害。
147.药学上可接受的载体：如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或辅料，例如液体或固体的填料、稀释剂、赋形剂、或溶剂包封材料，参与将目标化合物从机体的一个器官或部分搬运或转运到机体的另一器官或部分。从与制剂的其它成分相容且对患者无害的意义上来说，每种载体都必须是“可接受的”。可作为药学上可接受载体的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；粉状西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡(suppository waxes)；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水(pyrogen
‑
free water)；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；ph缓冲溶液；聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酸酐类；以及其它用于药物制剂的无毒相容性物质。
148.预防：如本文所使用的，术语“预防”是指特定疾病、障碍或病症的一种或多种症状的发作的延迟、和/或频率和/或严重性的降低。在一些实施方式中，预防是在群体基础上进行评估的，使得如果在易患疾病、障碍或病症的群体中观察到该疾病、障碍或病症的一种或多种症状的发展、频率和/或强度在统计学上显著降低，则认为该试剂“预防”了该特定疾病、障碍或病症。在一些实施方式中，例如当疾病、障碍或病症的发作已延迟预定时间段时，可认为预防是完全的。
149.参考：如本文所使用的，参考描述了相对其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方式中，将感兴趣的试剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照试剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方式中，与感兴趣的测试或测定实质上同
时对参考或对照进行测试和/或测定。在一些实施方式中，参考或对照是任选地体现在有形介质中的历史参考或对照。通常，如本领域技术人员所理解的，参考或对照是在与评估对象可比的条件或环境下测定或表征的。本领域的技术人员将理解何时存在足够的相似性，以证明对特定的可能参考或对照的依赖和/或比较是正当的。在一些实施方式中，参考是阴性对照参考；在一些实施方式中，参考是阳性对照参考。
150.风险：如从上下文可以理解的，疾病、障碍和/或病症的“风险”是指特定个体发展出疾病、障碍和/或病症的可能性。在一些实施方式中，将风险表示为百分比。在一些实施方式中，风险为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、直至100％。在一些实施方式中，将风险表示为相对于与参考样品或参考样品组相关的风险而言的风险。在一些实施方式中，参考样品或参考样品组具有疾病、障碍、病症和/或事件的已知风险。在一些实施方式中，参考样品或参考样品组来自与特定个体可比的个体。在一些实施方式中，相对风险为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
151.样品：如本文所使用的，术语“样品”通常是指获得自或源自感兴趣的来源的材料的试样。在一些实施方式中，感兴趣的来源是生物或环境来源。在一些实施方式中，感兴趣的来源可以是或包括细胞或生物体，例如微生物、植物或动物(例如人)。在一些实施方式中，感兴趣的来源是或包括生物组织或流体。在一些实施方式中，生物组织或流体可以是或包括羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、母乳、脑脊液、耵聍、乳糜、chime、射出的精液、内淋巴、渗出物、排泄物、胃酸、胃液、淋巴、黏液、心包液、外淋巴、腹膜液、胸水、脓液、发炎性分泌物(rheum)、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰、滑液、汗液、眼泪、尿液、阴道分泌物、玻璃体液、呕吐物和/或它们的组合或组分。在一些实施方式中，生物流体可以是或包括细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、间质液、淋巴液和/或跨细胞液。在一些实施方式中，生物流体可以是或包括植物分泌物。在一些实施方式中，生物组织或样品可以通过如下获得，例如抽吸、活检(例如细针或组织活检)、拭子(例如口腔拭子、鼻拭子、皮肤拭子或阴道拭子)、刮片、手术、洗涤或灌洗(例如支气管肺泡洗涤或灌洗、导管洗涤或灌洗、鼻部洗涤或灌洗、眼部洗涤或灌洗、口腔洗涤或灌洗、子宫洗涤或灌洗、阴道洗涤或灌洗或其它洗涤或灌洗)。在一些实施方式中，生物样品是或包括从个体获得的细胞。在一些实施方式中，样品是通过任何合适的方式直接从感兴趣的来源获得的“初级样品”。在一些实施方式中，如从上下文中将清楚的，术语“样品”是指通过加工(例如通过去除一种或多种组分和/或通过向其中添加一种或多种试剂)初级样品而获得的制剂。例如，使用半透膜进行过滤。这样的“经加工的样品”可以包括例如从样品中提取或者通过使初级样品经受一种或多种技术(例如核酸的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等)而获得的核酸或蛋白质等。
152.受试者：如本文所使用的，术语“受试者”是指对其施用所提供的治疗的个体。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如，经历或易患如本文所述的疾病、障碍或病症的哺乳动物；在一些实施方式中，受试者是人或非人的兽类受试者，例如猿、猫、狗、猴或猪。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，患者患有或易患如本文所述的一种或多种疾病、障碍或病症。在一些实施方式中，患者表现出如本文所述的一种或多种疾病、障碍或病症的一种或多种症状。在一些实施方式中，患者已被诊断患有如本文所述的一种或多种疾病、障碍或病症。在一些实施方式中，障碍或病症是或包括恶心和/或呕吐，和/或一种或多种厌食障碍。在一些实施方式中，受试者患有或易患癌症，或存在一种或多种肿瘤。在一
些实施方式中，受试者正在接受或已经接受某些疗法以诊断和/或治疗疾病、障碍或病症。在一些实施方式中，受试者已经接受了诱发恶心和/或呕吐的疗法(例如化疗、放疗和/或手术)。
153.症状减轻：根据本发明，当特定疾病、障碍或病症的一种或多种症状在幅度(例如强度、严重性等)和/或频率方面降低时，“症状减轻”。为清楚的目的，认为特定症状发作的延迟是降低该症状的频率的一种形式。
154.治疗方案：如该术语在本文中所使用的，“治疗方案”是指给药方案，该给药方案在相关群体中的给予可以与期望的或有益的治疗结果相关。
155.治疗有效量：如本文所使用的，治疗有效量是指产生其给予所针对的期望的效果的量。在一些实施方式中，该术语是指当根据治疗性给药方案向患有或易患疾病、障碍和/或病症的群体给予时，足以治疗该疾病、障碍和/或病症的量。在一些实施方式中，治疗有效量是降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状的发生率和/或严重性和/或延迟发作的量。本领域普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上并不需要在特定个体中实现成功治疗。而是，治疗有效量可以是当向需要此类治疗的患者给予时在大量受试者中提供特定的期望药理学应答的量。在一些实施方式中，提及治疗有效量可以提及如在一种或多种特定组织(例如受疾病、障碍或病症影响的组织)或流体(例如血液、唾液、血清、汗液、眼泪、尿液等)中测量的量。本领域普通技术人员将理解，在一些实施方式中，治疗有效量的特定试剂或疗法能够以单剂量进行配制和/或给予。在一些实施方式中，治疗有效的试剂能够以多个剂量进行配制和/或给予，例如作为给药方案的一部分。
156.治疗/处理：如本文所使用的，术语“治疗/处理(treatment/treat/treating)”是指下述疗法的任何给予，所述疗法部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征和/或病因，延迟特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征和/或病因的发作，降低特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征和/或病因的严重程度，和/或降低特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征和/或病因的发生率。在一些实施方式中，此类治疗可以针对不表现出相关疾病、障碍和/或病症的征象的受试者和/或仅表现出疾病、障碍和/或病症的早期征象的受试者。可替代地，或另外地，此类治疗可以针对表现出相关疾病、障碍和/或病症的一种或多种确定征象的受试者。在一些实施方式中，治疗可以针对已被诊断为患有相关疾病、障碍和/或病症的受试者。在一些实施方式中，治疗可以针对已知具有一种或多种易感因素的受试者，所述一种或多种易感因素与相关疾病、障碍和/或病症的增加的发展风险在统计学上相关。
具体实施方式
157.作为线虫的秀丽隐杆线虫对由例如微生物毒素引起的基本细胞活动中的缺陷进行监控，并通过对细胞监控激活的解毒和防御(csadd)应答进行激活来做出响应(melo和ruvkun，2012)。核糖体的丰富的rna和蛋白质以及介导mrna向蛋白质翻译的其它蛋白质可以是微生物毒素和毒力因子的靶标。对这些翻译组分的活性进行监测，并且可以对由毒素或突变引起的蛋白质合成的缩减进行检测。缩减的检测与信号转导级联相耦合，以激活异型生物质解毒和行为应答，例如厌食与p38mapk、bzip/zip
‑
2转录因子和胆汁酸样生物合成途径相耦合(melo和ruvkun，2012；dunbar等，2012；govindan等，2015)。通过监测核心细胞
功能(而非未知毒素的分子结构)的缩减，秀丽隐杆线虫可以检测出意料之外的病原体和毒素。这种信号传导级联的许多组成部分(例如map激酶和胆汁酸生物合成途径)在动物之间是保守的；本公开认识到，csadd系统的毒素监控和应答可以适用于秀丽隐杆线虫以外的动物，并且进一步教导了秀丽隐杆线虫可以用作模型系统来表征调节该系统的试剂，并且可以用于如本文所述的某些治疗性应用。
158.本公开进一步认识到，与秀丽隐杆线虫csadd系统类似或同源的动物防御策略可能会驱动细菌对策的进化以阻挠这些防御应答；宿主和病原体之间的这种进化军备竞赛有很多实例。本公开还认识到，共生细菌也可以试图使这种动物防御应答沉默，以建立良性或共生关系。
159.本公开进一步认识到，微生物(例如细菌)合成具有显著的生物活性的各种化合物，包括靶向核糖体和/或相关翻译因子的化合物(berdy等，2005)；此类微生物已被证明是药物或候选药物化合物的生产来源。本公开(i)教导了可以抑制某些解毒途径的试剂的有用的治疗性应用；(ii)提供了用于评估与此类解毒途径的抑制相关的试剂的一个或多个特征的系统；以及(iii)鉴别了此类试剂的潜在来源(例如诸如细菌的微生物，其在一些实施方式中可以是共生微生物)。
160.例如，本公开提供了，某些细菌菌株(例如产生某些类胡萝卜素化合物、特别是某些c50类胡萝卜素化合物的菌株)可以是根据本公开的有用的试剂(例如某些有用的类胡萝卜素化合物)的良好来源。此外，本公开提供了用于评估此类试剂的一个或多个相关特征的技术。
161.在就下述活性对多种细菌进行的微生物阻抑筛选中，从野生型嗜根考克氏菌中鉴别出了潜在的活性：在具有遗传诱导的翻译缺陷的秀丽隐杆线虫中，所述活性消除了异型生物质解毒基因的激活(govindan等，2015)。使用了嗜根考克氏菌的遗传分析来表明c50类胡萝卜素化合物可以阻抑秀丽隐杆线虫翻译毒素防御应答。
162.如本文所示，产生c50类胡萝卜素化合物癸异戊二烯黄素的嗜根考克氏菌抑制了秀丽隐杆线虫csadd翻译和dna损伤毒素防御应答。嗜根考克氏菌的c50类胡萝卜素生物合成途径中的突变体未能抑制此种秀丽隐杆线虫异型生物质解毒应答(图1a
‑
图1c)。嗜根考克氏菌的提取物阻抑了此种秀丽隐杆线虫异型生物质解毒应答，并且还恢复了嗜根考克氏菌的类胡萝卜素突变体实现此种阻抑的能力(图2b&图2c)。嗜根考克氏菌提取物还阻抑了响应于靶向翻译的毒素的、对秀丽隐杆线虫异型生物质解毒途径的诱导(图3a、图15c)。嗜根考克氏菌c50类胡萝卜素化合物还阻抑了其它基因(例如蛋白质合成所需的核心核糖体蛋白或氨酰trna合成酶)的rna干扰失活的应答。来自谷氨酸棒杆菌的c50类胡萝卜素还抑制了响应于翻译缺陷的、对秀丽隐杆线虫异型生物质解毒途径的诱导，这表明c50类胡萝卜素对秀丽隐杆线虫监控的调节不限于一种特定的细菌菌株。
163.本公开教导了某些类胡萝卜素化合物(例如某些c50类胡萝卜素化合物)可用于各种治疗性应用，特别地包括治疗恶心和/或呕吐(具体包括诱发的恶心和/或呕吐，例如化疗诱发的恶心和/或呕吐)。类胡萝卜素在光合作用细菌和植物中研究得最多，其中类胡萝卜素是光合作用中的辅助吸光组分(edge等，1997)。在光合叶绿素簇中，类胡萝卜素可以吸收光能并将其转移到光合电子传递系统，然后产生ph梯度，这是因为光子泵浦电子(photon
‑
pumped electrons)的还原势能引起多种铁硫和血红素蛋白的物理运动，从而使质子移动
穿过脂质双层。光合细菌之间的共同点是对可见光波长的强吸收和这些色素的脂溶性。这些细菌是高度着色的，因为类胡萝卜素非常丰富并且具有共轭双键系统，该系统将电子离域到非常大的共振稳定势阱，其轨道跃迁的能量比标准生化键低得多。类胡萝卜素也是光合作用中已知的抗氧化剂。然而，如本文所示，因为其它抗氧化剂不能阻抑秀丽隐杆线虫监控，因此，类胡萝卜素的抗氧化活性并不能解释动物药物解毒应答的阻抑。
164.c50类胡萝卜素化合物可以通过膜流动性的简单变化来影响翻译组分的动物监控。如本文所示，c50类胡萝卜素化合物通过抑制胆汁酸生物合成途径阻抑了秀丽隐杆线虫异型生物质解毒应答的诱导。虽然传统上认为胆汁酸是帮助消化的脂肪乳化剂，但最近的几项研究发现胆汁酸在新陈代谢和免疫途径中是很重要的信号传导分子。胆汁酸信号传导可能参与人类药物解毒应答的诱导或cinv。在翻译和dna损伤反应的秀丽隐杆线虫监控中，类胡萝卜素的脂溶性和丰度可能有助于它们的抗胆汁酸信号功能。
165.csadd应答不仅可以诱导异型生物质解毒，还可以诱发厌食行为。由于许多毒素来源于可能与食物腐烂相关或导致食物腐烂的细菌病原体，对食物的厌恶是适当的动物应答。对与诱导异型生物质解毒和细菌免疫途径相关的食物的厌恶很可能是源于这种进化史的动物程序。本公开提供了如下的观点：人类中的化疗诱发的恶心和呕吐(cinv)应答可能与这些异型生物质厌恶程序有关。有趣的是，在癌症患者中用于阻断dna复制的顺铂具有很高的致吐潜力。依米丁(emetine)是靶向真核蛋白质合成的抗生素，顾名思义，它也是高度催吐的。这两种药物不仅能够在秀丽隐杆线虫中诱导异型生物质解毒应答，还诱导了强烈的厌食。pgp
‑
5abc转运体基因受到导致dna损伤的毒素的强烈诱导，并且也受到抑制翻译的、在化学上非常不同的毒素的强烈诱导(但不会受到靶向其它途径(如线粒体或er)的各种毒素的诱导)(govindan等，2015年)。因此，本公开教导了秀丽隐杆线虫厌食是用于研究人类cinv潜在机制的良好模型。
166.血清素途径参与了秀丽隐杆线虫厌食以及人类cinv(melo和ruvkun，2012)。肝脏药物解毒和清除是癌症化疗的关键问题；在耐药性癌症患者中经常观察到消除药物更快的abc转运体的扩增。嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物引起对如下异型生物质的高度敏感性：靶向蛋白质翻译的异型生物质，以及通过阻抑药物解毒途径的诱导而引起dna损伤的异型生物质。此外，嗜根考克氏菌的c50类胡萝卜素化合物阻抑了由致吐毒素、依米丁或顺铂诱发的厌食。
167.作为用于治疗恶心和/或呕吐(例如诱发的恶心和/或呕吐，如cinv、rinv等)和/或降低其风险的疗法，可根据本公开使用c50类胡萝卜素化合物，例如癸异戊二烯黄素、c50
‑
虾青素、c50
‑
β
‑
胡萝卜素、c50
‑
胡萝卜素(n＝3)(16,16
‑
二异戊烯基八氢番茄红素)、c50
‑
玉米黄质、c50
‑
眉藻黄素、c50
‑
念珠藻黄素、八叠球菌黄素、sarprenoxanthin、无环c50类胡萝卜素菌红素、c50
‑
角黄素、c50
‑
番茄红素、c50
‑
八氢番茄红素。可替代地，或另外地，本公开提供了此类c50类胡萝卜素化合物可用作治疗一种或多种厌食障碍(例如神经性厌食症)和/或降低其风险的疗法。更进一步地，本公开提供了用于评估与本文所述疗法的有用性(即，用于治疗恶心和/或呕吐和/或一种或多种厌食障碍，和/或降低它们的风险)相关的试剂的一个或多个特征的系统，并且还表明有用的此类试剂包括由某些微生物(例如细菌)产生的化合物，所述微生物包括某些共生微生物。使用此种系统，本公开记载了某些类胡萝卜素化合物(例如c50类胡萝卜素化合物)的有用性，所述类胡萝卜素化合物包括由各种细菌
菌株产生的(例如由细菌酶合成的)类胡萝卜素化合物。阅读本公开的本领域技术人员将理解，各种其它化合物(包括各种其它类胡萝卜素化合物)是由微生物产生的，和/或可以(和/或已经)通过化学合成来制造，并就其活性(例如其中示例的系统中所体现出的活性)进行了评估。因此，阅读了本公开的本领域普通技术人员将理解的是，提供了多种化学试剂，具体包括类胡萝卜素化合物并以c50类胡萝卜素作为示例，它们易于如本文所述进行评估和/或用作如本文所述的治疗剂。
168.治疗/处理方法
169.本公开提供的方法包括用于治疗某些疾病、障碍和病症的方法。在一些实施方式中，相关疾病、障碍和病症可以是或包括恶心和/或呕吐，和/或某些厌食障碍。在一些实施方式中，可如本文所述进行治疗的恶心和/或呕吐可与如下的一种或多种相关：晕动病、晕船病、怀孕(例如孕吐或妊娠剧吐)、疼痛、情绪压力、胆囊疾病、心脏病发作、脑震荡或脑损伤(例如脑肿瘤)、暴饮暴食、胆囊疾病、感染、溃疡、胃轻瘫、肠梗阻、阑尾炎、感染(例如病毒感染)等。
170.在一些实施方式中，可如本文所述进行治疗的恶心和/或呕吐可以是诱发的恶心和/或呕吐，例如由毒素的摄入或对毒素的其它暴露(例如食物中毒、药物诱发的恶心和/或呕吐、醉酒等)诱发的。在一些实施方式中，可如本文所述进行治疗的诱发的恶心和/或呕吐可以是与化疗或放疗相关的恶心和/或呕吐。在一些实施方式中，可如本文所述进行治疗的诱发的恶心和/或呕吐可以是cinv或放疗诱发的恶心和呕吐(rinv)；通常，至少三类呕吐与化疗剂的使用有关，即急性呕吐、延迟性呕吐和预期性呕吐。在一些实施方式中，可如本文所述进行治疗的诱发的恶心和/或呕吐可以是或包括例如术后恶心和呕吐(ponv)。
171.通常，本公开提供的治疗方法涉及向需要或已确定需要此类治疗的受试者给予治疗有效量的如本文所述的类胡萝卜素化合物。
172.在一些实施方式中，本文提供的治疗方法是预防的或预防性的，例如可以在表现出显著症状之前和/或暴露于与恶心和/或呕吐有关的特定预期诱因(例如化疗、放疗、手术或其它治疗(例如药物治疗))之前，向受试者给予所述方法。
173.在一些实施方式中，本文提供的治疗方法是治疗性的，例如可以在发展出恶心和/或呕吐的显著症状之后(例如在恶心或呕吐的至少一次发作期间或之后)，向受试者给予所述方法。
174.在优选的实施方式中，向作为哺乳动物(例如经历如本文所述的疾病、障碍或病症的哺乳动物)的受试者给予所提供的治疗方法；在一些实施方式中，受试者是人或非人的兽类受试者，例如猿、猫、狗、猴或猪。
175.在许多实施方式中，“治疗/处理”涉及改善与恶心相关的疾病、障碍或病症的至少一种症状。通常，恶心导致厌食、食欲不振和/或热量摄入减少，并可能导致体重减轻；在一些实施方式中，给予治疗有效量的本文所述的类胡萝卜素化合物可引起恶心、呕吐和/或厌食的减少。可替代地或另外地，在一些实施方式中，给予治疗有效量的如本文所述的类胡萝卜素化合物可实现食欲的恢复，和/或恢复或接近正常的热量摄入，体重减轻的减少、停止或减缓，体重增加/增重，和/或恶心、呕吐、厌食和/或食欲不振的当前或未来发作的频率、持续时间或严重程度的降低。
176.在一些实施方式中，该方法可以包括在给予预期与恶心和/或呕吐相关的治疗之
前、期间(例如同时)或之后，给予治疗有效量的类胡萝卜素化合物，例如即将接受化疗、放疗或与恶心和呕吐相关的其它治疗的受试者。
177.在一些实施方式中，接受本文所述治疗的受试者可能正在接受和/或可能已经接受其它治疗(例如化疗、放疗、手术等)，例如可能诱发呕吐或可能旨在治疗如本文所述的疾病、障碍或病症的一种或多种症状或特征的其它治疗，从而使得类胡萝卜素疗法与此类其它疗法组合给予以治疗相关疾病、障碍或病症。
178.类胡萝卜素组合物
179.除了其它以外，本公开提供了包含或以其它方式向患有或易患本文所述的一种或多种疾病、障碍或病症的受试者递送类胡萝卜素化合物(例如c50类胡萝卜素化合物)的组合物。
180.本领域技术人员知晓，先前已经鉴别了超过750种的类胡萝卜素化合物。类胡萝卜素通常按5
‑
碳类异戊二烯单元的数量分类，使得它们的碳骨架长度不同。参见例如bio
‑
pigmentation and biotechnological implementations,pp.107
‑
126.doi:10.1002/9781119166191.ch5中的henke等，(2017).c50 carotenoids:occurrence,biosynthesis,glycosylation,and metabolic engineering for their overproduction.；progress in carotenoid research.(2018)doi:10.5772/intechopen.79542中的fernandes,introductory chapter:carotenoids
‑
a brief overview on its structure,biosynthesis,synthesis,and applications；j.chemistry volume 2016:1中的mezzomo等，(2016)carotenoids functionality,sources,and processing by supercritical technology:a review。
181.在一些实施方式中，根据本公开有用的类胡萝卜素化合物具有相对长的异戊二烯主链，例如具有约45至约60个碳原子范围内的长度。在一些实施方式中，如本文所述的有用的类胡萝卜素化合物可以具有50个碳长度的异戊二烯主链，即可以是c50类胡萝卜素化合物，例如癸异戊二烯黄素或其它c50类胡萝卜素，例如c50
‑
虾青素(也称为癸异戊二烯虾青素；参见milon等，helv.chim.acta 69，12
‑
24(1986)；furubayashi等，nat commun.2015；6:7534)、或c50
‑
β
‑
胡萝卜素(也称为癸异戊二烯
‑
β
‑
胡萝卜素)(参见例如，karrer等，helv.chim.acta 34，28
‑
33(1951)；furubayashi等，nat commun.2015，6:7534)；16,16
′‑
二异戊烯基八氢番茄红素(umeno等，j bacteriol，186，1531
‑
1536(2004))；c50
‑
胡萝卜素(n＝3)(16,16
‑
二异戊烯基八氢番茄红素)、c50
‑
玉米黄质、c50
‑
眉藻黄素和c50
‑
念珠藻黄素(us20140170700)；八叠球菌黄素、sarprenoxanthin、无环c50类胡萝卜素菌红素、c50
‑
角黄素、c50
‑
番茄红素、c50
‑
八氢番茄红素(li等，scientific reports，第9卷，文章号：2982(2019))。还参见pfander，pure and applied chemistry，66(10
‑
11)：2369
‑
2374(1994)。
182.本领域技术人员知晓用于生产类胡萝卜素化合物的多种技术。参见例如，j.chemistry，第2016:1卷中的mezzomo等，(2016)carotenoids functionality,sources,and processing by supercritical technology:areview。在一些实施方式中，类胡萝卜素化合物可以从产生该类胡萝卜素化合物的生物体(例如植物或微生物)中分离。在一些此类实施方式中，此类植物或微生物可能已由人开发和/或栽培。在一些实施方式中，植物或微生物可以是天然植物或微生物。在一些实施方式中，植物或微生物可以是经工程化的植物或微生物，例如工程化为如本文所述的类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成植物或微生物的植物或
微生物。
183.本领域技术人员知晓各种植物和/或微生物来源，它们已经或可被工程化为如本文所述的类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成植物或微生物。参见例如，wo2016/102342。
184.在一些实施方式中，类胡萝卜素化合物可以从植物或微生物来源(例如从其栽培种或培养物)中分离。本领域技术人员知晓多种用于处理植物和/或微生物细胞或组织的技术，例如用以制备其提取物和/或从其中分离其组分和/或化合物。
185.可替代地，或另外地，在一些实施方式中，类胡萝卜素化合物可以部分或全部地在体外制备(例如通过化学和/或酶合成，或它们的组合)，并且如本领域已知的，可任选地进一步分离和/或纯化。
186.本领域已知下述多种技术，所述技术可用于制备产生相关的类胡萝卜素化合物的细胞或生物体的提取物，和/或从所述细胞或生物体中分离提取物、组分或化合物，或处置体外的类胡萝卜素合成系统(例如从体外的类胡萝卜素合成系统中分离和/或纯化一种或多种类胡萝卜素化合物)。仅举几个实例，此类技术可包括例如有机萃取、真空浓缩、色谱法等中的一种或多种。
187.本领域技术人员知晓，通过环化或氧化对番茄红素的末端进行修饰来合成各种较低级的(碳链较短)类胡萝卜素，例如α
‑
胡萝卜素、β
‑
胡萝卜素、γ
‑
胡萝卜素、δ
‑
胡萝卜素、ε
‑
胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、角黄素、岩藻黄质、虾青素、花药黄质和紫黄质。可例如使用体外方法或体内或离体方法(例如通过天然或遗传修饰的生物体)来制备更高级(碳原子更多)的类胡萝卜素。例如，c50类胡萝卜素可通过将两个二甲烯丙基焦磷酸酯(dmapp)分子添加到相应c40类胡萝卜素的c(2)和c(2')而在体外合成，或从合成c50类胡萝卜素的生物体(例如野生型或经工程化的)(例如c50
‑
类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成微生物)提取。参见例如milon等，helv.chim.acta 69，12
‑
24(1986)；karrer等，helv.chim.acta34，28
‑
33(1951)；furubayashi等，nat commun.2015，6：7534；tobias和arnold，biochim biophys acta.2006feb，1761(2)：235
‑
46；henke等(2017年6月14日).carotenoid production by corynebacterium:the workhorse of industrial amino acid production as host for production of a broad spectrum of c40 and c50 carotenoids，carotenoids，dragan j.cvetkovic和goran s.nikolic，intech open，doi:10.5772/67631.可获得自：intechopen.com/books/carotenoids/carotenoid
‑
production
‑
by
‑
corynebacteriu m
‑
the
‑
workhorse
‑
of
‑
industrial
‑
amino
‑
acid
‑
production
‑
as
‑
host
‑
f；bio
‑
pigmentation and biotechnological implementations,pp.107
‑
126.doi:10.1002/9781119166191.ch5中的henke等，(2017).c50 carotenoids:occurrence,biosynthesis,glycosylation,and metabolic engineering for their overproduction.；progress in carotenoid research.(2018)doi:10.5772/intechopen.79542中的fernandes,introductory chapter:carotenoids
‑
a brief overview on its structure,biosynthesis,synthesis,and applications.；heider等，appl microbiol biot 2014；98(10):4355e68；wang等，biotechnol adv 2007；25(3):211e22；niu等，synthetic and systems biotechnology 2(2017)167e175；li等，scientific reports，第9卷，文章号：2982(2019)；us20050260699；us20140170700；us20040091958；us20090197321等。
188.在一些实施方式中，用于根据本公开的用途的一种或多种类胡萝卜素化合物可作
为产生类胡萝卜素的生物体的纯化的或基本上纯化的分子、或纯化程度较低(例如富集)的提取物来提供。
189.在一些实施方式中，将作为或包含一种或多种类胡萝卜素化合物的制剂并入或以其它方式使用，来生产如本文所述的药物组合物，该药物组合物在给予至受试者时向其递送类胡萝卜素化合物。
190.在一些实施方式中，类胡萝卜素制剂或类胡萝卜素组合物(例如包含或递送类胡萝卜素化合物的药物组合物)包含至少20w/w％、30w/w％、40w/w％、50w/w％、60w/w％、70w/w％、80w/w％、90w/w％、95w/w％、97w/w％或99w/w％的类胡萝卜素化合物。
191.在一些实施方式中，用于根据本公开的用途的组合物是药物组合物，例如用于口服给予。药物组合物通常包含活性试剂(例如类胡萝卜素化合物，如c50类胡萝卜素化合物或其来源)和药学上可接受的载体。某些示例性的药学上可接受的载体包括例如与药物给予相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
192.在一些实施方式中，用于根据本公开的用途的药物组合物可以包括一种或多种补充活性化合物，和/或可以与一种或多种补充活性化合物联合给予；在某些实施方式中，此类补充活性试剂可包括姜、姜黄素、益生菌(例如以下属中的一种或多种的益生菌菌株：乳杆菌(lactobacillus)、双歧杆菌(bifidobacterium)、酵母(saccharomyces)、肠球菌(enterococcus)、链球菌(streptococcus)、片球菌(pediococcus)、明串珠菌(leuconostoc)、芽孢杆菌(bacillus)和/或大肠杆菌(参见fijan，int j environ res public health.2014年5月，11(5)：4745
‑
4767)；益生元(帮助支持益生菌生长的不易消化的食品成分，例如果聚糖，如低聚果糖(fos)和菊粉；半乳聚糖，如低聚半乳糖(gos)；膳食纤维，如抗性淀粉、果胶、β
‑
葡聚糖和低聚木糖(hutkins等，curr opin biotechnol.2016feb；37：1
‑
7))以及它们的组合。
193.通常将药物组合物配制成与其预期的给予途径相容。给予途径的实例包括口服给予。
194.配制合适的药物组合物的方法是本领域已知的，参见例如remington:the science and practice of pharmacy，第21版，2005；以及drugs and the pharmaceutical sciences:a series of textbooks and monographs(dekker,ny)系列中的书籍。口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。仅举几个实例，在一些实施方式中，口服制剂可以是或包含糖浆剂、液体剂、片剂、锭片剂、软糖、胶囊剂，例如明胶胶囊剂、散剂、凝胶剂、膜剂等。
195.在一些实施方式中，作为药物组合物的一部分，可包含药学上相容的粘合剂和/或辅助材料。在一些特定实施方式中，药物组合物可包含例如以下非活性成分或类似性质的化合物中的任何一种或多种：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。在一些实施方式中，组合物可以按原样服用或洒在食物或液体(例如水)上或混入到食物或液体(例如水)中。
196.在一些实施方式中，可如本文所述向受试者给予的类胡萝卜素组合物可以是或包含可摄取的物品(例如食物或饮料)，所述可摄取的物品包含(例如补充有)一种或多种的类
胡萝卜素。在一些实施方式中，有用的组合物可以包含一种或多种的类胡萝卜素化合物，其水平高于其组分中发现的类胡萝卜素化合物的水平，和/或高于相关食物或饮料中通常存在的水平，从而例如提供足以提供如本文所述的治疗效果的类胡萝卜素水平。
197.在一些实施方式中，食物可以是或包括如下的一种或多种：棒状食物、糖果、烘焙食品、谷物、咸味小吃、意大利面食、巧克力和其它固体食物，以及液体或半固体食物，包括酸奶、汤和炖煮食物，以及饮品，例如冰沙、奶昔、果汁和其它碳酸或非碳酸饮品。在一些实施方式中，提供其中已包含类胡萝卜素的食物；在一些实施方式中，由受试者通过混入类胡萝卜素中来制备食物。
198.组合物可与用于给药的说明书或用于本文所述方法的说明书一起被包含在试剂盒、容器、包装或分配器中。
199.阅读了本公开的本领域技术人员将理解，在一些实施方式中，如本文所述的类胡萝卜素组合物可以是或包含产生(例如已经产生和/或正在产生)相关化合物的一种或多种细胞、组织或生物体(例如植物或微生物细胞、组织或生物体)。在一些实施方式中，此类细胞、组织或生物体可以先前已经产生了相关的类胡萝卜素；在一些实施方式中，此类细胞、组织或生物体正在产生类胡萝卜素化合物。
200.在一些实施方式中，类胡萝卜素组合物可包含已被杀死(例如热杀死)的细胞、组织和/或生物体。可替代地，在一些实施方式中，类胡萝卜素组合物可包含活的或有活力的细胞、组织和/或生物体。
201.在一些实施方式中，本文所述的治疗方法涉及给予一种或多种活的或有活力的类胡萝卜素
‑
化合物
‑
合成细胞、组织或生物体。在一些此类实施方式中，细胞、组织或生物体是微生物细胞，并且根据下述方案进行给予，所述方案用所给予的细胞获得受试者的微生物组的群。
202.在一些实施方式中，如本文所述的类胡萝卜素组合物包含一种或多种细胞培养物和/或其上清液或沉淀、和/或由其形成的粉末，和/或如本文所述的类胡萝卜素组合物通过使用一种或多种细胞培养物和/或其上清液或沉淀、和/或由其形成的粉末进行配制。
203.本领域技术人员将理解，在一些实施方式中，用于制备类胡萝卜素组合物和/或制剂、和/或用于制备一种或多种类胡萝卜素组合物(尤其是用于制备药物组合物)的技术可包括评估或表征化合物、制剂或组合物的一个或多个步骤(例如作为质量控制的一部分)。在一些实施方式中，如果所分析的材料不满足相关评估的预定规格，则将其丢弃。在一些实施方式中，如果此类所分析的材料确实满足预定规格，则继续如本文所述对其进行处理。
204.鉴别和/或表征的方法
205.除了其它以外，本公开提供了允许评估与本文所述的有用性相关的一个或多个试剂特征的系统。在一些实施方式中，用于鉴别和/或表征如本文所述的试剂的技术可涉及与适当参考(例如与阳性对照参考和/或与阴性对照参考)的比较。在一些实施方式中，参考可以是或包括历史参考；在一些实施方式中，参考可以是或包括同期参考(contemporaneous reference)。
206.在一些实施方式中，所提供的技术可用于筛选测试试剂，例如所述测试试剂可以是或包含一种或多种多肽、肽、无机或有机大分子或小分子、或者包含或递送它们的组合物，以便鉴别在如本文所述的方法中有用的试剂。可替代地，或另外地，在一些实施方式中，
所提供的技术可用于表征一种或多种试剂，例如在此类试剂或其药学上可接受的组合物的开发和/或商业化期间。
207.如本文所使用的，“小分子”是指分子量低于约3,000道尔顿的有机或无机小分子。通常，小分子的分子量可小于3,000道尔顿(da)。小分子可以是例如至少约100da至约3,000da(例如约100da至约3,000da、约100da至约2500da、约100da至约2,000da、约100da至约1,750da、约100da至约1,500da、约100da至约1,250da、约100da至约1,000da、约100da至约750da、约100da至约500da、约200da至约1500da、约500da至约1000da、约300da至约1000da、或约100da至约250da)。
208.本领域技术人员将理解，在一些实施方式中，特别是在筛选实施方式中，所提供的技术可用于鉴别(例如筛选)和/或表征多种试剂。在一些实施方式中，此类多种是或包括合理可比的试剂(例如一种或多种特定小分子化合物及其多种类似物)；在一些实施方式中，多种试剂是或包括多种天然产物(例如类胡萝卜素化合物，如c50类胡萝卜素化合物)和/或其一种或多种类似物。在一些实施方式中，多种试剂是或包含小分子化合物的组合文库。适用于合成小分子的组合技术是本领域已知的，例如，如obrecht和villalgordo所示例的，solid
‑
supported combinatorial and parallel synthesis of small
‑
molecular
‑
weight compound libraries，pergamon
‑
elsevier science limited(1998)，并且包括下述技术，例如“混合裂分(split and pool)”或“平行”合成技术、固相和液相技术以及编码技术(参见例如，czarnik,curr.opin.chem.bio.1:60
‑
6(1997))。此外，许多小分子文库是商业上可获得的。许多合适的小分子测试化合物列于美国专利no.6,503,713中，以引用的方式将其整体并入本文。
209.在一些实施方式中，所提供的技术可用于筛选和/或评估涵盖多个函数(例如电荷、芳香性、氢键、柔性、大小、侧链长度、疏水性和刚性)的多种试剂。
210.在一些实施方式中，如本文所述筛选的文库可包含多种类型的测试化合物。在一些实施方式中，给定的文库可包括一组结构上相关或不相关的测试化合物。在一些特定的实施方式中，文库可包括一组肽或拟肽分子。在一些实施方式中，文库可包括类胡萝卜素化合物，例如天然存在的或合成的类胡萝卜素，例如c35、c40、c45、c50、c55或c60类胡萝卜素。
211.在一些实施方式中，将所提供的技术用于通过系统地改变第一试剂的结构，来评估彼此相关的试剂组；在一些此类实例中，第一试剂可以是或包含已知活性的化合物(例如类胡萝卜素化合物，如c50类胡萝卜素化合物)。
212.在一些实施方式中，本文提供的技术利用了结构特征与感兴趣的生物活性的存在或不存在(或水平)之间的相关性(即结构
‑
功能关系)，或在它们之间产生了相关性。在某些情况下，可根据经验对结构
‑
功能关系进行定义；在一些实施方式中，可通过利用计算机建模和/或分析预测方法对结构
‑
功能关系进行定义。
213.在一些实施方式中，使用如本文所述的厌食测定。在一些实施方式中，测试样品是或源自(例如样品取自)本文所述障碍的体内模型。例如，将测试化合物应用于包含一种或多种秀丽隐杆线虫生物体的测试样品，并评价测试化合物的一种或多种效果。例如，可在化疗剂或其它引发恶心的刺激物的存在下，对测试化合物对抗厌食的能力进行测试。可替代地，可通过检测gfp荧光的变化来评价对报告基因(例如abc转运体基因融合pgp
‑
5p::gfp)的影响。本领域技术人员将理解，可以容易地使用其它报告基因。
214.在一些实施方式中，可通过本文所述的方法筛选化合物以确定其是否可在系统(例如动物模型，如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如具有抗恶心活性)、呕吐(例如具有抗呕吐活性)和/或厌食。在一些实施方式中，可将被确定为在系统(例如动物模型，如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如具有抗恶心活性)、呕吐(例如具有抗呕吐活性)和/或厌食的化合物视为候选化合物。可将下述候选化合物视为候选治疗剂，所述候选化合物已经例如在具有与恶心、呕吐和/或厌食相关的特征的系统(例如与恶心和/或呕吐相关的疾病、障碍或病症的体内模型，如秀丽隐杆线虫)中进行筛选，并确定对恶心、呕吐和/或厌食具有期望的效果。在一些实施方式中，候选治疗剂可以在更大的动物模型或临床环境中进行测试。一旦在临床环境中对候选治疗剂进行筛选，该候选治疗剂就可以是治疗剂。候选化合物、候选治疗剂和治疗剂可以任选地进行优化和/或衍生化，并与生理学上可接受的赋形剂一起配制以形成药物组合物。
215.可通过本文所述的方法评估化合物以确定其是否可以在系统(例如动物模型，如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如具有抗恶心活性)、呕吐(例如具有抗呕吐活性)和/或厌食。在一些实施方式中，本公开提供了用于评估化合物(例如类胡萝卜素)以确定其在系统(例如动物模型，如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如抗恶心活性)、呕吐(例如抗呕吐活性)和/或厌食的能力的方法。在一些实施方式中，评估化合物以确定其在系统(例如动物模型，如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如抗恶心活性)、呕吐(例如抗呕吐活性)和/或厌食的能力的方法是为了监管机构(例如美国食品药品监督管理局、欧洲药品管理局等)的批准或维持批准而进行的测定(例如释放测试、稳定性测试、功效测试等)的一部分。在一些实施方式中，评估化合物(例如类胡萝卜素)以确定其在系统(例如动物模型，如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如抗恶心活性)、呕吐(例如抗呕吐活性)和/或厌食的能力的方法是制造方法的一部分。在一些实施方式中，评估可以作为筛选方法的一部分进行。在一些实施方式中，系统可以是动物系统。在一些实施方式中，动物系统是模型系统，例如秀丽隐杆线虫、猫、狗、猿或猪。
216.确定在系统(例如动物模型，如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如具有抗恶心活性)、呕吐(例如具有抗呕吐活性)和/或厌食的所评估的化合物可例如使用合理设计进行系统地改变，以优化结合亲和力、亲合力、特异性或另外的参数。还可使用本文所述的方法筛选和/或评估此种优化。在一些实施方式中，方法包括使用本领域已知和/或本文所述的一个或多个步骤筛选化合物的第一文库，例如鉴别文库中的一个或多个命中，使命中经受系统性结构改变以创建与命中结构上相关的化合物的第二文库，使用本文所述的方法筛选第二文库，或它们的组合。因此，在一个实施方式中，方法包括使用本领域已知和/或本文所述的一个或多个步骤筛选化合物的第一文库，例如鉴别文库中的一个或多个命中，使命中经受系统性结构改变以创建与命中结构上相关的化合物的第二文库，使用本文所述的方法筛选第二文库，或它们的组合。
217.确定在系统(例如动物模型，如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如具有抗恶心活性)、呕吐(例如具有抗呕吐活性)和/或厌食的所评估的化合物可被认为是用于减少如本文所述的恶心、呕吐和/或厌食的候选治疗化合物。用于确定化合物结构的多种技术可用于本文所述的方法中，所述技术例如nmr、质谱分析、配备有电子捕获检测器的气相色谱、荧光和吸收光谱。本公开提供了如下观点：确定在系统中减少恶心(例如具有抗恶心活性)、呕吐
(例如具有抗呕吐活性)和/或厌食的化合物(例如通过本文所述的方法)可用于治疗、预防或延迟本文所述的疾病、障碍和/或病症的发展或进展的方法中。本公开提供了如下观点：确定在系统中减少恶心(例如具有抗恶心活性)、呕吐(例如具有抗呕吐活性)和/或厌食的化合物(例如通过本文所述的方法)可用于治疗本文所述的恶心、呕吐和/或厌食的方法中。
218.确定在系统(例如秀丽隐杆线虫)中减少恶心(例如具有抗恶心活性)、呕吐(例如具有抗呕吐活性)和/或厌食的所评估的化合物可在第二系统(例如大型动物，如猿、猴、猫、狗、猪等)中进行评估。可就因化合物的存在而发生的变化(例如减少的恶心或厌食)来对动物进行监测。在一些实施方式中，系统是人，例如患有cinv或rinv的人，并且参数是恶心、呕吐和/或厌食的降低的严重性、频率或持续时间。
219.实施例
220.在以下实施例中对本文提供的实施方式进行示例说明，所述实施例不限制本公开或权利要求的范围。
221.材料和方法
222.在以下实施例中使用了以下材料和方法。
223.菌株
224.n2 bristol是所使用的野生型菌株。
225.使用了以下菌株和突变等位基因：
226.sj4100[zcis13[hsp
‑
6：：gfp]，
[0227]
we5172[ajisi(pgp
‑
5：：gfp)x]，
[0228]
jg16[eft
‑
3(q145)/ht2[bli
‑
4(e937)let
‑
？(q782)qis48](i；iii)；ajisl(pgp
‑
5：：gfp)x]，
[0229]
jg20[ajls1(pgp
‑
5：：gfp)；agex(pvha
‑
6：：mcherry：：zip
‑
2 myo
‑
2：：gfp)]，
[0230]
ay101[acls101[f35e12.5p：：gfp rol
‑
6(su10006)]
[0231]
sj4005[zcis4[hsp
‑
4：：gfp]v]，
[0232]
sj4100(zcls13[hsp
‑
6：：gfp])
[0233]
所使用的微生物的生长和处理
[0234]
使用特异性引物对16s核糖体序列进行扩增并测序以鉴别微生物。使用lb培养基和板来培养嗜根考克氏菌、研究团队节杆菌和谷氨酸棒杆菌以及它们的突变体。将500ml的过夜培养物接种到sk培养基板上，并在开始实验前在室温下孵育2天。对于涉及野生型嗜根考克氏菌和突变体、野生型研究团队节杆菌和谷氨酸棒杆菌以及突变体的实验，使同步的l1幼虫阶段动物在大肠杆菌op50接种板中生长直至l4幼虫阶段或成年第一天，并在m9缓冲液中洗涤至少五次，然后转移至适当的细菌食物。
[0235]
药物处理
[0236]
将在m9溶液中稀释至期望浓度的潮霉素添加到含有大肠杆菌op50细菌的ngm板上。将依米丁或顺铂的原液在m9中稀释，并将期望浓度添加到含有大肠杆菌op50细菌的ngm板上。将750μg/ml的嗜根考克氏菌提取物添加到含有大肠杆菌op50细菌的ngm板上，该板含有适当浓度的潮霉素或顺铂或依米丁。对于异型生物质实验，将同步的l1阶段动物滴到含有药物的板上，并在4天后评分。
[0237]
rnai测定
[0238]
对于rnai测定，用适当的rnai克隆喂养适当的基因型的同步的l1幼虫阶段动物，直到它们达到成年的第一天。随后，将经rnai处理的动物在m9中清洗至少五次以去除大肠杆菌并转移到嗜根考克氏菌接种板或大肠杆菌op50接种板。
[0239]
显微镜检查
[0240]
将线虫安置于琼脂垫上，并使用配备有zeiss axiocam hrm相机和axiovision 4.6(zeiss)软件的zeiss axio imager z1显微镜获取图像。使用相同的曝光时间，将在同一图形面板内显示的所有荧光图像收集在一起。将图像转换为8位图像，使用imagej进行阈值化和量化。使用学生t检验确定统计学显著性。使用配备有hammamatsu orca flash 4.0数码相机的zeiss axiozoom v16，并使用axiovision zen软件，获取低倍率明场和gfp荧光图像。
[0241]
蛋白质序列的多重比对
[0242]
使用clustal omega软件进行多重比对。
[0243]
嗜根考克氏菌ems诱变筛选
[0244]
通过用50mm ems在37℃下将pbs溶液中的嗜根考克氏菌过夜培养物处理45分钟，来进行诱变。将诱变的嗜根考克氏菌培养物的连续稀释液铺到lb培养基板上，挑取约2000个诱变的细菌菌落并使其在lb溶液中生长。在开始实验之前，将500ml的过夜培养物接种到sk培养基板上并在室温下孵育两天。使同步的l1幼虫阶段的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物在大肠杆菌op50接种板中生长直至l4幼虫阶段或成年第一天，并在m9缓冲液中洗涤至少五次，然后转移至嗜根考克氏菌突变体细菌食物。针对gfp诱导，24小时后对板进行目视筛选。
[0245]
通过全基因组测序鉴别ems诱导的突变
[0246]
基因组dna提取、文库制备、illumina miniseq测序和生物信息均由位于fort collins,colorado的测序中心(sequencing center)实施。
[0247]
嗜根考克氏菌的类胡萝卜素的分离
[0248]
如(giuffrida等，2016)所述并进行以下修改，从嗜根考克氏菌中分离类胡萝卜素。在以4000rpm离心15min后，将生长于lb溶液中的嗜根考克氏菌培养物用等体积的水洗涤。离心除去水后，添加等体积的丙酮并再次以4000rpm离心15min。除去丙酮后，将样品用铝箔包裹避光后，在65℃水浴中用甲醇对细菌沉淀进行提取。用甲醇多次提取样品，直到所有细胞均脱色(bleached)。上清液用whatman滤纸no1过滤。向甲醇提取物中添加两倍体积的15％氯化钠，并在混合后添加等体积的己烷。黄色类胡萝卜素从甲醇
‑
盐混合物中分离出来并积聚在己烷部分中。移出己烷部分并用水洗涤至少3次。蒸发己烷部分并将所得类胡萝卜素沉淀溶解在甲醇中。
[0249]
高效液相色谱
[0250]
使用配备有二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱、溶剂脱气器和二元泵的agilent 1200hplc，在agilent eclipse plus c18 4.6x 250mm柱(其中颗粒大小为5微米)上分离粗的甲醇提取物。流动相为(a)水与(b)甲醇，流速为2ml/min。在样品注射前，在40℃下用90％b对柱子进行预平衡。注射后，将柱子在90％b下等度洗涤5min，然后在5min内升至100％b。从300nm
‑
700nm对洗脱液吸收光谱进行监测。
[0251]
用大鼠肝脏进行牵出(pull down)实验
[0252]
为了鉴别类胡萝卜素结合蛋白，使用了pilbrow等(2014)的方案，并进行了以下修改。通过将约10克的成年大鼠肝脏切成小块，并使用含有罗氏蛋白酶抑制剂(roche protease inhibitor)的tissue
‑
in t
‑
per组织蛋白提取试剂进行均质化，获得蛋白提取物。使用甲醇
‑
氯仿对提取物进行脱脂。在22℃下，将约10mg的嗜根考克氏菌的类胡萝卜素与1克蛋白提取物孵育一小时。通过使用bio
‑
spin p
‑
6(6k mwco)的尺寸排阻色谱法，去除未结合的类胡萝卜素。将类胡萝卜素结合蛋白提取物提供至deae阴离子交换琼脂糖树脂柱，所述柱在4℃下用阴离子交换缓冲液a(0.05m磷酸氢钠，ph 8.0)进行预平衡。使样品能够在重力作用下流过该柱，并用阴离子交换缓冲液a洗涤该柱。用0.5ml体积的0.5mnacl洗脱蛋白质。收集黄色部分，透析以除去盐，并使用vivaspin离心浓缩柱浓缩。在4％
‑
12％天然page上分离黄色部分，并切下可见的橙黄色带，并进行质谱分析以用于鉴别蛋白质。
[0253]
来自微生物的推定的“癸异戊二烯黄素”类胡萝卜素生物合成簇如下细菌的推定的类胡萝卜素生物合成簇非常相似，并具有相似的大小与嗜根考克氏菌的基因组显示出相同的组织：
[0254]
leifsonia xyli(lxx15630、lxx15620、lxx15610、lxx15600、lxx15590和lxx15580)(monteiro
‑
vitorello等，2004)、砖红色微杆菌(microbacterium testaceum)(mtes_3133、mtes_3132、mtes_3131、mtes_3130、mtes_3129和mtes_3128)(morohoshi等，2011)、cellvibrio gilvus(celgi_1516、celgi_1515、celgi_1514、celgi_1513、celgi_1512和celgi_1511)(christopherson等，2013)、粪纤维单胞菌(cellulomonas fimi)(celf_3171、celf_3170、celf_3169、celf_3168、celf_3167和celf_3166)(christopherson等，2013)、sanguibacter keddieii(sked_12750、sked_12760、sked_12770、sked_12780、sked_12790和sked_12800)(ivanova等，2009)、反硝化琼斯氏菌(jonesia denitrificans)(jden_0342、jden_0341、jden_0340、jden_0339、jden_0338和jden_0337)(pukall等，2009)、氧化锰居真菌细菌(mycetocola manganoxydans)(d9v29_rs08865、d9v29_rs08870、d9v29_rs08875、d9v29_rs08880、d9v29_rs08885和d9v29_rs08890)、米堆冰川居真菌细菌(mycetocola miduiensis)(bm197_rs02470、bm197_rs02475、bm197_rs02480、bm197_rs02485、bm197_rs02490和bm197_rs02495)、耐冷冷杆菌(cryobacterium psychrotolerans)(blq39_rs02180、blq39_rs02185、blq39_rs02190、blq39_rs02195、blq39_rs02200和blq39_rs02205)、北方栖低境菌(subtercola boreus)(b7r21_rs02695、b7r21_rs02700、b7r21_rs02705、b7r21_rs02710、b7r21_rs02715和b7r21_rs02720)、亲和素链霉菌(herbiconiux solani)(hso01s_rs07000、hso01s_rs07005、hso01s_rs07010、hso01s_rs07015、hso01s_rs07020和hso01s_rs07025)、叶球形微杆菌(microbacterium phyllosphaerae)(d3h67_rs09120、d3h67_rs09125、d3h67_rs09130、d3h67_rs09135、d3h67_rs09140和d3h67_rs09145)、水生雷弗森菌(leifsonia aquatica)(n136_rs22055、n136_rs22060、n136_rs22065、n136_rs22070、n136_rs22075和n136_rs22080)、酯香微杆菌(microbacterium esteraromaticum)(b4u78_rs09520、b4u78_rs09525、b4u78_rs09530、b4u78_rs09535、b4u78_rs09540和b4u78_rs09545)；
[0255]
植物杆菌属h53(plantibacter sp.h53)(a4x17_rs18565、a4x17_rs18570、a4x17_rs18575、a4x17_rs18580、a4x17_rs18585和a4x17_rs18590)、短小杆菌属(curtobacterium sp.)(asf23_rs14315、asf23_rs14320、asf23_rs14325、asf23_rs14330、asf23_rs14335和
asf23_rs14340)、microterricola pindariensis(gy24_rs04745、gy24_rs04750、gy24_rs04755、gy24_rs04760、gy24_rs04765和gy24_rs04770)、叶居菌属(frondihabitans sp.)(edf46_rs08000、edf46_rs08005、edf46_rs08010、edf46_rs08015、edf46_rs08020和edf46_rs08025)、新疆盐地杆菌(salinibacterium xinjiangense)(samn06296378_0676、samn06296378_0677、samn06296378_0678、samn06296378_0679、samn06296378_0680和samn06296378_0681)、农霉菌属(agromyces sp.)(avp42_rs01110、avp42_rs01115、avp42_rs01120、avp42_rs01125、avp42_rs01130和avp42_rs01135)、巴氏微杆菌(microbacterium barkeri)(mbr4_rs00310、mbr4_rs00315、mbr4_rs00320、mbr4_rs00325、mbr4_rs00330和mbr4_rs00335)、韩国节杆菌(arthrobacter koreensis)(bn2404_rs04370、bn2404_rs04375、bn2404_rs04380、bn2404_rs04385、bn2404_rs04390和bn2404_rs04395)、路普康湖冷杆菌(cryobacterium roopkundense)(gy21_rs00565、gy21_rs00570、gy21_rs00575、gy21_rs00580、gy21_rs00585和gy21_rs00590)、氧化微杆菌(microbacterium oxydans)(rn51_rs07325、rn51_rs07330、rn51_rs07335、rn51_rs07340、rn51_rs07345和rn51_rs07350)、藤黄节杆菌(arthrobacter luteolus)(al3_rs02570、al3_rs02575、al3_rs02580、al3_rs02585、al3_rs02590和al3_rs02595)、cryobacterium aureum(cj028_rs03575、cj028_rs03580、cj028_rs03585、cj028_rs03590、cj028_rs03595和cj028_rs03600)、curtobacterium ammoniigenes(cam01s_rs13455、cam01s_rs13460、cam01s_rs13465、cam01s_rs13470、cam01s_rs13475和cam01s_rs13480)、oerskovia enterophila(ojag_rs08920、ojag_rs08925、ojag_rs08930、ojag_rs08935、ojag_rs08940和ojag_rs08945)；
[0256]
副氧化微杆菌(microbacterium paraoxydans)(samn04489809_1122、samn04489809_1123、samn04489809_1124、samn04489809_1125、samn04489809_1126和samn04489809_1127)、agromyces subbeticus(h521_rs21795、h521_rs21800、h521_rs0106365、h521_rs0106370、h521_rs21805和h521_rs0106380)、成晶节杆菌(arthrobacter crystallopoietes)(d477_rs18370、d477_rs18375、d477_rs18380、d477_rs18385和d477_rs18390、d477_rs18395)、georgenia satyanarayanai(dsz44_rs04745、dsz44_rs04750、dsz44_rs04755、dsz44_rs04760、dsz44_rs04765和dsz44_rs04770)、解单端孢菌素微杆菌(microbacterium trichothecenolyticum)(rs82_rs03115、rs82_rs03120、rs82_rs03125、rs82_rs03130、rs82_rs03135和rs82_rs03140)、arthrobacter woluwensis(c6401_rs03950、c6401_rs03955、c6401_rs03960、c6401_rs03965、c6401_rs03970和c6401_rs03975)、promicromonospora kroppenstedtii(prokr_rs13815、prokr_rs13820、prokr_rs13825、prokr_rs13830、prokr_rs13835和prokr_rs13840)、纤维单胞菌(cellulomonas cellasea)(q760_rs04595、q760_rs04600、q760_rs04605、q760_rs18340、q760_rs04615和q760_rs04620)、agromyces cerinus(bur99_rs12060、bur99_rs12065、bur99_rs12070、bur99_rs12075、bur99_rs12080和bur99_rs12085)、草地阿格雷氏菌(agreia pratensis)(b9y86_rs06900、b9y86_rs06905、b9y86_rs06910、b9y86_rs06915、b9y86_rs06920和b9y86_rs06925)、产左聚糖微杆菌(microbacterium laevaniformans)(or221_3062、or221_3063、or221_3064、or221_3065、or221_3066和or221_3067)、斯氏节杆菌(arthrobacter stackebrandtii)(cvv67_17780、cvv67_17785、cvv67_17790、cvv67_
17795、cvv67_17800和cvv67_17805)、paeniglutamicibacter gangotriensis(adiag_rs03760、adiag_rs03765、adiag_rs03770、adiag_rs03775、adiag_rs03780和adiag_rs03785)、解单端孢菌素微杆菌(microbacterium trichothecenolyticum)(rs82_rs03115、rs82_rs03120、rs82_rs03125、rs82_rs03130、rs82_rs03135和rs82_rs03140)、利文斯顿岛节杆菌(arthrobacter livingstonensis)(cvv68_rs19330、cvv68_rs19335、cvv68_rs19340、cvv68_rs19345、cvv68_rs19350和cvv68_rs19355)、橙色脱醌菌(demequina lutea)(aop76_rs09030、aop76_rs09035、aop76_rs09040、aop76_rs09045、aop76_rs09050和aop76_rs09055)、耐盐刘志恒氏菌(zhihengliuella halotolerans)(cur88_rs12685、cur88_rs12690、cur88_rs12695、cur88_rs12700、cur88_rs12705和cur88_rs12710)、paeniglutamicibacter antarcticus(bn2261_rs08280、bn2261_rs08285、bn2261_rs08290、bn2261_rs08295、bn2261_rs08300和bn2261_rs08305)、柠檬两面神菌(janibacter melonis)(eew87_rs00715、eew87_rs00720、eew87_rs00725、eew87_rs00730、eew87_rs00735和eew87_rs00740)、树状微杆菌(microbacterium arborescens)(dou46_rs02280、dou46_rs02285、dou46_rs02290、dou46_rs02295、dou46_rs02300和dou46_rs02305)、agreia pratensis(b9y86_rs06900、b9y86_rs06905、b9y86_rs06910、b9y86_rs06915、b9y86_rs06920和b9y86_rs06925)、agreia bicolorata(tz00_rs04480、tz00_rs04485、tz00_rs19215、tz00_rs04495、tz00_rs04500和tz00_rs04505)、冷嗜几丁质节杆菌(arthrobacter psychrochitiniphilus)(cvs30_rs02785、cvs30_rs02790、cvs30_rs02795、cvs30_rs02800、cvs30_rs02805和cvs30_rs02810)、microterricola pindariensis(gy24_rs04745、gy24_rs04750、gy24_rs04755、gy24_rs04760、gy24_rs04765和gy24_rs04770)、印度微杆菌(microbacterium indicum)(h576_rs15860、h576_rs0112930、h576_rs0112935、h576_rs0112940、h576_rs0112945和h576_rs15865)、homoserinimonas sp.(dl891_rs01870、dl891_rs01875、dl891_rs01880、dl891_rs01885、dl891_rs01890和dl891_rs01895)、淡珊瑚色冷杆菌(cryobacterium levicorallinum)(samn05216274_11068、samn05216274_11069、samn05216274_11070、samn05216274_11071、samn05216274_11072和samn05216274_11073)、frigoribacterium sp.(edf18_rs14355、edf18_rs14360、crti、edf18_rs14370、edf18_rs14375和edf18_rs14380)、柠檬黄冷杆菌(cryobacterium luteum)(samn05216281_10883、samn05216281_10884、samn05216281_10885、samn05216281_10886、samn05216281_10887和samn05216281_10888)、煤纤维单胞菌(cellulomonas carbonis)(n868_rs13600、n868_rs13605、n868_rs13610、n868_rs13615、n868_rs13620和n868_rs13625)、okibacterium fritillariae(b5x75_rs14075、b5x75_rs14080、b5x75_rs14085、b5x75_rs14090、b5x75_rs14095和b5x75_rs14100)、接骨木糖霉菌(glycomyces sambucus)(bls99_rs13650、bls99_rs13655、bls99_rs13660、bls99_rs13665、bls99_rs13670和bls99_rs13675)、krasilnikoviella flava(b5y66_rs20515、b5y66_rs20520、b5y66_rs20525、b5y66_rs20530、b5y66_rs20535和b5y66_rs20540)、铁矿放线纤丝菌(actinotalea ferrariae)(n866_01505、n866_01510、n866_01515、n866_01520、n866_01525和ubia)、lysinimicrobium soli(aom04_rs11780、aom04_rs11785、aom04_rs11790、aom04_rs11795、aom04_rs11800和aom04_rs11805)、luteimicrobium subarcticum(clv34_rs08275、clv34_rs08280、clv34_rs08285、clv34_rs08290、clv34_
rs08295和clv34_rs08300)、promicromonospora kroppenstedtii(prokr_rs13815、prokr_rs13820、prokr_rs13825、prokr_rs13830、prokr_rs13835和prokr_rs13840)、tersicoccus phoenicis(bkd30_rs05860、bkd30_rs05865、bkd30_rs05870、bkd30_rs05875、bkd30_rs05880和bkd30_rs05885)、土壤中华单胞菌(sinomonas humi)(lk10_rs09295、lk10_rs09300、lk10_rs09305、lk10_rs09310和lk10_rs09315)、pseudarthrobacter phenanthrenivorans(rm50_rs01675、rm50_rs01680、rm50_rs01685、rm50_rs01690、rm50_rs01695和rm50_rs01700)、acaricomes phytoseiuli(c501_rs0107225、c501_rs0107230、c501_rs0107235、c501_rs0107240、c501_rs0107245和c501_rs0107250)、leucobacter musarum(ams67_rs10795、ams67_rs10800、ams67_rs10805、ams67_rs10810、ams67_rs10815和ams67_rs10820)、北京鸟氨酸微菌(ornithinimicrobium pekingense)(k330_rs19765、k330_rs0107130、k330_rs19770、k330_rs19775、k330_rs0107145和k330_rs0107150)、柠檬球菌属(citricoccus sp.)(citri_rs16000、citri_rs0102550、citri_rs0102555、citri_rs16005、citri_rs0102565和citri_rs0102570)和研究团队节杆菌(arthrobacter arilatensis)(aari_13710、aari_13720、aari_13730、aari_13740、aari_13760和aari_13750)(monnet等，2010)。除了谷氨酸棒杆菌中的crte和crtb之间插入的无关基因cg0722或c.efficiens中的hmpref0290_1088之外，谷氨酸棒杆菌(cg0723、cg0721、cg0720、cg0719、cg0718和cg0717)(kalinowski等，2003)和corynebacterium efficiens(hmpref0290_1086、hmpref0290_1088、hmpref0290_1089、hmpref0290_1090、hmpref0290_1091和hmpref0290_1092)(nishio等，2003)中的产生癸异戊二烯黄素的基因簇在大小和组织上与嗜根考克氏菌相似。另外，在谷氨酸棒杆菌中，基因组中还存在额外的类胡萝卜素簇(ncgl0600、ncgl0598、ncgl0597、ncgl0596、ncgl0595和ncgl0594)。在坐皮肤球菌(kytococcus sedentarius)中，负责产生类胡萝卜素的基因(ksed_13840、ksed_13830、ksed_13820、ksed_13810、ksed_13800)排列在同一簇中，而编码牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的ksed_16070位于基因组的其它位置(sims等，2009)。
[0257]
在迈克布瑞德短杆菌(brevibacterium mcbrellneri)中，负责产生类胡萝卜素的基因(hmpref0183_0793、hmpref0183_0794、hmpref0183_0795、hmpref0183_0796和hmpref0183_0797)位于同一个簇中，而编码聚异戊烯基合成酶的hmpref0183_0437位于基因组的其它位置。
[0258]
在beutenbergia cavernae中，负责产生类胡萝卜素的基因(bcav_3492、bcav_3491、bcav_3490、bcav_3489、bcav_3488)位于同一簇中，而编码聚异戊烯基合成酶的bcav_0970位于基因组的其它位置(land等，2009)。
[0259]
在brachybacterium faecium(bfae_04470、bfae_04440、bfae_04430、bfae_04420、bfae_04410和bfae_04400)(lapidus等，2009)中，除了bfae_04470和bfae_04440之间的两个不相关的基因bfae_04460和bfae_04450的插入之外，类胡萝卜素生物合成簇在大小和组织上与嗜根考克氏菌相似。
[0260]
在产黄纤维单胞菌(cellulomonas flavigena)(cfla_2888、cfla_2889、cfla_2890、cfla_2891和cfla_2892)(abt等，2010)中，除了cfla_2893(由于移码突变，该基因可能是假基因)之外，所有负责产生类胡萝卜素的基因都存在。
[0261]
癸异戊二烯黄素是从flavobacterium dehydrogenans(现称为米兰农霉菌
(agromyces mediolanus)(liaaen
‑
jensen等，1968))中发现的第一种c50类胡萝卜素。
[0262]
已知产生癸异戊二烯黄素的多种细菌，包括：米兰农霉菌(agromyces mediolanus)(liaaen
‑
jensen等，1968)、金杆菌属(aureobacterium sp.)(fukuoka等，2004)、arthrobacter glacialis(arpin等，1975)、研究团队节杆菌(arthrobacter arilatensis)(sutthiwong等，2014)、双氮纤维单胞菌(cellulomonas biazotea)(weeks等，1980)、citriococcus sp和谷氨酸棒杆菌(krubasik等，2001)。
[0263]
实施例1.细菌的类胡萝卜素阻抑了秀丽隐杆线虫对翻译缺陷的监控
[0264]
在约500个秀丽隐杆线虫异型生物质解毒基因(例如秀丽隐杆线虫abc转运体基因pgp
‑
5)中，可以通过毒素、rnai、或通过核糖体蛋白、trna合成酶和参与翻译的其它基因的突变抑制，来诱导细胞色素p450、abc转运体、udp
‑
糖基转移酶基因的特定套组的表达(govindan等，2015)。即使翻译缺陷仅限于种系，但例如在秀丽隐杆线虫eft
‑
3(q145)突变体(翻译延伸因子
‑
1的种系同种型中的突变，其中体细胞和体细胞发育中的翻译是正常的，但生殖细胞中的翻译失能并且生殖细胞不增殖)中，当向动物喂食良性大肠杆菌op50时，肠道中的abc转运体基因融合pgp
‑
5p::gfp的表达受到强烈诱导(图5a)。向秀丽隐杆线虫eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp喂食嗜根考克氏菌(而非大肠杆菌)破坏了pgp
‑
5p::gfp的正常诱导(图5a&图5b)。嗜根考克氏菌是放线菌门(其为药物生物合成途径富含的进化枝)的革兰氏阳性球菌。在各种小生境中发现了嗜根考克氏菌种，所述小生境包括土壤和来自果园的线虫自然种群中的秀丽隐杆线虫肠道微生物组(felix等，2010)。嗜根考克氏菌种是人类和动物的皮肤和黏膜的正常栖息者，但可能与人类感染有关。
[0265]
为了确立嗜根考克氏菌可以阻抑对一系列翻译缺陷的监控，测试了针对其它核糖体蛋白的rnai诱导的异型生物质解毒应答。用表达rpl
‑
1dsrna或vrs
‑
2dsrna的大肠杆菌对同步的l1幼虫阶段的pgp
‑
5p::gfp动物进行喂养，这抑制了秀丽隐杆线虫rpl
‑
1核糖体蛋白和vrs
‑
2trna合成酶的产生。当这些动物达到成年后，将它们转移到含有大肠杆菌op50的板或接种有嗜根考克氏菌的板中，并在24小时后对gfp诱导进行评分。在喂食vrs
‑
2dsrna或rpl
‑
1dsrna并转移到含有大肠杆菌op50的板的动物中，pgp
‑
5p::gfp得到诱导。相比之下，在喂食rpl
‑
1dsrna或vrs
‑
2dsrna并转移到嗜根考克氏菌板的动物中，pgp
‑
5p::gfp表达被破坏(图5c&图5d)。由于嗜根考克氏菌不会阻抑线粒体应激应答或内质网应激应答的诱导，通过嗜根考克氏菌对监控途径的阻抑对翻译应激而言是特异性的(govindan等，2015)。
[0266]
在携带翻译遗传缺陷的秀丽隐杆线虫菌株(eft
‑
3(q145))中，为了鉴别负责抑制pgp
‑
5p::gfp诱导的嗜根考克氏菌途径，对在抑制pgp
‑
5p::gfp诱导方面有缺陷的嗜根考克氏菌突变菌株进行了正向遗传筛选。将ems诱变后在细菌lb板上正常生长的约2000个单独的嗜根考克氏菌菌株喂食给eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物。对这些2000个单独孔的不同的嗜根考克氏菌突变菌株进行筛选，以筛选出在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中未能阻抑pgp
‑
5p::gfp诱导的突变细菌菌株。鉴别出六个嗜根考克氏菌突变菌株未能在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中诱导pgp
‑
5p::gfp(图5a&图5e)。目视检查显示出，与野生型嗜根考克氏菌相比，所有这些突变菌株在菌落色素沉着方面都有缺陷(图5f)。野生型嗜根考克氏菌是黄色的，而六个突变菌落是红色或白色或橙色的。使用这种变色表型，我们目视筛选了约500,000个由ems诱变产生的细菌菌落，以筛选具有变色表型的突变体。我们分离了71个变色的突变体(图5g)。针对eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物测试了在相同ems诱变中产
生的71个突变体连同25个对照非变色突变体，并对gfp诱导进行了评分。所有71个变色突变体均未能阻抑秀丽隐杆线虫eft
‑
3(q145)突变体中的pgp
‑
5p::gfp诱导，而25个正常颜色的菌株阻抑了pgp
‑
5p::gfp诱导(图6a；图1a
‑
图1c)。
[0267]
对未能在eft
‑
3(q145)突变体中阻抑pgp
‑
5p::gfp诱导的23个ems诱变的嗜根考克氏菌突变体进行的基因组测序显示，每个突变体都在六个类胡萝卜素生物合成簇基因之一中携带突变(图6b；图1c
‑
图1e)。类胡萝卜素是黄色到红色的色素，由萜类生物合成途径产生。嗜根考克氏菌的基因组包含对所预测的类胡萝卜素(crt)生物合成基因进行编码的操纵子(takarada等，2008)。这些包括crte(krh_20850；编码ggpp合酶)、crtb(krh_20840；编码八氢番茄红素合酶)、crti(krh_20830；编码八氢番茄红素去饱和酶)、crteb(krh_20800；编码番茄红素延长酶)、crtye(krh_20820；编码c
50
类胡萝卜素ε环化酶)和crtyf(krh_20810；编码c
50
类胡萝卜素ε环化酶)(图1c
‑
图1e)。基于同源性，预测由ggpp合酶crte、八氢番茄红素合酶crtb和八氢番茄红素去饱和酶crti催化的反应介导了番茄红素生产中的步骤(klassen等，2010年；krubasik等，2001年)。crteb和crtye/f环化酶催化c
50
类胡萝卜素从番茄红素的生物合成。c
50
类胡萝卜素在自然界中很少见，并且它们中的极少数得到表征(krubasik等，2001a；krubasik等，2001b；norgard等，1970；tao等，2007；netzer等，2010)。
[0268]
尽管存在多种含有crteb和crtye/f基因的微生物(图7)，但迄今为止唯一在遗传和生化上得到充分表征的c
50
类胡萝卜素是来自谷氨酸棒杆菌的癸异戊二烯黄素(heider等，2012)。在谷氨酸棒杆菌中，crteb、crtye和crtyf酶将番茄红素转化为c
50
类胡萝卜素癸异戊二烯黄素(krubasik等，2001a；krubasik等，2001b)(图1e)。该反应以两个步骤进行：crteb催化c
40
无环番茄红素延伸为无环c
50
类胡萝卜素毛莨黄素(krubasik等，2001a；krubasik等，2001b)。crtye和crtyf的产物结合形成c
50
环化酶，然后催化c
50
类胡萝卜素毛莨黄素转化为癸异戊二烯黄素(krubasik等，2001a；krubasik等，2001b)。嗜根考克氏菌crtye和crtyf与谷氨酸棒杆菌crtye和crtyf分别有38％和34％的同一性。因此，由嗜根考克氏菌产生的黄色素可能属于癸异戊二烯黄素c
50
‑
亚族。
[0269]
从嗜根考克氏菌的遗传筛选中，在编码八氢番茄红素去饱和酶的crti中获得了多个突变，包括六个错义突变(e21、e11、e23、e14、e5和e13)和两个无义突变(e15和e10)(图1c
‑
图1e)。crti催化无色的八氢番茄红素转化为红色的番茄红素。所有这些crti突变体都是白色菌落(图6b；图1c)，与谷氨酸棒杆菌δcrti突变体类似(heider等，2012)(图6c)，并因此可能缺乏番茄红素合成。六个错义突变位于高度保守的残基中，表明它们可能对蛋白质功能很重要(图8)。e4、e6和e8是crtb基因中的错义突变，该基因编码八氢番茄红素合酶(图1d&图1e)。所有这些错义突变都位于高度保守的残基中，表明它们可能对蛋白质功能很重要(图9)。如在谷氨酸棒杆菌δcrtb突变体中所观察到的(图6c)，这些突变体产生了白色细菌菌落(图6b；图1c)(heider等，2012)。在crteb中获得了四个突变；在高度保守的残基中获得了两个无义突变(e16和e17)和两个错义突变(e3和e19)(图1d；图10)。crteb中的突变可能在番茄红素向毛莨黄素的转化中存在缺陷(图1e)。这些突变体形成淡红色菌落(图6；图1b)，如在谷氨酸棒杆菌δcrteb突变体中所观察到的，这可能是因为番茄红素(而非毛莨黄素)的积累(heider等，2012)(图6c)。e17是crteb中的早期终止突变，预计其会产生仅13个氨基酸的截短的蛋白质(图10)。crtye和crtyf中的突变在最后一步中是有缺陷的；这些基因的同源物催化癸异戊二烯黄素的合成。这些突变体产生淡红色至橙色菌落(图6b)。有
趣的是，谷氨酸棒杆菌δcrty突变体积累了毛莨黄素，并且还呈现出淡橙色至红色(heider等，2012)(图6c)。
[0270]
由于已知谷氨酸棒杆菌atcc13032会产生癸异戊二烯黄素，因此在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中测试了喂食谷氨酸棒杆菌atcc13032是否会阻抑pgp
‑
5p::gfp诱导。向eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物喂食野生型谷氨酸棒杆菌atcc13032阻抑了pgp
‑
5p::gfp诱导(图2a&图2b)。在谷氨酸棒杆菌atcc13032中，类胡萝卜素基因簇crte
‑
cg0722
‑
crtbiyeyfeb介导了癸异戊二烯黄素生物合成(heider等，2012)。测试了crty、crteb、crti和crtb中的谷氨酸棒杆菌atcc13032缺失突变体是否可以阻抑eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的pgp
‑
5p::gfp诱导，已知这些突变体在癸异戊二烯黄素的产生方面不足(heider等，2012)。与在野生型谷氨酸棒杆菌上生长的相同菌株不同，用δcrty、δcrteb、δcrti、δcrtb谷氨酸棒杆菌喂养的动物表现出正常的pgp
‑
5p::gfp诱导(图2a&图2b)。
[0271]
已知有色细菌研究团队节杆菌会产生癸异戊二烯黄素(monnet等，2010)；实验测试了喂食研究团队节杆菌是否会阻抑eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的pgp
‑
5p::gfp诱导。向eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物喂食研究团队节杆菌也阻抑了pgp
‑
5p::gfp表达(图2c)。因此，谷氨酸棒杆菌、研究团队节杆菌或嗜根考克氏菌产生了有色类胡萝卜素，该类胡萝卜素介导了针对abc转运体解毒应答的诱导的翻译监控的阻抑。
[0272]
类胡萝卜素(如癸异戊二烯黄素)是定位至细胞膜的亲脂性分子，并且可以很容易地在非极性溶剂中提取。嗜根考克氏菌培养物用此类溶剂提取(图11)。提取物的tlc分析显示存在黄橙色色素(图2d)。来自嗜根考克氏菌的甲醇提取物的hplc分析复合了至少六种不同的组分(图11；图2e)。这些峰根据洗脱时间的时间被命名为峰1(5.4min)、峰2(6.3min)、峰3(6.5min)、峰4(7.2min)、峰5(7.8min)和峰6(8.7min)(图2e)。洗脱峰的吸收光谱在420nm、440nm和470nm处显示出最大吸收，这与来自节杆菌(arthrobacter)的癸异戊二烯黄素的已公布吸收光谱相似(giuffrida等，2016；sutthiwong等，2014)。
[0273]
为了分析不同嗜根考克氏菌突变体中的类胡萝卜素的产生，从作为无义突变等位基因的crti(e10)、crteb(e17)、crtye(e22)和crtyf(e18)以及作为错义突变体的crtb(e6)中提取类胡萝卜素。来自野生型嗜根考克氏菌的甲醇提取物的分光光度分析显示出415nm
‑
425nm的最大吸收，而crteb(e17)提取物在445nm
‑
455nm处显示最大吸收(图12)。嗜根考克氏菌crteb(e17)和crtye(e22)突变体甲醇提取物显示出相似的吸收光谱，而来自嗜根考克氏菌crti(e10)和crtb(e6)的提取物显示出完全没有吸收。来自crtyf(e18)的甲醇提取物显示出两个单独的吸收峰，一个峰在约400nm处，而另一较小的峰在约500nm处。
[0274]
还测试了来自野生型嗜根考克氏菌的粗甲醇提取物(含有类胡萝卜素)在eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中阻抑gfp诱导的能力。与用具有对照甲醇提取物的大肠杆菌喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物相比，用添加有野生型嗜根考克氏菌提取物的大肠杆菌喂养的动物表现出显著降低的pgp
‑
5p::gfp表达(图2f)。作为提取物的野生型嗜根考克氏菌甲醇提取物可以拯救嗜根考克氏菌的类胡萝卜素生物合成突变体的秀丽隐杆线虫监控缺陷的阻抑：当用补充有野生型嗜根考克氏菌提取物的嗜根考克氏菌crteb(e17)、crtb(e6)或crti(e10)突变体喂养eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物时，gfp未被诱导，而在用对照提取物喂养的动物中，gfp表达受到秀丽隐杆线虫eft
‑
3突变的诱导(图2g)。
[0275]
对于嗜根考克氏菌的类胡萝卜素突变体在翻译缺陷的秀丽隐杆线虫突变体中阻
抑pgp
‑
5p::gfp的失败，一个简单解释是即使在野生型秀丽隐杆线虫背景中，这些嗜根考克氏菌的色素沉着突变体可能也会诱导pgp
‑
5p::gfp。为了测试这种可能性，用嗜根考克氏菌crteb(e17)、crtye(e22)、crtyf(e18)、crtb(e6)或crti(e10)突变体，对携带pgp
‑
5p::gfp融合基因的野生型秀丽隐杆线虫进行喂养。结果显示出，野生型嗜根考克氏菌和类胡萝卜素突变体不会诱导pgp
‑
5p::gfp(图3a)。另一种可能的解释是，嗜根考克氏菌喂养可能会引起秀丽隐杆线虫的其它应激应答，从而以某种方式“分散”动物对翻译的监控。在野生型和各种嗜根考克氏菌突变体中测试了应激的其它gfp融合报告基因的诱导作用。hsp
‑
4p::gfp和hsp
‑
6p::gfp分别是内质网未折叠蛋白应答(upr
er
)和线粒体未折叠蛋白应答(upr
mito
)的报告基因(yoneda等，2004；calfon等，2002)。clec
‑
60是由革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌(s.aureus)和m.nematophilum诱导的c型凝集素/cub结构域蛋白(o’rourke等，2006)。f35e12.5p::gfp是由鼠疫耶氏菌(y.pestis)、m.nematophilum和铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)诱导的cub结构域蛋白(o’rourke等，2006；troemel等，2006；bolz等，2010)。用野生型嗜根考克氏菌和类胡萝卜素突变体喂养秀丽隐杆线虫hsp
‑
4p::gfp、hsp
‑
6p::gfp、f35e12.5p::gfp和clec
‑
60p::gfp。嗜根考克氏菌不诱导hsp
‑
4p::gfp表达(图13a)。类似地，野生型嗜根考克氏菌或类胡萝卜素突变体不诱导hsp
‑
6p::gfp表达(图13b)。野生型嗜根考克氏菌或类胡萝卜素突变体不诱导f35e12.5p::gfp(图13d)。但是野生型嗜根考克氏菌或类胡萝卜素突变体诱导了clec
‑
60::gfp(图13c)，这是由革兰氏阳性细菌诱导的。由于嗜根考克氏菌也是革兰氏阳性细菌，clec
‑
60的诱导很可能是对病原体的免疫应答。
[0276]
为了探明嗜根考克氏菌喂养对pgp
‑
5p::gfp诱导阻抑的影响是否可逆，在不同时间后将用嗜根考克氏菌喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物转移到大肠杆菌op50板。gfp表达在转移的12小时内恢复(图13e)。
[0277]
由于c50类胡萝卜素具有多个共轭双键，因此它们可能具有抗氧化活性(edge等，1997)。然而，由于多种原因，类胡萝卜素的ros淬灭性质不太可能是阻抑pgp
‑
5p::gfp诱导的原因。首先，pgp
‑
5p::gfp不是由氧化应激诱导的(govindan等，2015)。其次，在秀丽隐杆线虫翻译缺陷突变体中测试了已知的抗氧化剂是否可以阻抑pgp
‑
5p::gfp诱导。用n
‑
乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、trolox或白藜芦醇对在大肠杆菌op50上生长的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物进行处理，并在20℃下50小时后进行筛选。与空白对照处理(mock
‑
treated)的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物相比，用抗氧化剂处理的动物中的pgp
‑
5p::gfp诱导没有显著差异(图14a)。第三，测试了商业上可获得的类胡萝卜素在秀丽隐杆线虫翻译缺陷突变体中阻抑pgp
‑
5p::gfp诱导的能力。用β
‑
胡萝卜素或虾青素对在大肠杆菌op50上生长的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物进行处理，并在20℃下50小时后进行筛选。与空白对照处理的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物相比，以此类抗氧化剂喂养的动物中的pgp
‑
5p::gfp诱导没有显著差异(图14b)。最后，用表达玉米黄质、链孢红素、紫黄质、δ
‑
胡萝卜素或α
‑
胡萝卜素的大肠杆菌对eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物进行喂养，并对gfp诱导进行筛选。与空白对照处理的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物相比，用表达类胡萝卜素的大肠杆菌喂养的动物中的pgp
‑
5p::gfp诱导没有显著差异(图14c)。这些类胡萝卜素都不是c50类的类胡萝卜素。
[0278]
嗜根考克氏菌还阻抑对翻译抑制药物的解毒应答。潮霉素是细菌产生的抗生素(来自吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus))，其抑制翻译并诱导秀丽隐杆线虫中的
异型生物质解毒。虽然10μg/ml的潮霉素在喂食大肠杆菌op50的动物中诱导了pgp
‑
5p::gfp表达，但喂食嗜根考克氏菌和10μg/ml的潮霉素的动物未能诱导pgp
‑
5p::gfp(图3a；图14d)。然而，在高浓度的潮霉素下，在喂食大肠杆菌op50和嗜根考克氏菌的动物中pgp
‑
5p::gfp均会被诱导(图14d)。相比之下，用嗜根考克氏菌crti(e10)或crteb(e17)喂养的pgp
‑
5p::gfp动物不影响响应于潮霉素处理的gfp诱导(图3a)。用通过与核糖体的40s亚基结合来阻断蛋白质合成的依米丁获得了类似的结果。6.25μg/ml的依米丁在喂食大肠杆菌op50的动物中诱导pgp
‑
5p::gfp表达(图15a&图15b)；然而，喂食嗜根考克氏菌和6.25μg/ml的依米丁的动物未能诱导pgp
‑
5p::gfp。然而，在高浓度的依米丁下，在喂食大肠杆菌op50和嗜根考克氏菌的动物中pgp
‑
5p::gfp均会被诱导(图15a)。相比之下，喂食嗜根考克氏菌crti(e10)或crteb(e17)的pgp
‑
5p::gfp动物不影响响应于依米丁处理的gfp诱导(图15b)。响应于顺铂诱导的基因毒性应激，pgp
‑
5p::gfp被激活，这干扰了dna复制。虽然1mm顺铂在喂食大肠杆菌op50的动物中诱导了pgp
‑
5p::gfp表达，但喂食嗜根考克氏菌和1mm顺铂的动物未能诱导pgp
‑
5p::gfp(图15c)。相比之下，喂食嗜根考克氏菌crti(e10)、crteb(e17)或crtye(e22)的pgp
‑
5p::gfp动物不影响响应于顺铂处理的gfp诱导(图15c)。
[0279]
由于嗜根考克氏菌的类胡萝卜素阻抑了通过翻译缺陷进行的秀丽隐杆线虫的异型生物质解毒基因的诱导，因此评估了嗜根考克氏菌的类胡萝卜素增加秀丽隐杆线虫对翻译抑制剂敏感性的能力。虽然喂食大肠杆菌op50和10μg/ml潮霉素的野生型动物的>80％在四天内达到成年，但喂食大肠杆菌op50和10μg/ml潮霉素以及嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物的动物的<10％在四天内达到成年(图3b；图15d)。在不存在潮霉素的情况下，类胡萝卜素本身对蠕虫没有毒性(图3b；图15d)。用依米丁获得了类似的结果：与用对照提取物喂养的动物相比，用嗜根考克氏菌提取物处理的动物对依米丁高度敏感(图3c)。此外，与用对照提取物喂养的动物相比，用嗜根考克氏菌提取物处理的动物对顺铂高度敏感(图3d)。异型生物质高度敏感性表型不太可能是普遍现象，因为嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物不会改变动物对抗霉素(线粒体毒物)的敏感性(图15e)。
[0280]
当动物暴露于异型生物质或必需基因失活时，诱导秀丽隐杆线虫的厌食行为(melo和ruvkun，2012)。使动物暴露于潮霉素(核糖体翻译抑制剂)或顺铂(dna复制抑制剂)引起强烈的厌食。虽然暴露于25μg/ml潮霉素的动物的约40％表现出厌食行为，但暴露于25μg/ml潮霉素和嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物的动物的约15％显示出厌恶(图3e)。用顺铂获得了类似的结果：暴露于1mm顺铂的动物的约50％表现出厌恶行为，而暴露于1mm顺铂和嗜根考克氏菌的类胡萝卜素提取物的动物的<20％表现出厌食(图3f)。
[0281]
实施例2.嗜根考克氏菌抑制翻译监控的秀丽隐杆线虫途径分析
[0282]
为了评估嗜根考克氏菌的类胡萝卜素如何抑制异型生物质解毒应答途径的诱导，用一系列秀丽隐杆线虫突变进行了遗传上位分析，这些突变破坏或激活在各个步骤用于翻译监控的信号转导途径(govindan等，2015)。zip
‑
2/bzip转录因子是响应于翻译抑制的pgp
‑
5p::gfp表达诱导所需要的，并代表了转录诱导中的最后一步(govindan等，2015)。即使在不存在翻译抑制的情况下，zip
‑
2::mcherry在肠道特异性启动子下的过度表达足以在野生型秀丽隐杆线虫中诱导pgp
‑
5p::gfp表达(图4a)。在zip
‑
2::mcherry过表达菌株中测试了喂食嗜根考克氏菌是否影响pgp
‑
5p::gfp诱导。pgp
‑
5p::gfp诱导在用大肠杆菌op50和嗜根考克氏菌喂养的动物中是相似的(图4a)，这表明嗜根考克氏菌的类胡萝卜素破坏了
zip
‑
2bzip转录因子上游(或平行途径)的监控途径组分。
[0283]
通过翻译抑制来诱导秀丽隐杆线虫异型生物质解毒基因依赖于胆汁酸信号传导途径(govindan等，2015)。具有胆汁酸生物合成遗传缺陷的秀丽隐杆线虫未能激活pgp
‑
5p::gfp(其响应于eft
‑
3(q145)、翻译组分的rnai或翻译的g418药物抑制)，但哺乳动物胆汁酸可以使该信号重新活跃(govindan等，2015)。虽然喂食嗜根考克氏菌抑制eft
‑
3(q145)动物中的pgp
‑
5p::gfp诱导，但即使在野生型嗜根考克氏菌存在的情况下，添加外源哺乳动物胆汁酸也会重新激活gfp表达(图4b&图4c)。因此，嗜根考克氏菌的类胡萝卜素在该秀丽隐杆线虫翻译监控和应答途径的上游或在胆汁酸信号传导步骤中起作用。
[0284]
为了确定嗜根考克氏菌的类胡萝卜素可能通过其来调节胆汁酸信号传导途径的机制途径，我们对介导类胡萝卜素结合或转运的真核基因的秀丽隐杆线虫同源物进行了cherry
‑
挑选的rnai筛选(表1)。在这一筛选中，我们用大肠杆菌对eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物进行喂养，所述大肠杆菌表达用于类胡萝卜素结合或转运蛋白的秀丽隐杆线虫同源物的dsrna。当这些动物达到成年后，将它们转移到嗜根考克氏菌接种板中，并在24小时后对gfp诱导进行评分。在用dsrna阴性对照喂食并转移到嗜根考克氏菌板的动物中，pgp
‑
5p::gfp表达被破坏。在以23种其它dsrna喂养的动物中也发现了类似的pgp
‑
5p::gfp表达降低(表1)。然而，我们发现在用lbp
‑
5dsrna喂养的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中，pgp
‑
5p::gfp表达没有受到阻抑(图4d)。lbp
‑
5编码细胞内脂肪酸结合蛋白，该蛋白预期作为疏水分子(如脂质和类固醇激素)的转运蛋白起作用(xu等，2014)。
[0285]
表1针对响应于嗜根考克氏菌的eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的gfp表达的阻抑所测试的已知的类胡萝卜素结合蛋白基因
[0286]
[0287][0288]
，gfp开；
‑
，gfp关
[0289]
此外，为了鉴别嗜根考克氏菌的类胡萝卜素的真核细胞靶标，使用大鼠肝脏细胞提取物进行了牵出测定。选择肝脏来鉴别类胡萝卜素结合蛋白有以下几个原因：首先，肝脏是异型生物质解毒的主要部位。其次，肝脏是胆汁酸生物合成的部位。第三，肝脏具有已知的类胡萝卜素转运系统。第四，可以很容易地获得大量组织，这在秀丽隐杆线虫中是不可行的。为了鉴别类胡萝卜素结合蛋白，将来自大鼠肝脏的蛋白提取物与嗜根考克氏菌的类胡萝卜素一起孵育，并使用尺寸排阻色谱法去除未结合的类胡萝卜素。使结合类胡萝卜素的蛋白提取物经受阴离子交换色谱，并洗脱蛋白质部分。将黄色部分(表明存在类胡萝卜素)合并、浓缩和脱盐。浓缩峰的颜色为橙黄色，表明在天然page上分析了类胡萝卜素的存在，切下可见的橙黄色条带，并进行质谱以鉴别蛋白质。通过质谱分析鉴别了48种蛋白质(表2)。有趣的是，所鉴别的蛋白质之一是fabp1(脂肪酸结合蛋白1)，它是秀丽隐杆线虫lbp
‑
5的同源物。通过质谱鉴别的蛋白质之中为pak2(p21蛋白激酶)，它是秀丽隐杆线虫pak
‑
1的同源物，我们先前将其鉴别为响应于翻译抑制的pgp
‑
5p::gfp诱导所需的全基因组rnai筛选中的命中(govindan等，2015)。为了确定eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp中的pgp
‑
5p::gfp诱导是否需要这48种蛋白质中的任何一种，进行了这些大鼠蛋白质的秀丽隐杆线虫同源物的rnai筛选。用大肠杆菌喂养eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物，所述大肠杆菌表达用于各个类胡萝卜素结合蛋白的秀丽隐杆线虫同源物的dsrna。当这些动物达到成年时，对它们进行筛选以确定它们是否破坏了gfp诱导。在该筛选中，除了pak
‑
1rnai之外，大多数类胡萝卜素结合蛋白的rnai并未阻断eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的pgp
‑
5p::gfp诱导(表2)。有趣的是，已鉴别的类胡萝卜素结合蛋白之一是amacr(α
‑
甲基酰基
‑
辅酶a消旋酶)，它是胆汁酸生物合成所需要的(autio等，2014)。在秀丽隐杆线虫中，c24a3.4和zk892.4是amacr的同源物(图16a)。虽然c24a3.4或zk892.4的rnai单独并未阻抑eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的pgp
‑
5p::gfp诱导，但c24a3.4和zk892.4的双重rnai阻抑了pgp
‑
5p::gfp诱导(图16b)。
[0290]
为了确定嗜根考克氏菌的类胡萝卜素诱导的对pgp
‑
5p::gfp诱导的阻抑是否需要
这48种秀丽隐杆线虫蛋白质中的任何一种，对这些蛋白质的秀丽隐杆线虫同源物进行了rnai筛选。当这些动物达到成年后，将它们转移到嗜根考克氏菌接种板中，并在24小时后对gfp诱导进行评分。在喂食dsrna阴性对照并转移到嗜根考克氏菌板的动物中，pgp
‑
5p::gfp表达被破坏(表2)。在所喂养的动物中，在大多数dsrna动物中发现pgp
‑
5p::gfp表达的类似降低(表2)；然而，在用chc
‑
1或fcho
‑
1或lbp
‑
5rnai处理的动物中，pgp
‑
5p::gfp诱导并未被破坏(图4d)。chc
‑
1编码秀丽隐杆线虫网格蛋白重链直系同源物，而fcho
‑
1编码仅含f
‑
bar结构域的fer/cip4同源结构域(fcho)家族蛋白的秀丽隐杆线虫同源物。chc
‑
1和fcho
‑
1均介导内吞运输(grant等，2006)。可替代的模型是，即使在不存在核糖体应激的情况下，chc
‑
1或fcho
‑
1或lbp
‑
5rnai本身可能会诱导pgp
‑
5p::gfp表达；然而，这些基因的rnai不诱导pgp
‑
5p::gfp表达(图16c)。
[0291]
不希望受到理论的束缚，基于这些发现，提出了嗜根考克氏菌的类胡萝卜素如何抑制异型生物质解毒应答的模型(图4e)。从嗜根考克氏菌释放的类胡萝卜素通过网格蛋白介导的内吞作用进入秀丽隐杆线虫肠道。在肠道细胞质内，从内吞小泡释放的类胡萝卜素随后被lbp
‑
5结合并被递送到过氧化物酶体，在其中类胡萝卜素通过与amacr结合来抑制胆汁酸的生物合成。此外，类胡萝卜素还抑制pak
‑
1以破坏异型生物质诱导的解毒应答的上调。
[0292]
表2质谱鉴别的蛋白质的列表、以及它们的秀丽隐杆线虫同源物的rnai响应于嗜根考克氏菌对阻抑eft
‑
3(q145)；pgp
‑
5p::gfp动物中的gfp表达的影响
[0293]
[0294]
[0295]
[0296][0297]
，gfp开；
‑
，gfp关；无条目＝未测试
[0298]
实施例的参考文献
[0299]
giuffrida，d.et al.characterisation ofthe c50 carotenoids produced by strains of the cheese
‑
ripening bacterium arthrobacter arilaitensis.international dairy journal 55，10
‑
16(2016).
[0300]
pilbrow，j.，sabherwal，m.，garama，d.&carne，a.a novel fatty acid
‑
binding protein
‑
like carotenoid
‑
binding protein from the gonad of the new zealand sea urchin evechinus chloroticus.plos one 9，e106465(2014).
[0301]
monteiro
‑
vitorello，c.b.et al.the genome sequence or the gram
‑
positive sugarcane pathogen leifsonia xyli subsp.xyli.mol.plant microbe interact.17，827
‑
836(2004).
[0302]
morohoshi，t.，wang，w.
‑
z.，someya，n.&ikeda，t.genome sequence of microbacterium testaceum stlb037，an n
‑
acylhomoserine lactone
‑
degrading bacterium isolated from potato leaves.jbacteriol 193，2072
‑
2073(2011).christopherson，m.r.et al.the genome sequences of cellulomonas fimi and
ꢀ″
cellvibrio gilvus
″
reveal the cellulolytic strategies of two facultative anaerobes，transfer of
‘
cellvibrio gilvus’to the genus cellulomonas，and proposal of cellulomonas gilvus sp.nov.plos one 8，e53954(2013).
[0303]
ivanova，n.et al.complete genome sequence of sanguibacter keddieii type strain(st
‑
74).stand genomic sci 1，110
‑
118(2009).
[0304]
pukall，r.et al.complete genome sequence ofjonesia denitrificans type strain(prevot 55134).stand genomic sci 1，262
‑
269(2009).
[0305]
monnet，c.et al.the arthrobacter arilaitensis re1 17 genome sequence reveals its genetic adaptation to the surface of cheese.plos one 5，e15489(2010).
[0306]
kalinowski，j.et al.the complete corynebacterium glutamicum atcc 13032genome sequence and its impact on the production of l
‑
aspartate
‑
derived amino acids and vitamins.j.biotechnol.104，5
‑
25(2003).
[0307]
nishio，y.et al.comparative complete genome sequence analysis of the amino acid replacements responsible forthe thermostability of corynebagterium efficiens.genome res.13，1572
‑
1579(2003).
[0308]
sims，d.et al.complete genome sequence of kytococcus sedentarius type strain(541).stand genomic sci 1，12
‑
20(2009).
[0309]
land，m.et al.complete genome sequence of beutenbergia cavernae type strain (hki 0122).stand genomic sci 1，21
‑
28(2009).
[0310]
lapidus，a.et al.complete genome sequence of brachybacterium faecium type strain(schefferle 6
‑
10).stand genomic sci1，3
‑
11(2009).
[0311]
abt，b.et al.complete genome sequence of cellulomonas flavigena type strain(134).stand genomic sci 3，15
‑
25(2010).
[0312]
liaaen
‑
jensen，s.，hertzberg，s.，weeks，o.b.&schwieter，u.bacterial carotenoids xxvii.c50
‑
carotenoids.3.structure determination of dehydrogenans
‑
p439.acta chem scand 22，1171
‑
1186(1968).
[0313]
fukuoka，s.，ajiki，y.，ohga，t.，kawanami，y.&izumori，k.production of dihydroxy c50
‑
carotenoid by aureobacterium sp.ferm p
‑
18698.biosci.biotechnol.biochem.68，2646
‑
2648(2004).
[0314]
arpin，n.，fiasson，j.l.，s.，borch，g&liaaen
‑
jensen，s.bacterial carotenoids，xlvi.c50
‑
carotenoids，14.c50
‑
carotenoids from arthrobacter glacialis.acta chem.scand.，b，org.chem.biochem.29，921
‑
926(1975).
[0315]
sutthiwong，n.&dufoss
é
，l.production of carotenoids by arthrobacter arilaitensis strains isolated from smear
‑
ripened cheeses.fems microbiol.lett.360，174
‑
181(2014).
[0316]
weeks，o.b.，montes，a.r.&andrewes，a.g.structure of the principal carotenoid pigment of cellulomonas biazotea.j bacteriol 141，1272
‑
1278(1980).
[0317]
krubasik，p.et al.detailed biosynthetic pathway to decaprenoxanthin diglucoside in corynebacterium glutamicum and identification of novel intermediates.arch.microbiol.176，217
‑
223(2001).
[0318]
melo，j.a.&ruvkun，g.inactivation of conserved c.elegans genes engages pathogeh
‑
and xenobiotic
‑
associated defenses.cell 149，452
‑
466(2012).
[0319]
dunbar，t.l.t.，yan，z.z.，balla，k.m.k.，smelkinson，m.g.m.&troemel，e.r.e.c.elegans detects pathogen
‑
induced translational inhibition to activate immune signaling.cell host microbe 11，375
‑
386(2012).
activates genes encoding mitochondrial chaperones.j.cell.sci.117，4055
‑
4066(2004).
[0335]
calfon，m.et al.ire1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the xbp
‑
1 mrna.nature 415，92
‑
96(2002).
[0336]
o
′
rourke，d.，baban，d.，demidova，m.，mott，r.&hodgkin，j.genomic clusters，putative pathogen recognition molecules，and antimicrobial genes are induced by infection of c.elegans with m.nematophilum.genome res.16，1005
‑
1016(2006).
[0337]
troemel，e.r.et al.p38 mapk regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in c.elegans.plos genet 2，e183(2006).
[0338]
bolz，d.d.，tenor，j.l.&aballay，a.a conserved pmk
‑
1/p38 mapk is required in caenorhabditis elegans tissue
‑
specific immune response to yersinia pestis infection.j biol chem 285，10832
‑
10840(2010).
[0339]
edge，r.，mcgarvey，d.j.&truscott，t.g.the carotenoids as anti
‑
oxidants
‑‑
a review.j.photochem.photobiol.b，biol.41，189
‑
200(1997).
[0340]
xu，m.，choi，e.
‑
y.&paik，y.
‑
k.mutation ofthe lbp
‑
5 gene alters metabolic output in caenorhabditis elegans.bmb rep 47，15
‑
20(2014).
[0341]
autio，k.j.et al.role of amacr(α
‑
methylacyl
‑
coa racemase)and mfe
‑
1(peroxisomal multifunctional enzyme
‑
1)in bile acid synthesis in mice.biochem j461，125
‑
135(2014).
[0342]
grant，b.d.&sato，m.intracellular trafficking.wormbook 1
‑
9(2006).
[0343]
doi：10.1895/wormbook.1.77.1
[0344]
其它实施方式
[0345]
将理解的是，虽然已经结合其详细描述对本发明的实施方式进行了描述，但前述描述旨在进行说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围定义。其它方面、优点和修改在后文权利要求的范围内。